親和性超音波ろ過と実験的検証を用いた Coptis chinensis からのAChE標的抗脳性麻痺成分の同定

サマリー

本研究の目的は、 コプティス・チネンシス の主要な活性成分を特定し、親和性超音波検査および実験的検証を用いて脳性麻痺(CP)介入におけるその作用を明らかにすることでした。

要約

本研究の目的は、 Coptis chinensis の主要な活性成分を特定し、親和性超音波ろ過による脳性麻痺(CP)介入におけるその作用機序を明らかにすることでした。アセチルコリンエステラーゼ(AChE)を標的に用い、C. chinensis 抽出物から最も強い結合能力を持つ成分としてコプティシンをスクリーニングし、結合率21.9%とin vitro 阻害活性(IC₅₀ = 3.24 μg/mL)を示しました。分子ドッキングおよび分子動力学シミュレーションにより、コプティシンはAChEの活性ポケットに安定的に結合できることが示されました。その後、新生児ラットモデルを用いた低酸素虚血性脳損傷(HIBD)に関する検証実験が実施されました。結果は、コプティシン(10 mg/kg)による介入がモデル動物の空間学習および記憶障害を有意に改善し、損傷した半球の脳血流を増加させ、脳組織の病理的損傷を緩和し、脳内のAChEの異常な活性化を抑制したことを示しました。まとめると、本研究は親和性超音波ろ過技術を組み合わせ、 C. chinensis抽出物から同定されたコプティシンがAChEを阻害し、神経保護効果や脳血流改善効果を発揮できることを確認しました。これはC . chinensis がCP様神経障害を緩和するための主要な物質的基盤となり、関連薬剤開発のための候補分子や科学的証拠を提供します。

概要

脳性麻痺(CP)は、胎児や乳児の発達中の脳が進行性でない損傷によって引き起こされる恒久的な症候群で、主に運動機能障害や姿勢異常を特徴とします。現在、CPに対する複数の臨床治療法が利用可能ですが、副作用を最小限に抑えつつ神経学的欠損を根本的に修復できる理想的な薬剤は依然として不足しています。通常は単一標的に作用し、比較的高い毒性を持つ化学合成薬とは異なり、伝統的中国医学(TCM)は多成分・多標的・ホリスティックな調整の利点と長期臨床で示された良好な安全性プロファイルにより、複雑な脳疾患の治療における新たな知見と薬剤候補の貯蔵庫を提供します^{。2、3、4、5、6}。したがって、TCMから高効果かつ低毒性の化学成分を探求することは、科学的意義と^{臨床的価値}を有する7。

脳性麻痺の複雑な病理的メカニズムの中で、コリン作動性神経系機能障害は^{重要な役割を果たします8,9}。アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経伝達物質であるアセチルコリン(ACh)を加水分解する重要な酵素です。この酵素の過剰な活性はACの枯渇を引き起こし、コリン作動性信号伝達を妨げ、その結果、運動制御や認知機能障害を悪化させます。したがって、AChEは神経保護剤の開発において重要かつ確立された薬剤標的として浮上しています。AChE活性を抑制してシナプス裂のAChレベルを上昇させることは、CP関連神経学的欠損を改善する効果的な戦略の一つとして認識されています。低酸素虚血性脳損傷の文脈では、コリン作動性神経伝達の障害が神経機能障害をさらに悪化させ、CPに関連する運動および認知障害に寄与する可能性があります。したがって、AChEは古典的な神経機能的標的としてだけでなく、抗CP効果を持つ生物活性化合物のスクリーニングにおける機構的に関連性の高い入口としても本研究で選ばれました。

現代の研究では、薬用植物には幅広い薬理活性値があることが示されています。熱を浄化し湿気を乾燥させる古典的な中国医学である コプティス・チネンシス は、さまざまなイソキノリンアルカロイドに豊富に含まれる複雑なシステムで構成されています。よく知られたベルベリンに加え、コプティシン、エピベルベリン、パルマチン、ジャトロリジン¹⁰など、類似した構造と多様な薬理活性を持つ成分群も含んでいます。これらのアルカロイドは、 C. chinensisの薬理学的効果の物質的基盤を形成します。これまでの研究では、 C. chinensis およびそのアルカロイドが抗炎症、抗酸化、そして潜在的な神経保護特性を持つことが示されています。しかし、このような複雑な成分系を用いるため、従来の研究方法はAChEを直接標的にする主要な活性成分を迅速かつ正確に特定することが難しく、C. chinensisが脳損傷に与える影響のメカニズムの詳細な解明を大きく制限しています¹¹。

従来の活性誘導型分離法は、繰り返しの分画、バイオ活性試験、精製を必要とし、低存在比でも高親和性化合物の損失や無視につながる可能性がありますが、親和性超ろ過法は複雑な混合物から直接標的結合配位子を迅速にスクリーニングすることを可能にします。この技術により、TCMの多成分原油抽出物から特定の標的(例:AChE)に結合する有効配位子を効率的かつ迅速に「フィッシング」することが可能になります。特にC. chinensisのような複数のアルカロイド成分を持つシステムに適しており、複雑な混合物から標的に直接相互作用する有効成分を正確に同定すること^{を可能にします。}分子ドッキングや分子動力学シミュレーションなどの計算手法と組み合わせることで、結合モード、相互作用タイプ、原子レベルでの成分とターゲットタンパク質間の複雑な安定性を直感的に予測でき、実験スクリーニングの結果に対する堅牢な理論的証拠と機構的説明^{を提供します。}

上記の背景に基づき、本研究は以下の科学的仮説を提唱します。C . chinensisに含まれるさまざまなアルカロイドの中に、AChEを特異的に阻害する活性成分が存在し、これらの成分がその潜在的な抗脳性麻痺効果の物質的基盤となっています。この仮説を検証するために、現代のスクリーニング技術と薬理学的検証手法を統合しました。まず、AChEを標的に用い、親和性超ろ過技術を用いてC. chinensisのマルチアルカロイド抽出物から潜在的阻害剤を迅速にスクリーニングしました。さらに、分子ドッキングや分子動力学シミュレーションを用いて原子レベルでの結合機構を明らかにしました。最後に、スクリーニング成分がCPラットの行動、脳組織病理、AChE活性に対する改善効果を検証するために 生体内 動物実験を実施しました。

プロトコル

すべての動物福祉および実験手順は、尊義第一人民病院の実験動物福祉倫理委員会(倫理番号2025-2-362)によって承認されました。モデリングおよび治療期間中、動物の体の状態と生存率は毎日記録されました。

C. chinensis抽出物の調製
本研究では、C . chinensis の医薬品材料からn-ブタノール分画を加速抽出するために加速溶媒抽出器を用いました。C . chinensis の乾燥粉末1gを正確に計量し、それぞれ40mLの抽出セルに投入しました。金属ガスケットとガラス繊維フィルター膜が抽出セルの上下に順番に配置され、試料をろ過し、試料は石英砂で包まれました。抽出過程では、温度と圧力がそれぞれ90°Cと100barに設定されました。加速抽出物を回収し、抽出溶媒を回転蒸発器で乾燥させて異なる極性分率の乾燥抽出物を得ました。メタノール:水(50:50、v/v)が再構成溶媒として選ばれました。抽出物は0.45μmの微細孔膜を通してろ過され、4°Cで保存されました。 サンプル検出前に、AChE上の空格再構成溶媒の阻害活性が調査されました。その結果、その抑制効果は無視できることが示され、この実験で再構成溶媒の選択が実験結果に影響を与えないことを示しました。

アセチルコリンエステラーゼ阻害アッセイ
実験は96ウェルプレートで行われました。まずPBSを追加し、その後AChE(0.1 U/mL)と C. chinensis のサンプルを順次投与しました。37°Cで10分間潜伏した後、5.5′-ジチオビス(2-ニトロベンゾ酸)(DTNB)染色溶液(2.5 mmol/mL)とATChI基質(10 mmol/mL)を加えました。混合物は37°Cでさらに10分間培養され、反応は1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)60μLを加えて終了しました。吸収率は405nmで測定されました。各 C. chinensis サンプルは4つのグループで設定されました:対照群a:PBS(120μL)、AChE溶液(20μL)、DTNB溶液(40μL)、ATChI溶液(40μL)、SDS溶液(60μL)が順次追加されました。ブランクコントロール群b:PBS(120μL)、DTNB溶液(40μL)、ATChI溶液(40μL)、SDS溶液(80μL);サンプル群c:PBS(80μL)、 C. chinensis 抽出物(20μL)、AChE溶液(20μL)、DTNB溶液(40μL)、ATChI溶液(40μL)、SDS溶液(60μL);サンプルの空白グループd:PBS(100μL)、 C. chinensis 抽出物(20μL)、DTNB溶液(40μL)、ATChI溶液(40μL)、SDS溶液(60μL)。陽性対照としてフペルジンAが使用され、初期濃度は約2.5 mg/mLでした。n-ブタノール抽出物の初期濃度は約1 mg/mLでした。フペルジンAとサンプルは60%の勾配で希釈されました。阻害率は以下の式で計算されました:阻害率(%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%。ここでa、b、c、dはそれぞれ対照群a、白対照群b、標本群c、標本b群dの吸収度値を表します。

各検査濃度での阻害率は上記の式で計算されました。その後、抑制率を化合物濃度の対数にプロットすることで、濃度抑制曲線を構築しました。IC20、IC50、IC80の値は、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰フィッティングで、フィットした濃度-応答曲線に基づいて計算され、AChE活性の20%、50%、80%の抑制を生み出すために必要な濃度として定義されました。

親和性超ろ過アッセイ
C . chinensis 抽出物からAChE結合化合物をスクリーニングするために親和性超ろ過法を実施しました。簡単に言うと、活性酵素としてAChE溶液(PBS中の0.1 U/mL、pH 7.4)が使用されました。不活化酵素制御は、同じAChE溶液を沸騰した湯で10分間加熱することで調製されました。各反応ごとに、C . chinensis 抽出液200μLと活性または不活化AChE溶液200μLを混合し、37°Cで30分間培養しました。インキュベーション後、混合物は30 kDaの超ろ過遠心分離機管に移され、12,000× g で4°Cで10分間遠心分離されました。 保持された酵素-リガンド複合体は、同じ遠心分離条件下で200μLのPBSで3回洗浄され、結合していない成分を除去しました。その後、AChEに結合した配位子を解離・洗脱するために200μLの90%メタノールを加え、10分間のインキュベーション、12,000 × g で10分間遠心分離しました。洗出液は収集され、高パフォーマンス液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析されました。活性酵素基に富む化合物は、不活化酵素制御に対して潜在的なAChE結合成分と考えられました¹⁴。

主要アルカロイド代謝物のHPLC解析
クロマトグラフィー解析は、四級ポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、紫外線可視光(UV-Vis)検出器を備えたHPLCシステムを用いて実施されました。分離はC18クロマトグラフィーカラム(250× 4.6 mm、5 μm)を25°Cで維持して達成されました。 移動相はアセトニトリル(A)と0.7%アンモニアおよび0.25%トリエチルアミン(B)を含む30 mmol/Lの重炭酸アンモニウム溶液で構成され、流量1.0 mL/minで供給されました。勾配洗脱プログラムは以下の通りです:0–15分、90%–75% B;15〜25分、75%〜70%B;25〜50分、70%〜55%B。注入容量は5μLで、紫外線検出は270nmで行われました。

C. chinensisの主要アルカロイドの定量分析のために、各サンプル(0.02g)を正確に計量し、10 mLの塩酸・メタノール溶液(1:100, v/v)で超音波抽出を30分間行いました。ろ過後、重量損失は元の重量に同じ抽出溶媒で補償され、最終溶液はHPLC分析前に0.45μmの膜でろ過されました。マグノフロリン、グラウシン、ジャトロリジン、コロンバミン、エピベルベリン、コプティシン、パルマチン、ベルベリンなど、8つの本物の基準が同じクロマトグラフィー条件下で分析されました。これらの分析対象に対して参照溶液を用いて校正曲線を構築しました。8種類のアルカロイドの存在比と検出応答が大きく異なっていたため、各分析対象の校正範囲は文献報告や予備実験に基づいて個別に最適化され、すべての化合物に同じフォールド希釈方式を適用するのではありませんでした。したがって、線形レンジの高濃度・低濃度比は8種類の分析対象物間で同一であるとは期待されていませんでした。検出限界(LOD)と定量限界(LOQ)は、それぞれ約3と10の信号対雑音比で推定されました。

親和性超濾過の洗出解析には、超音波ろ過後にAChEから解離した配位子を繰り返し実験から採取し、HPLC解析前に濃縮して検出に必要な十分なシグナル強度を確保しました。濃縮された洗出液は、上記の同じHPLC条件で分析されました。洗出液のクロマトグラフィーピークは、8つの本物の基準標準と同一の分析条件下で得られた C. chinensis 抽出物のクロマトグラフィープロファイルとの標的比較によって割り当てられました。したがって、本解析は未知化合物の新規構造解明を目的としたものではなく、 C. chinensis の既知の主要アルカロイドが活性酵素解出液に富集しているかどうかを標的的に特定することを目的としました。

分子ドッキングアッセイ
本研究では、コプティシンにドッキング解析が焦点を当てました。なぜなら、親和性超音波ろ過法でAChE結合成分のトップランクであり、主要アルカロイドの中でも最も強いin vitro阻害活性を示したからです。タンパク質結晶はタンパク質データバンク(PDB)から取得されました。共結晶化配位子を持つタンパク質結晶が最終ドッキング受容体として選ばれ、すべての標的タンパク質結晶はヒト由来でした。受容体ファイルはPyMOLソフトウェアで開かれ、受容体とリガンドのファイルは分離されて保存されました。受容体はMGLToolsソフトウェアで開封され、その後水分子を除去し、水素原子と電荷を加え、非極性水素原子を結合し、局所的な原子電荷を計算するなどを行い、pdbqt形式で保存されました。リガンドファイルはMGLToolsソフトウェアで開かれ、水素原子と電荷が追加され、pdbqtフォーマットファイルとして保存されました。グリッドボックスを開け、間隔を1.000に設定し、グリッドポイントの数を設定し、ボックスの中心点座標を共結晶リガンドに従って選択し、GPFファイル^15,16として保存しました。

化学成分構造は最初にSciFinderデータベースから収集され、cdx形式で保存されました。各分子の三次元構造はChemBio3D Ultraモジュールで表示され、MM2フォースフィールドでエネルギー最適化が行われ、mol2形式で保存され、電荷パラメータは除去されました。AutoDockを用いて、MGLToolsソフトウェアでmol2フォーマットファイルを開き、水素原子と電荷をリガンドに追加し、回転可能な化学結合を観察し、pdbqtフォーマットファイルとして保存しました。AutoDock Vina(バージョン1.2.5)モデルを用いて分子ドッキング評価を行いました。

分子動力学シミュレーションアッセイ
リガンド構造最適化にはGaussian 16およびGaussView 6ソフトウェアが使用されました。リガンド構造のmol2ファイルをGaussView 6にインポートした後、タスクタイプは最適化に設定され、ターゲット分子の状態は基底状態として選択され、計算方法は密度汎関数理論(DFT)、スピン多重度はデフォルトスピン、使用された汎関数はB3LYP、溶媒モデルはIEFPCMでした。 溶媒は水でした。分子構造最適化が完了した後、ガウス16号を使って生成されたchkファイルをfchファイルに変換し、それをMultiwfnソフトウェアにインポートして配位体のRESP電荷を計算しました。

RESP電荷の計算後、生成されたchgファイルはsobtop_1.0(dev5)ソフトウェアにインポートされ、分子動力学シミュレーションに必要なリガンドトポロジーファイルを生成しました。分子動力学シミュレーションは、AMBER99力場を用いたGROMACS 2019.6ソフトウェアを使用して実施されました。タンパク質分子および小分子の構造ファイルがソフトウェアにインポートされ、周期境界1.0 nmの三斜晶ボックスが確立され、TIP3P水モデルが充填に使用されました。粒子メッシュ・エワルト法(PME)を用いて長距離静電相互作用を計算し、gmx geionコマンドを用いて適切な数のナトリウムイオンと塩化イオンを導入し、系全体の電荷を中和しました。シミュレーションは一定温度298 K、標準大気圧100 kPaで実施されました。エネルギー最小化のために、最も急な降下法(急降下法)が実装されました。gmx gromppおよびgmx mdrunコマンドは、NVT(等温・等容集合)平衡およびNPT(等温・等圧アンサンブル)平衡を10,000ステップ実行するために用いられ、温度結合定数はそれぞれ0.1 psと圧力結合定数を0.5 psに設定し、平衡シミュレーションの持続時間は100 psでした。システムが平衡状態に達した後、タイムステップは2 fsに設定され、複体に対して10 nsの分子動力学シミュレーションが行われ、軌跡データは2 psごとに保存されました。10ナノ秒の生産ランは、包括的な立体構造サンプリングではなく、ドッキングされたコプティシン–AChE複合体の短時間スケールの動的評価を提供するための探索的シミュレーション長として選ばれました。この設定は、ドッキングした複合体が時間経過とともに比較的安定した結合モードを維持できるかどうかを評価するために用いられました。さらに、gmx rms、gmx rmsf、gmx gyrate、gmx hbondsコマンドを用いて、平均二乗根偏差(RMSD)、平均二乗根ゆらぎ(RMSF)、タンパク質の回転半径、水素結合、溶媒でアクセス可能な表面積を計算しました。QTgraceは結果の可視化に使用されました。

動物実験の検証
出生後7日目の健康な新生児スプラグ・ドーリー(SD)ラットの子18頭を、いずれの性別とも選定しました。すべての実験動物は特定の病原体フリー(SPF)動物実験施設に収容されました。この施設には厳格なバリアシステムが備えられており、微生物や寄生虫の侵入を効果的に防ぐことができました。居住室の環境パラメータは中央制御システムによって自動的に監視・調整されていました。温度は22±2°C、相対湿度は55%±10%、光サイクルは12時間の光、12時間の暗いサイクルでした。低酸素虚血性脳損傷(HIBD)の新生児ラットモデルを、クラシックなライス・ヴァンヌッチ法で修飾したものを用いて、脳性麻痺の病理学的および行動的特徴をシミュレートしました。

簡単に言うと、出生後7日目のラットの子は誘導時に2–3%のイソフルラン、維持時に1–2%の麻酔を投与しました。十分な麻酔の後、頸椎の正中切開を行い、左総頸動脈を慎重に隔離し、永久結紮しました。切開部は縫合され、子犬たちは温めパッドで1時間回復しました。その後、モデル群とコプティシン群の子は、8%のO₂と92%のN₂がバランスを取ったチャンバーで37°Cで2時間低酸素状態にさらされ、低酸素性虚血性脳損傷を誘発しました。偽手術された動物は、頸動脈結紮や低酸素治療なしで同じ麻酔と外科的曝露を受けました。低酸素状態の後、子犬たちは母親に戻され、実験期間中は毎日全体的な状態、生存率、摂食行動を監視しました。

実験ラットは無作為に3つのグループに分けられました:シャム群:左総頸動脈のみを切断し、結紮や低酸素治療なしに、術後に同量の溶媒を投与しました。モデル群:低酸素-虚血性脳損傷モデル手術を実施し、術後に同量の溶媒を投与した。コプティシン群:モデル化後、ガベージでコプティシン(10 mg/kg)を投与しました。コプティシンの用量(10 mg/kg)は、これまで報告された生体内/薬物動態学研究に基づき、体内用量として選択^{されました。}薬剤は1日1回、固定時間に14日間連続で投与されました。

動物指標の検出
モリス水迷路(MWM)試験装置は、直径約150cmの大きな円形水プールで構成され、プールの壁には明確な視覚的な手がかりが示されていました。プールの水は不透明な乳白色に層分けされ、水温は23±1°Cで制御されていました。 透明なプラットフォームが目標区画に設置され、水面下1〜2cmの水中に沈められました。訓練は1日4回行われ、動物たちはプールの壁に面した4つの異なる入り口から水に放り込まれ、動物が水中に入って隠されたプラットフォームを見つけて登るまでの時間、すなわち「脱出潜伏期」を記録しました。各訓練セッションは60秒に制限されていました。動物が60秒以内にプラットフォームを見つけた場合、記憶を固定するために15秒そのプラットフォームに留まることが許されました。見つからなければ、動物は優しくプラットフォームまで誘導され、15秒の間そのままにされることを許されました。7日間の訓練の後、隠されたプラットフォームは撤去されました。動物たちは元のプラットフォームの反対側の入口から水中に放り込まれ、60秒自由に泳ぐことが許され、動物の泳ぐ軌跡はビデオシステムで記録されました。MWM試験では、平均脱出遅延、目標象限での滞在時間、元のプラットフォーム位置を越えた通過回数などの指標が記録されました。

レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)検出の場合:麻酔後、ラットを立体分析器に固定し、頭蓋骨を露出させて湿らせたままにしました。レーザースペックル血流イメージングシステムを用いて、頭蓋骨の真上から30秒間連続的に生のスペックル画像を収集しました。専門的なソフトウェアを用いて、時空間的に変化するスペックルコントラストを脳血流灌流ユニット(PU)分布マップに変換しました。定量解析のために、各画像の露出された同側半球内で、病変に関連する皮質灌流領域および可視解剖学的ランドマークに基づいて手動で区分された皮質ROIを選択し、このROI内の平均灌流値をグループ間比較に用いました。

脳組織を採取し、重量と体積の比率に応じて予備冷却されたPBSを加えました。氷上で機械的均質化が行われ、その後8000 × g で4°Cで10〜15分間遠心分離し、上清液を採取して検査しました。脳組織は4%パラホルマルデヒドに迅速に投入され、組織形態を維持するために24時間以上固定されました。ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色は脱水、クリアリング、パラフィン埋め込みなどの操作を通じて行われ、脳損傷の程度は光学顕微鏡で観察されました。

AChE活動の測定のために、損傷した(同側)半球の大脳皮質を収集し、製造元の指示に従って均質化しました。組織サンプルは抽出バッファーで均質化され、8000 × g で4°Cで10分間遠心分離され、上清液を分析のために採取しました。AChE活性は市販のアセチルコリンエステラーゼ活性アッセイキット(マイクロプレート/比色法)を用いて決定されました。このアッセイは、AChEによるアセチルコリンの加水分解とDTNBとの反応による染色生成物の生成に基づいており、吸収率は412nmで測定され、酵素活性の計算に用いられました。このキットは従来の抗原定量酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットではなく酵素活性ベースの比色測定法であるため、製造元から標準的な検出範囲や分析感度は提供されていませんでした。本研究では、皮質組織におけるAChE活性値が約25〜80 nmol/min/mgの範囲内でした。

統計解析
すべての実験データは平均±標準偏差(SD)として表現され、GraphPadプリズムソフトウェアで解析されました。グループ間の比較は、一方移動分散分析(ANOVA)を用いて行われ、その後Tukeyの多重比較検定が行われました。モリス水迷路テストでは、最終的なトレーニング結果とプローブ試験パラメータを一方向ANOVAで解析し、その後Tukeyの多重比較検定を行いました。P<0.05の値は統計的に有意とみなされ、¹⁸。ROIにおける脳血流灌流と同側大脳皮質におけるAChE活性の相関関係をPearson相関解析を用いて解析しました。P < 0.05の値は統計的に有意とされました。

結果

C. chinensis抽出物中の化学成分の分析
アルカロイドは C. chinensis 薬用物質の主な蓄積成分であり、主要な有効成分でもあります。本研究では、クロマトグラフィー技術を用いて C. chinensis の主要な化学成分を分析しました(図1A)。 表1に示すように、8種類の分析対象すべてがそれぞれの校正範囲内で良好な線形性を示しました。これらのアルカロイドの内容物や検出器応答が大きく異なっていたため、各分析対象ごとに校正範囲が最適化されました。(図1B) 表1に示されているように、各化学成分の線形関係、線形範囲、その他のパラメータは良好であり、C . chinensisの化学成分の決定に同時に利用可能でした。

ディスカッション

現在、脳疾患の予防と治療のために様々な方法や技術が開発^{されています。}本研究では、in vitroスクリーニング、計算シミュレーション、in vivo検証の統合戦略を採用し、HIBDによる脳性麻痺様症状改善におけるC. chinensisの物質的基盤と多標的メカニズムを体系的に明らかにしました。核心的な発見は、C. chinensisにおける特徴的なアルカロイドであるコプティシンが、最も高い含有量を持つベルベリンではなく、AChEを強力に阻害し、神経保護および機能改善効果を発揮する主要な活性成分であるということです。この発見は、C. chinensisが中枢神経系のコリン作動標的に作用することで「熱を浄化し、火を浄化する」という従来の有効性に対する現代的な薬理学的注釈を提供するだけでなく、CPに対す...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	アセチルコリンエステラーゼ阻害アッセイ
アセチルコリンエステラーゼ (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	アセチルコリンエステラーゼ阻害アッセイ
アセチルチオコリンヨウ化物 (ATChI)	上海アダマス試薬有限公司	1037408	アセチルコリンエステラーゼ阻害アッセイ
アセトニトリル	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	液体クロマトグラフィー移動相
AutoDock Vina	AutoDock	バージョン 1.2.5
ベルベリン標準	成都科貿薬業有限公司	110713-201814	化学組成分析
コロンバミン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180712	化学組成分析
コプチシン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180309	化学組成分析
E-916 高速溶媒抽出器	Büchi Labortechnik AG, スイス	E916-008	n-ブタノールフラクションの抽出
エピベルベリン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180309	化学組成分析
ギ酸	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	液体クロマトグラフィー移動相
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
グロウシン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180615	化学組成分析
ジャトロリジン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180607	化学組成分析
マグノフロリン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180205	化学組成分析
メタノール	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	液体クロマトグラフィー移動相
微孔膜	ミリポアフィルターカンパニー	2139547	抽出物のろ過
パルマチン標準	成都科貿薬業有限公司	CHB180226	化学組成分析
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
炭酸ナトリウム	上海アダマス試薬有限公司	15138805	アセチルコリンエステラーゼ阻害アッセイ
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	上海アダマス試薬有限公司	11019349	アセチルコリンエステラーゼ阻害アッセイ

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