研究記事

胎盤由来エキソソームはSASH1を介して、低酸素誘発性トロホブラストアポトーシスおよび炎症の進行を軽減する

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DOI：

10.3791/71083

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2026年8月18日

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1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

SAMおよびSH3ドメイン含有タンパク質1（SASH1）は、妊娠高血圧腎症（PE）における栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症の重要な調節因子であることが同定されました。胎盤由来エクソソーム（P-EXOS）は、SASH1の発現を抑制することで、低酸素誘導性損傷を軽減します。これらの知見は、PEの病態生理の根底にある新しいメカニズムを明らかにし、SASH1が潜在的な治療標的となることを示唆しています。

要約

SASH1は、細胞成長、アポトーシス、および免疫調節に関与するシグナルアダプタータンパク質であり、腫瘍細胞や免疫細胞において研究が進んでいます。最新の知見により、SASH1は炎症反応や細胞恒常性において重要な役割を果たしていることが示唆されており、これらのプロセスはPE（妊娠高血圧腎症）の発症と密接に関連しています。本研究では、SASH1がPEにおける栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症反応に寄与しているか、またP-EXOSがSASH1の調節を通じて保護効果を発揮するかを明らかにすることを目的としました。本研究では、3つのPE関連トランスクリプトームデータセット（GSE75010、GSE10588、GSE60438）を解析して共通の発現変動遺伝子（DEG）を特定し、続いてジーンオントロジー（GO）およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）濃縮解析を行いました。さらに、機械学習アルゴリズムを適用して主要な候補遺伝子をスクリーニングし、シングルセルRNAシーケンシングデータを用いて胎盤組織における細胞の不均一性を特徴付け、細胞型特異的な発現パターンを決定しました。その結果、SASH1が共通の候補遺伝子として同定され、PEサンプルの栄養膜細胞において有意に発現が上昇していました。In vitroでは、低酸素処理したHTR-8/SVneo栄養膜細胞モデルを構築し、SASH1のノックダウン、SASH1の過剰発現、およびP-EXOSとの共培養を組み合わせました。機能解析の結果、SASH1のノックダウンは低酸素誘発性の栄養膜細胞アポトーシスを有意に抑制し、IL-6、IL-1β、TNF-αを含む前炎症性サイトカインの分泌を減少させましたが、一方でSASH1の過剰発現はアポトーシスと炎症反応を促進しました。さらに、P-EXOS処理はmRNAおよびタンパク質の両レベルでSASH1の発現を著しく減少させ、低酸素誘発性の栄養膜細胞障害を軽減しましたが、SASH1の過剰発現はこれらの保護効果を大部分に消失させました。以上の結果から、SASH1がPEにおける栄養膜細胞のアポトーシスと炎症反応において重要な役割を果たしていることが示されました。P-EXOSはSASH1の発現を抑制することで、低酸素誘発性の栄養膜細胞障害を軽減させる可能性があり、PEの分子メカニズムおよび潜在的な治療標的に対する新たな知見を提供するものです。

概要

PE（妊娠高血圧腎症）は、通常、妊娠20週以降に発生する妊娠特有の多臓器疾患であり、臨床的に高血圧、蛋白尿、および多臓器不全を特徴とします。これは、世界的に妊婦および周産期の罹患率と死亡率の主要な原因となっています1。臨床管理は継続的に進歩していますが、PEの根本的な治療法は依然として胎盤の分娩であり、このことは病態生理学的理解が不十分であること、また、新たな分子・細胞メカニズムおよび潜在的な治療標的を特定することが急務であることを強調しています2,3

適切な栄養膜細胞の浸潤と正常な胎盤形成の促進は、子癇前症（PE）の病態生理における重要なメカニズムである4。正常な妊娠では、栄養膜細胞が子宮脱落膜に浸潤し、らせん動脈を再構築することで、低抵抗かつ大容量の血流を確立する。栄養膜細胞の浸潤および遊走能が低下すると、胎盤血流が減少して、持続的な低酸素状態および酸化ストレス環境が生じる。低酸素状態は細胞アポトーシスに直接的な影響を与え、さらに前炎症性メディエーターの異常な放出が母体・胎児インターフェースにおける恒常性を乱し、胎盤機能不全をさらに悪化させる5。炎症もまたPEの重要な駆動要因である。PE患者の胎盤および末梢血において、IL-17、IL-6、およびTNF-αが著しく上昇していることが分かっている6。低酸素と炎症は互いに増強し合い、全身性の炎症を増幅させ、内皮細胞障害を引き起こし、胎盤異常に寄与するという悪循環を形成する。栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症反応を制御する基礎的な分子ネットワークは、依然として大部分が不明である。

SASH1は、シグナリングアダプターとして機能する細胞内スキャフォールドタンパク質のSLy/SASH1ファミリーの一員です7。SASH1は主に、CRKLやPI3K-Akt-mTOR経路などのシグナリングパートナーとの相互作用を通じて、上皮間葉転換（EMT）、細胞遊走、および浸潤を抑制する腫瘍抑制因子として特徴付けられてきました8,9。腫瘍抑制的な役割に加え、SASH1が炎症性シグナリングや免疫調節に関与していることを示唆する新たな証拠も出てきています7。しかしながら、胎盤におけるSASH1の発現および機能、特に栄養膜細胞の生物学およびPEの文脈における研究は行われていません。

エクソソームは重要な細胞間メディエーターとして台頭しており、妊娠に関連した文脈での研究が進んでいます10。エクソソームは、タンパク質、脂質、非コードRNAを含むさまざまな生物活性カーゴを輸送し、受容細胞の機能を調節します。多くの証拠から、P-EXOSは妊娠中の免疫調節において重要な役割を果たしており、PEにおいてはその活性とカーゴが著しく変化し、炎症状態を増幅させる可能性があることが示唆されています11。また、エクソソームは酸化ストレス12および血管新生13の調節に関与しており、妊娠関連合併症に対して有益な効果を及ぼす可能性があります。しかし、PEにおけるそれらの分子標的および作用機序については、まだ十分に解明されていません。

SASH1はPE胎盤において発現調節不全となっており、栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症反応の主要な駆動因子として機能し、さらにP-EXOSがSASH1の発現を調節することで栄養膜細胞の損傷に対して保護効果を発揮するという仮説を立てました。この仮説を検証するため、複数のPEトランスクリプトームデータセットを統合し、マルチアルゴリズム機械学習を用いたシングルセルRNAシーケンシングデータから主要な候補遺伝子を特定しました。低酸素処理したHTR-8/SVneo栄養膜細胞モデルおよびエクソソームを用いた介入実験により、栄養膜細胞機能不全におけるSASH1の機能的な役割と、PEにおけるP-EXOSの治療的可能性を検討しました。

プロトコル

倫理声明

本研究は、石家荘市第四医院の倫理委員会によって承認されました（承認番号：20200031）。試料採取に先立ち、すべての胎盤組織ドナーから書面によるインフォームドコンセントを得ました。ヒト参加者が関与するすべての手順は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。本プロトコルで使用した試薬、消耗品、機器、およびソフトウェアの完全なリストは、材料表に記載されています。

データ収集

RNA-seqデータはGEOデータベースから取得しました。データセットには、157例のPE胎盤と173例の非PE胎盤の遺伝子発現データを含むGSE75010（N = 330）が含まれます。GSE10588には、26例の正常胎盤と17例の重症PE胎盤の遺伝子発現データ（N = 43）が含まれています。GSE60438には、子癇前症患者および正常血圧妊娠における基底脱落膜のトランスクリプトームプロファイリングデータ（N = 125）が含まれています。シングルセル・トランスクリプトームデータは、GEOデータセットGSE183338から取得しました。これには、PEおよび健康な妊娠の絨毛/母体・胎児界面から得られた単一核サンプルが含まれています。

DEG解析

PEに関連するDEGについて、GSE75010、GSE10588、およびGSE60438のデータセットをまず前処理し、正規化しました。次に、サンプルのグループ化情報に基づき、Rパッケージの「limma」14を用いて差分解析を行いました。p < 0.05および|log2FC| > 0.5の遺伝子を選択しました。DEGのボルケーノプロットはRパッケージのggplot2を用いて作成しました。上位20個のDEGのヒートマップはRパッケージのpheatmapを用いて描画しました。続いて、3つのデータセットから選択されたDEGの共通部分を抽出し、オンラインプラットフォームのSTRINGを用いて、相互作用スコアを0.15以上に設定して候補遺伝子のタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）ネットワークを構築しました。このPPIネットワークから、Cytoscapeソフトウェアを用いて接続度に基づきランキングし、上位20個のハブ遺伝子をさらに特定しました。PPIネットワークの結果は、CytoscapeソフトウェアまたはSTRINGを用いて可視化しました。

濃縮解析

遺伝子濃縮解析は、Metascapeウェブサイトと併せて、ClusterProfilerおよびDOSEパッケージを用いて実施した。データベースはGOおよびKEGGから取得した。濃縮解析は「EnrichGO」関数を用いて行った。p < 0.05のパスウェイを、有意に濃縮されているとみなした。濃縮結果は、「ggplot2」および「ggpubr」パッケージを用いて視覚化した。

機械学習

PEに関連する、頑健かつ生物学的に意味のあるDEGを特定するため、公開されているトランスクリプトームデータセットGSE60438（プラットフォーム：GPL6884）に基づき、マルチモデル機械学習による特徴量選択解析を実施した。このデータセットには、帝王切開時に採取された、子癇前症および正常血圧の妊娠における基底脱落膜サンプルの発現プロファイルが含まれている。事前フィルタリングしたDEGを標準化し、発現マトリックスを対応する臨床グループ情報とともに、4つの異なる機械学習アルゴリズムの入力として使用することで、モデルのバイアスを低減し、特徴量選択の安定性を向上させた。

4つのアルゴリズムを特定の順序なく同時に適用した。LASSOは「glmnet」パッケージを用いて回帰分析を行い、重要な特徴遺伝子の選択を行った。損失関数にL1正則化項を加えることで、重要度の低い特徴量の係数をゼロに収縮させ、これにより特徴選択を実現した。SVM-RFEは「e1071」パッケージを用いて実装し、再帰的特徴消去を伴うサポートベクターマシンを構築した。まずSVMを用いて分類器を学習させ、特徴量ウェイトに基づいて寄与度の低い特徴量を反復的に除去し、最適な特徴量サブセットを抽出した。XGBoostは「xgboost」パッケージを用いて適用し、複数の決定木を構築した。各決定木は前の決定木の残差に適合させ、加重出力値を累積させることで最終的な予測を得た。Borutaは「randomForest」パッケージを用いて実行し、ランダムフォレストの学習において実特徴量と競合するシャドウ特徴量を生成した。ランダムノイズよりも有意に高い重要度を持つ特徴量を保持した。

シングルセル・トランスクリプトーム解析

シングルセル・トランスクリプトームデータはGEOデータベースから取得し、raw countマトリックスをGSE183338から抽出した。このカウントマトリックスをSeuratパッケージの「Read10X」関数を用いてインポートし、dgCMatrix形式に変換した。個々のオブジェクトは「merge」関数を用いて単一の集約オブジェクトに統合し、「RenameCells」を用いて細胞ラベルをユニーク化した。低クオリティの細胞は以下の基準に基づいてフィルタリングした。具体的には、3個未満の細胞で発現している遺伝子を除去し、200個未満の遺伝子を発現している細胞を排除した。品質管理後の細胞を正規化し、高変動遺伝子を同定した。グローバルスケーリング正規化には「LogNormalize」（scale factor = 10,000）を適用し、「FindVariableFeatures」を用いて高変動遺伝子（n = 2,000）を選出、さらに「ScaleData」を用いてデータをスケーリングした。高変動特徴量に対して主成分分析を行い、上位30個の主成分を保持した。サンプル間のバッチ効果はHarmony法を用いて補正した。細胞の可視化および次元削減にはUMAPを用いた。Louvainアルゴリズムに基づき、「FindNeighbors」および「FindClusters」を用いて共有最近傍グラフを構築した。「FindClusters」における解像度（resolution）パラメータは0.1から1の間で最適化した。クラスタリングツリーを「clustree」関数で可視化し、細胞クラスターを定義するために解像度0.9を選択した。潜在的なダブレットはScrubletアルゴリズムを用いて除去した。細胞クラスターの注釈付けは、「FindAllMarkers」関数を用いて差分発現マーカー遺伝子を同定することで行った。ノンパラメトリックなWilcoxon順位和検定を適用し、ボンフェローニ補正を行った。細胞の同定は、表面マーカー、関連文献、およびCell Classification Database15に基づいて割り当てた。

細胞培養

栄養膜細胞株HTR-8/SVneo細胞を、10%胎児牛血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地で培養した。低酸素条件は、1% O₂、5% CO₂、94% N₂の条件下で細胞を24 h培養することで設定し、正常酸素コントロールは20% O₂および5% CO₂で維持した16。すべての細胞培養手順は、無菌操作を用いてクラスIIバイオセーフティキャビネット内で行う必要がある。培養培地、トランスフェクション試薬、および細胞廃棄物は、施設内のバイオセーフティガイドラインに従って廃棄すること。

細胞トランスフェクション

sh-SASH1、sh-NC、OE-SASH1、およびOE-NCを含むプラスミドを合成した。HTR-8/SVneo細胞を、6ウェルプレートに1ウェルあたり5 × 105 cellsの密度で播種した。その後、製造元の指示に従い、導入試薬を用いて、1ウェルあたり2 µgのsh-SASH1、sh-NC、OE-SASH1、またはOE-NCプラスミドを細胞にトランスフェクションした。簡潔に述べると、プラスミドDNAとP3000試薬をOpti-MEMで希釈し、別途Opti-MEMで希釈したLipofectamine 3000と混合して室温で15分間インキュベートした後、コンフルエンシーが70–80%に達した細胞に添加した。トランスフェクションの48時間後に、RT-qPCRおよびウェスタンブロットによりSASH1の発現を評価した。SASH1のノックダウンに使用したshRNA標的配列は、Supplementary Table 1に記載している。

リアルタイム定量PCR

HTR-8/SVneo細胞から全RNAを抽出し、逆転写キットを用いて42 °Cで30分間、次いで85 °Cで5分間、cDNAへと逆転写した。SYBR Greenマスターミックスを用い、以下のサイクル条件でリアルタイム定量PCR（qPCR）を行った：95 °Cで10分間、その後、95 °Cで15秒間および60 °Cで1分間のサイクルを40回繰り返した。相対的なmRNA発現量は、β-actinを内部標準としてΔΔCt法を用いて算出した。本実験で使用したプライマー配列は付録表2に記載している。

ウェスタンブロットアッセイ

ライシスバッファーを用いてHTR-8/SVneo細胞から全タンパク質を抽出した。細胞溶解物を回収して氷上でインキュベートし、4 °Cで12,000 × gで30分間遠心分離して不溶性残渣を除去した。分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定した。等量（50 µg）のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、続いてPVDF膜に転写した。膜を5%脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。洗浄後、膜を対応する二次抗体でインキュベートし、タンパク質のバンドを化学発光検出システムを用いて可視化した。

タンパク質検出には、一次抗体としてanti-SASH1およびβ-actinを用いた。適切な西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体として、goat anti-rabbitおよびgoat anti-mouseを使用した。タンパク質の等量ロードを確認するための内部ローディングコントロールとしてβ-actinを用いた。タンパク質バンドの強度は、ImageJソフトウェアを用いて測定および定量化した。

P-EXOSの単離

P-EXOSは、選択的帝王切開術を受けた健康な女性の正期産胎盤から得られた胎盤絨毛組織から単離した。胎盤絨毛組織を滅菌PBSで十分に洗浄し、約1 mm3の断片に細切し、10%エクソソーム除去FBSを添加したRPMI-1640培地を用いて37 °C、5% CO2条件下で48時間培養した。条件化培地に対し、以下のように分画遠心分離を行った。すべて4 °Cにて、300 × gで10分間遠心して細胞および組織残渣を除去し、次に2,000 × gで20分間遠心して細胞残渣を除去し、さらに10,000 × gで30分間遠心してマイクロベシクルを除去した。得られた上清を4 °Cで120,000 × g、70分間超遠心し、エクソソームをペレット化した。このペレットをPBSで1回洗浄し、再び4 °Cで120,000 × g、70分間超遠心した。最終的なペレットをPBSに再懸濁した。単離したエクソソームは、エクソソームマーカー（PLAP、CD63、TSG101を用い、GM130を陰性コントロールとした）のウェスタンブロット分析により特性評価し、さらに透過型電子顕微鏡を用いて形態学的観察を行った。

P-EXOS細胞取り込み実験

P-EXOSの細胞内への取り込みを確認するため、製造元のプロトコルに従い、親油性膜染料であるPKH67を用いてエクソソームを蛍光標識した。簡潔に述べると、P-EXOSをDiluent C中のPKH67 (4 µM) と室温で5分間インキュベートし、同量の1% 牛血清アルブミン (BSA) を加えて反応を停止させた。標識したエクソソームは、未結合の染料を除去するため、超遠心分離 (120,000 × g, 70 min, 4 °C) によって再単離した。次に、PKH67標識P-EXOS (50 µg/mL) をHTR-8/SVneo細胞に添加し、常酸素または低酸素 (1% O₂) 条件下で24時間共インキュベートした。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで15分間固定し、核をDAPI (1 µg/mL) で対比染色した。PKH67標識エクソソームの取り込みを共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM; 励起 490 nm, 蛍光 502 nm) で視覚化した。機能的な共培養実験では、HTR-8/SVneo細胞を、10% エクソソーム除去FBSを添加した完全RPMI-1640培地中で、低酸素条件 (1% O₂) 下、50 µg/mL (タンパク質相当量) 濃度のP-EXOSで24時間処理した。

酵素結合免疫吸着法 (ELISA)

細胞培養上清を回収し、メーカーの指示に従って、IL-6 ELISAキット、IL-1β ELISAキット、およびTNF-α ELISAキットを用いて、それぞれIL-6、IL-1β、およびTNF-αのレベルを測定した。マイクロプレートリーダーを用いて450 nmにおける吸光度を測定し、標準曲線から実際の濃度を算出した。

TdT介在性dUTPニックエンドラベル法（TUNEL法）

TUNELアッセイキットを用い、製造者のプロトコルに従ってアポトーシス細胞を検出した。簡潔に述べると、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定し、0.1% Triton X-100含有PBSで氷上で5分間透過処理した後、TUNEL反応液を用いて37 °Cの暗所で60分間インキュベートした。核をDAPIで対比染色し、蛍光顕微鏡を用いてTUNEL陽性細胞を可視化し、サンプルあたりにランダムに選択した少なくとも5つの視野におけるTUNEL陽性細胞の割合を算出することで定量化した。

統計解析

すべてのデータはRおよびGraphPad Prismを用いて解析した。連続変数は平均値 ±SDで示した。2群間の比較にはStudentのt検定を用い、多群間の比較には一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびそれに続くTukeyのポストホック検定を用いた。カテゴリ変数の統計的有意性は、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定により評価した。特に断りのない限り、分子間の相関はSpearman相関分析を用いて算出した。エクソソームの特性評価実験は、3名の独立した胎盤ドナーから単離したP-EXOSを用いて行った。細胞ベースの実験は、異なる継代数のHTR-8/SVneo細胞を用い、別日に実施した3回の独立した生物学的反復（independent biological replicates）として行い、各反復にはそれぞれ異なる胎盤ドナーから単離したP-EXOSを使用した。p < 0.05を統計的に有意であるとみなした。

結果

健康な患者およびPE患者のトランスクリプトーム解析

正常（Normal）群とPE患者間の遺伝子発現の差について、統合データセットにおけるRパッケージlimmaを用いた差分的発現解析を行った。GSE75010では、計89個のDEG（p < 0.05 かつ |log2FC| > 0.5）が同定され、そのうち発現上昇遺伝子が69個、発現低下遺伝子が20個であった（図 1A）。また、2,097個の差分的発現遺伝子があり、1,121個が発現上昇、976個が発現低下していた（図 1B）。GSE60438データセットでは7,633個のDEGがあり、3,371個の発現上昇遺伝子と4,262個の発現低下遺伝子が認められた（図 1C）。3つのデータセット間でDEGの数に大幅な差があることは、サンプルサイズ、組織由来（胎盤絨毛または底脱落膜）、およびPEの重症度分類の違いを反映していると考えられ、堅牢な共通DEGを同定するためにデータセット間の積集合（インターセクション）を取ることの有用性がさらに強調されている。

DEGの機能濃縮解析

PEに関連する主要なDEGを系統的に特定するため、GSE75010、GSE10588、およびGSE60438のPEデータセットから得られたDEGに対してベン図解析を行い、最終的に56個の共通DEGを特定した（Figure 2A）。これら56個の共通DEGについて、オンラインプラットフォームSTRING（interaction score ≥0.15）を用いてPPIネットワークを構築し、さらにCytoscapeソフトウェアを用いてネットワーク内の接続度に基づきランキングを行い、上位20個のハブ遺伝子を特定した（Figure 2B）。これらの遺伝子に基づき、BP、CC、およびMFにおける潜在的な機能を探索するため、GO濃縮分析も実施した（Figure 2C）。DEGは、ホルモン分泌および膜貫通型受容体セリン/スレオニンキナーゼシグナリングの調節に最も濃縮されている可能性が高かった。細胞に関しては、これらの遺伝子は主に焦点接着、細胞-基質接合、およびさまざまな小胞およびリソソーム関連遺伝子に局在していた。分子機能においては、プロリルヒドロキシラーゼ活性、ホルモン活性、および脂質関連分子の膜貫通輸送が濃縮された用語であった。これらの結果は、DEGが胎盤細胞のシグナル伝達、細胞-マトリックス相互作用、および内分泌関連機能の維持において重要な役割を果たしている可能性を示唆している。同時に、KEGGパスウェイ濃縮分析の結果、DEGはサイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、細胞接着分子相互作用、およびTGF-βおよびHIF-1シグナリングパスウェイに最も濃縮されている可能性が高いことが分かった（Figure 2D）。一部のウイルス関連用語（例：B型肝炎ウイルス、エボラウイルス）の濃縮は、PEとの直接的な生物学的関連というよりも、共通の免疫調節遺伝子との非特異的な重複を反映している可能性が高いため、解釈の重点は炎症、接着、および低酸素関連パスウェイに置いた。これらのパスウェイは、炎症反応、細胞接着介在性、および低酸素関連シグナリングに関連しており、胎盤微小環境における免疫炎症状態および細胞間コミュニケーションを変化させることで、PEの進行に影響を及ぼしている可能性がある。

機械学習により、PEにおける重要遺伝子としてSASH1を同定

重要な予後遺伝子を特定するため、4つの機械学習手法を用いて特徴選択を行いました。クロスバリデーションを伴うLASSO回帰により、log(λ.min) = -3.8075のときにモデルが最小のクロスバリデーション誤差を達成することが示されました。このλ値において係数が非ゼロであった遺伝子を、LASSOによって特定された主要な特徴量として選択しました（Figure 3A–B）。Borutaアルゴリズムでは、シャドウ特徴量との比較によって特徴量重要度を評価します。重要度がshadowMaxより高い遺伝子を「Confirmed」としてラベル付けし、主要な候補遺伝子と見なしました。一方、重要度がshadowMinより低い遺伝子は「Rejected」としてラベル付けし、有意な寄与はないと見なしました。これら2つの閾値の間にある遺伝子は「Tentative」としてラベル付けされ、重要である可能性はあるが不確実であることを示しました（Figure 3C）。SVM-RFE解析では、40–50個の特徴量を保持したときにクロスバリデーション精度が最高または最高に近いレベルに達し、この特徴量スケールで最適な予測性能が得られることが示唆されました（Figure 3D）。クロスバリデーション精度が中程度（~0.6）であったことは、単一のアルゴリズムではこのデータセットに対して最適に機能しなかったことを示しており、したがって特徴選択の堅牢性を高めるために、複数のアルゴリズムの積集合（インターセクション）戦略を採用しました。XGBoostでは、Gain値を用いて遺伝子の相対的な重要度を定量化し、モデルの予測への寄与度が高い特徴量を特定しました（Figure 3E）。4つの手法の結果をベン図で解析したところ、共通して抽出された唯一の遺伝子としてSASH1が特定されました。SASH1はBorutaアルゴリズムではTentativeに分類されましたが、他の3つのアルゴリズムすべてで一貫して選択されたことから、コンセンサス候補遺伝子として指定することを支持する結果となりました（Figure 3F）。

シングルセル解析

PE胎盤組織における細胞の不均一性と分子プロセスを調査した。検出された遺伝子数、RNAカウント数、およびミトコンドリア遺伝子発現の割合に基づき、細胞のクオリティフィルタリングを行った。下流解析に向けて高品質な単一細胞サンプルを得るため、低品質な細胞（検出遺伝子が200未満、またはミトコンドリア遺伝子含有率が20%超）を除去した。品質管理指標および高変動遺伝子の同定結果をSupplementary Figure 1A–Bに示す。正規化および高変動遺伝子の同定後、上位2,000個の高変動遺伝子を用いて主成分分析（PCA）を行い、JackStraw解析およびElbowPlot解析を用いて有意な主成分を決定した（Supplementary Figure 2A–B）。

主成分に基づき、次元削減と教師なしクラスタリングを行うためにuniform manifold approximation and projection (UMAP) を使用したところ、すべての細胞が22のクラスターに分類され、胎盤組織における高い細胞異質性が浮き彫りになった（図 4A）。クラスター特異的なマーカー遺伝子の発現を解析し、DEGをヒートマップで可視化したことにより（図 4B）、各クラスターを標準的なマーカーに基づいてアノテーションし、UMAP埋め込みに再度投影した（図 4C）。これにより、B細胞/形質細胞、内皮細胞、線維芽細胞/ストローマ細胞、マクロファージ/樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、T細胞、および栄養膜細胞を含む、主要な胎盤細胞集団が同定された。対照群とPE群との比較により、PE胎盤においていくつかの細胞種で相対的な分布に実質的な変化が見られ、胎盤微小環境のリモデリングが示唆された（図 4D）。

組織の由来および疾患状態を用いて、組織源（脱落膜 vs 絨毛）および疾患群（コントロール vs PE）に基づき、同一のUMAP埋め込み内で細胞を追跡した（Figure 4E）。細胞数の分布は組織由来によって部分的に分かれていたが、異なる疾患群の細胞は互いに強く相互接続していた。このことは、PEがトランスクリプトーム構造全体を大幅に再編するのではなく、個々の細胞集団や特定の分子特性に影響を及ぼす可能性を示唆している。SASH1の発現をUMAP上にマッピングし、胎盤細胞集団におけるその分布を探索した（Figure 4F–G）。SASH1は強い細胞型特異的な発現を示し、脱落膜細胞集団と絨毛細胞集団の間で顕著な差が認められた。細胞型ごとのPE群とコントロール群におけるSASH1発現の統計的比較（ウィルコクソン順位和検定）により、複数の胎盤細胞集団で有意な差があることが明らかになり、特にPEサンプルのトロフォブラスト細胞において最も顕著な上昇が観察された（Figure 4H）。この知見は、SASH1の調節不全が特にトロフォブラスト画分で顕著であるというシングルセルレベルの根拠を提供し、その後の機能実験にHTR-8/SVneoトロフォブラスト細胞株を使用することを支持するものである。

SASH1のノックダウンは、低酸素誘発性のトロフォブラストアポトーシスおよび炎症反応を抑制する

バイオインフォマティクスによる予測を検証するため、低酸素条件下（1% O2）でPE（妊娠高血圧症候群）に関連する栄養膜細胞モデルを構築した。qPCRおよびウェスタンブロット解析を行い、SASH1の発現を評価した（Figure 5A–B）。常酸素下のHTR-8/SVneo細胞と比較して、低酸素処理した細胞ではSASH1のmRNAおよびタンパク質発現レベルが有意に上昇しており、バイオインフォマティクスの結果が予備的な実験によって検証された。SASH1のノックダウンがPE関連の病理学的プロセスに及ぼす影響を評価するため、低酸素処理したHTR-8/SVneo細胞においてSASH1をサイレンシングした。定量PCRおよびウェスタンブロット解析（Figure 5C–D）の結果、sh-NC群と比較して、すべてのsh-SASH1群でSASH1の発現が有意に減少していた。その中でもsh-SASH1#3が最も高いノックダウン効率を示したため、以降の実験に採用した。TUNEL染色およびELISAを、常酸素対照（Normal）、低酸素＋ネガティブコントロールshRNA（Hypoxia + sh-NC）、低酸素＋SASH1ノックダウン（Hypoxia + sh-SASH1）の3条件で実施した。Normal群と比較して、Hypoxia + sh-NC群ではアポトーシスが有意に増加し、炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6、TNF-αの分泌量が高まっており、低酸素誘発性の栄養膜細胞障害が確認された。SASH1のノックダウンはこれらの影響を著しく減弱させ、アポトーシス（Figure 5E）およびサイトカインレベル（Figure 5F）をNormal群に近いレベルまで低下させた。このことは、SASH1のノックダウンが低酸素誘発性の栄養膜細胞アポトーシスおよび炎症反応を大幅に救済できることを示唆している。さらにSASH1の因果関係を確立するため、機能獲得実験を行った。qPCRおよびウェスタンブロットにより、HTR-8/SVneo細胞においてSASH1の過剰発現が成功したことを確認した（Figure 5G–H）。常酸素条件下において、SASH1の過剰発現（OE-SASH1）はOE-NC群と比較して、栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症性サイトカインの分泌を有意に増加させ、低酸素誘発性の表現型を再現した（Figure 5I–J）。以上の機能喪失および機能獲得データのまとめにより、SASH1が栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症反応を駆動するために必要かつ十分であることが証明され、PE関連病理におけるSASH1の因果的役割が確認された。

P-EXOSはSASH1を調節することにより、低酸素誘導性の栄養膜細胞のアポトーシスおよび炎症反応を抑制する

P-EXOSは、PEにおいて潜在的な治療価値を持つと考えられています。本研究において、バイオインフォマティクス解析によりSASH1がエクソソーム関連のシグナル伝達経路に関連していることが示唆され（GOおよびKEGGエンリッチメント解析による、Figure 2C–D）、我々はP-EXOSがSASH1を調節することでPEに対して保護効果を及ぼすのではないかという仮説を立てました。機能研究に先立ち、まず単離したP-EXOSの特性解析を行いました。ウェスタンブロット解析により、エクソソームマーカータンパク質であるPLAP、CD63、およびTSG101の存在が確認され、ゴルジ体マーカーであるGM130の発現は認められなかったことから、単離した小胞の高純度が示されました。さらに、透過型電子顕微鏡により、典型的なカップ状の小胞構造が明らかになりました（Figure 6A–B）。P-EXOSが標的細胞に効率的に取り込まれるかを確認するため、免疫蛍光染色を行い、P-EXOSの細胞内取り込みを評価しました。対照群と比較して、P-EXOSで処理したHTR-8/SVneo細胞では、マージ画像において顕著な共局在シグナルが認められ、P-EXOSがHTR-8/SVneo細胞に効果的に取り込まれたことが示されました（Figure 6C）。

続いて、HTR-8/SVneo細胞を低酸素条件下でP-EXOSと共培養した。定量PCRおよびウェスタンブロット解析の結果、対照群と比較してP-EXOS処理群ではSASH1のmRNAおよびタンパク質レベルが著しく減少しており（Figure 6D–E）、P-EXOSとSASH1の間に調節的な相互作用があることが示唆された。これらの分子的な変化と一致して、TUNEL染色の結果、P-EXOS処理後にHTR-8/SVneo細胞における低酸素誘発性アポトーシスが大幅に抑制されていることが明らかになった（Figure 6F）。同時に、ELISA解析により、IL-6、IL-1β、TNF-αを含む炎症性サイトカインの分泌が著しく減少していることが示された（Figure 6G）。

P-EXOSの保護効果がメカニズム的にSASH1の抑制に依存しているかどうかを判断するため、低酸素条件下でレスキュー実験を行った。SASH1を過剰発現させた細胞（OE-SASH1 + P-EXOS）を、陰性対照細胞（OE-NC + P-EXOS）と比較した。OE-NC + P-EXOS群と比較して、アポトーシスの増加（図 6H）および炎症性サイトカイン分泌の亢進（図 6I）が認められたことから、SASH1の過剰発現はP-EXOSの保護効果を著しく消失させた。これらの結果は、P-EXOSの保護効果が並行する経路ではなく、特異的にSASH1の抑制を介して媒介されることを示しており、PEにおけるP-EXOSの治療的可能性を強調するものである。

データの可用性：

本研究の結果を裏付けるデータセットは公開されており、Gene Expression Omnibus (GEO) データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) から、アクセッション番号 GSE75010、GSE10588、GSE60438、および GSE183338 として取得されました。細胞型のアノテーションは、Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/) を参照して行われました。クロップ前のウェスタンブロット画像および本研究の結果を裏付けるその他のすべての生実験データは、Supplementary Raw Data フォルダに提供されています。

火山プロットとヒートマップ図は、異なるデータセットにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
図1: 3つの独立したデータセットにおけるPE胎盤および脱落膜組織のDEGの同定。(A>) 統合されたGSE75010データセットにおける、157例のPE胎盤サンプルと173例の非PE胎盤サンプルの間のDEGの火山プロット。(B>) GSE10588データセットにおける、重症PE胎盤サンプル (n = 17) と正常胎盤サンプル (n = 26) の間のDEGの火山プロット。(C>) GSE60438データセットにおける、PE脱落膜サンプルと正常血圧対照脱落膜サンプルの間のDEGの火山プロット。DEGは p < 0.05 および |log2FC| > 0.5 を用いて同定された。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ベン図、ネットワークグラフ、コード図；遺伝子発現解析、タンパク質相互作用マッピング。
図 2: 子癇前症に関連する共通DEGの機能濃縮およびPPI解析。(A) PE関連データセットGSE75010、GSE10588、およびGSE60438から同定されたDEGのベン図。(B) 56個の共通DEGから、接続度に基づきCytoscapeソフトウェアを用いてランク付けし選出した上位20個のハブ遺伝子のPPIネットワーク（STRING相互作用スコア ≥0.15）。(C) 共通DEGのGOおよびKEGG濃縮解析を棒グラフで示したもの。(D) 共通DEGのGOおよびKEGG濃縮解析をコード図で示したもの。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

遺伝子選択手法；LASSO、XGBoost、SVM、Borutaの結果；比較データ解析チャート。
図 3: 機械学習を用いた子癇前症に関連する候補ハブ遺伝子のスクリーニング。(A) 候補遺伝子の係数プロファイルを示すLASSO回帰分析。(B) 交差検証を用いたLASSO回帰による最適正則化パラメータ（λ）の選択。(C) Borutaアルゴリズム。(D) SVM-RFE解析。(E) XGBoostアルゴリズム。(F) LASSO、Boruta、SVM-RFE、およびXGBoostアルゴリズムによって同定された候補遺伝子の共通部分を示すベン図。略語：LASSO = least absolute shrinkage and selection operator；SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

細胞型のデータ解析と分布を示すUMAPクラスタリング図および遺伝子発現ヒートマップ。
図 4: 単一細胞トランスクリプトーム解析により、子癇前症における細胞型特異的なSASH1発現パターンが明らかになった。(A) 単一細胞データセットのUMAPクラスタリング。(B) PE単一細胞トランスクリプトームデータセットGSE183338の上位5つのマーカー注釈解析。(C) 細胞サブポピュレーションの注釈。(D) コントロール群およびPE群における細胞割合の分布を示す棒グラフ。(E) 組織由来（脱落膜および絨毛）と疾患状態（コントロールおよびPE）で色分けしたUMAPプロット。(F) 組織由来（脱落膜および絨毛）でグループ化した胎盤細胞集団におけるSASH1発現を示すUMAPプロット。(G) 疾患状態（コントロールおよびPE）でグループ化した胎盤細胞集団におけるSASH1発現を示すUMAPプロット。(H) 異なる胎盤細胞型におけるSASH1の発現分布を示すバイオリンプロット。ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。略語：UMAP = uniform manifold approximation and projection（一様多様体近似および投影）；ns = 有意差なし。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

低酸素条件下でのSASH1発現；ウェスタンブロットによるタンパク質解析；遺伝子/タンパク質発現チャート。
図 5: SASH1は低酸素誘発性のトロホブラストアポトーシスおよび炎症を調節する。(A) 通常条件および低酸素条件下におけるHTR-8/SVneo細胞のSASH1 mRNA発現のqPCR解析およびSASH1タンパク質レベルの密度計による定量。(B) (A)に示す密度計データに対応する代表的なウェスタンブロット画像。(C) sh-NCまたはsh-SASH1コンストラクト（sh-SASH1#1、sh-SASH1#2、およびsh-SASH1#3）を導入し、低酸素処理したHTR-8/SVneo細胞におけるSASH1 mRNA発現のqPCR解析およびSASH1タンパク質レベルの密度計による定量。 (D) (C)に示す密度計データに対応する代表的なウェスタンブロット画像。(E) Normal群、Hypoxia + sh-NC群、およびHypoxia + sh-SASH1(#3)群におけるHTR-8/SVneo細胞のTUNEL染色。スケールバー = 20 µm。(F) Normal群、Hypoxia + sh-NC群、およびHypoxia + sh-SASH1(#3)群における炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、およびTNF-α）のELISA解析。(G) OE-NCまたはOE-SASH1コンストラクトを導入したHTR-8/SVneo細胞におけるSASH1 mRNA発現のqPCR解析およびSASH1タンパク質レベルの密度計による定量。(H) (G)に示す密度計データに対応する代表的なウェスタンブロット画像。(I) Normal + OE-NC群およびNormal + OE-SASH1群におけるHTR-8/SVneo細胞のTUNEL染色。スケールバー = 20 µm。(J) Normal + OE-NC群およびNormal + OE-SASH1群における炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、およびTNF-α）のELISA解析。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。データは3回の独立した生物学的反復（n = 3）の平均値 ± SDとして示されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ウェスタンブロット、TEM画像、および蛍光顕微鏡により、タンパク質レベルとアポトーシスに対するP-EXOの効果を評価する。
図 6: P-EXOSはSASH1の抑制を介して低酸素誘発性トロホブラスト傷害を軽減する。(A) P-EXOSのマーカータンパク質であるPLAP、CD63、およびTSG101のウェスタンブロット解析。GM130をネガティブコントロールとして使用した。(B) P-EXOSの形態の透過電子顕微鏡（TEM）解析。スケールバー = 1.0 µm。(C) HTR-8/SVneo細胞（赤）におけるPKH67標識P-EXOS（緑）の取り込みを示す共焦点レーザー走査顕微鏡画像。核はDAPI（青）で対比染色した。スケールバー = 20 µm。 (D) Control群およびP-EXOS群のHTR-8/SVneo細胞におけるSASH1 mRNA発現のqPCR解析およびSASH1タンパク質レベルの密度測定定量。 (E) (D)に示す密度測定データに対応する代表的なウェスタンブロット画像。(F) Control群およびP-EXOS群のHTR-8/SVneo細胞のTUNEL染色。スケールバー = 20 µm。(G) Control群およびP-EXOS群の低酸素処理したHTR-8/SVneo細胞における炎症性サイトカイン（IL-1β, IL-6, およびTNF-α）のELISA解析。(H) OE-NC + P-EXOS群およびOE-SASH1 + P-EXOS群のHTR-8/SVneo細胞のTUNEL染色。スケールバー = 20 µm。(I) OE-NC + P-EXOS群およびOE-SASH1 + P-EXOS群の低酸素処理したHTR-8/SVneo細胞における炎症性サイトカイン（IL-1β, IL-6, およびTNF-α）のELISA解析。略語：P-EXOS = 胎盤由来エクソソーム; TEM = 透過電子顕微鏡; PLAP = 胎盤アルカリホスファターゼ; TSG101 = tumor susceptibility gene 101. *p < 0.05; **p < 0.01. データは3回の独立した生物学的反復（n = 3）の平均値 ±SDで示している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足図1：シングルセルRNA-seqデータの品質管理。(A) 品質管理後の遺伝子発現レベルのバイオリンプロット。 (B) 品質管理後に特定された高変動遺伝子を示す変数特徴プロット。こちらをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。

補足図2：単一細胞クラスタリングにおける統計的に有意な主成分の決定。(A) 統計的に有意な主成分を特定するために使用したJackStrawドットプロット。 (B) 主成分によって説明される分散を示すエルボープロット。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

付録表1：SASH1ノックダウンに使用したshRNA標的配列遺伝子サイレンシングに使用した、陰性対照（sh-NC）および3種類のSASH1標的コンストラクト（sh-SASH1#1、sh-SASH1#2、sh-SASH1#3）のshRNA標的配列（5′–3′）。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表2：定量PCRに使用したプライマー配列。qPCR分析で使用したSASH1およびβ-actin（内部標準コントロール）のフォワードおよびリバースプライマー配列（5′–3′）。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本研究では、統合的なトランスクリプトーム解析、シングルセルシーケンシング、およびマルチアルゴリズム機械学習を通じて、PE（妊娠高血圧症候群）において発現異常を示す鍵となる遺伝子としてSASH1を同定しました。PEに対する標的療法が依然として存在しないことを考慮すると、このアプローチは特に重要です17。SASH1は、低酸素状態の栄養膜細胞において有意にアップレギュレートされており、シングルセル解像度においてPE胎盤の栄養膜コンパートメントで特異的に上昇していることが示されました。機能喪失および機能獲得実験を通じて、SASH1が栄養膜細胞のアポトーシスおよび前炎症性サイトカインの分泌を誘導するために、必要かつ十分であることが確立されました。さらに、P-EXOS処理は低酸素誘導性の栄養膜細胞傷害を軽減しましたが、この保護効果はSASH1の過剰発現によって消失しました。これにより、P-EXOSによる細胞保護作用は、メカニズム的にSASH1の抑制に依存していることが確認されました。

さらに、PEでは、B細胞/プラズマ細胞、内皮細胞、線維芽細胞/ストローマ細胞、マクロファージ/樹状細胞、NK細胞、T細胞、および栄養膜細胞を含む、複数の胎盤細胞型の割合に変化が認められています。これらの知見は、PEにおいて胎盤の微小環境が大幅なリモデリングを受けることを示唆しています。このような炎症性微小環境は、栄養膜細胞の機能不全を悪化させるだけでなく、免疫系と細胞外マトリックスの相互作用を通じて疾患の進行を加速させる可能性があります18。さらに、最近では好中球細胞外トラップ（NETs）が、PEにおける胎盤炎症を悪化させていることが示唆されています19。SASH1は、炎症シグナル伝達、細胞接着、および低酸素関連プロセスに関与することで、PEの発症において重要な役割を果たすと考えられています。本研究では、limmaパッケージを用いてPE患者および正常血圧妊婦の胎盤サンプルから遺伝子発現プロファイルを抽出し、特徴選択のためにLASSO回帰、SVM-RFE、XGBoost、Borutaという複数の機械学習アルゴリズムを用いました。すべてのアルゴリズムにおいて、SASH1が一貫してコンセンサス候補遺伝子として抽出されました。シングルセルレベルにおいて、SASH1は多様な胎盤細胞集団で細胞型特異的な発現を示し、PEサンプルで発現が高く維持されており、特に栄養膜細胞で最も顕著な差が観察されました。このことは、SASH1が異なる胎盤細胞のコンテキストにおいて、それぞれ異なる機能的影響を及ぼしている可能性を示唆しています。

SASH1はシグナル伝達アダプタータンパク質であり、細胞の遊走や浸潤、上皮間葉転換（EMT）、およびストレス応答性シグナルの調節を含む、さまざまな生物学的プロセスに関与することが報告されています8,9。PE（妊娠高血圧腎症）に関連する病理におけるSASH1の機能的役割を調査するため、HTR-8/SVneo細胞を用いて低酸素誘導性栄養膜細胞モデルを構築しました。その結果、低酸素への曝露によりSASH1の発現が有意に上昇した一方で、SASH1をノックダウンすると、低酸素誘導性の apoptosis が著しく減弱し、IL-1β、IL-6、TNF-αを含む炎症性サイトカインの分泌が減少することが示されました。逆に、常酸素条件下でのSASH1の過剰発現は、低酸素誘導性の表現型を再現するのに十分であり、SASH1が栄養膜細胞の損傷を促進する因果的な役割を担っていることが裏付けられました。これらの知見は、SASH1が炎症反応を調節することで、栄養膜細胞の機能的状態を負に制御している可能性を示唆しています。栄養膜細胞は胎盤の炎症性メディエーターの主要な供給源であるため20、SASH1の異常な発現が、PEにおける炎症増幅の重要な分子基盤となっている可能性があります。注目すべきは、栄養膜細胞で観察されたSASH1の pro-apoptotic および pro-inflammatory な機能が、がん細胞において通常 EMT や遊走を抑制するという標準的な腫瘍抑制的役割とは対照的であることです8,9。このようなコンテキスト依存的な機能の二面性は、SASH1の相互作用パートナーや下流のシグナル伝達ネットワークにおける細胞種特異的な差異を反映している可能性があり、さらなる研究が必要です。

エクソソームは細胞間コミュニケーションの重要な媒介因子として認識されており、PEの病態生理に関与しているとされています21。特に、P-EXOSは母児間の免疫寛容の維持など、正常な妊娠中の免疫調節において重要な役割を果たしている可能性があり、それがPEに対する保護作用をもたらすと考えられています22。本研究では、バイオインフォマティクス解析によりSASH1とエクソソーム関連シグナル経路との関連が明らかになり、栄養膜細胞の機能調節におけるP-EXOSの役割についてさらなる調査が行われました。共培養実験の結果、P-EXOS処理は低酸素処理した栄養膜細胞におけるSASH1のmRNAおよびタンパク質レベルを有意に低下させ、低酸素誘発性のアポトーシスおよび炎症反応を著しく減弱させることが示されました。重要なことに、SASH1の過剰発現によりこれらの保護効果が消失したことから、P-EXOSによる細胞保護作用は、並行経路を通じてではなく、メカニズム的にSASH1の抑制に依存していることが確認されました。

P-EXOSがSASH1の発現を抑制する分子メカニズムについては、まだ解明されていません。P-EXOSは、受容細胞における遺伝子発現を調節し得るmicroRNA、タンパク質、脂質などの多様な生物活性カーゴを運ぶことが知られています10。一つの可能性として、P-EXOSがSASH1を直接的または間接的に標的とする特定のmiRNAを届けていることが考えられます。あるいは、P-EXOSが、SASH1の転写調節に集約されるNF-κBやPI3K-Aktなどの上流シグナル伝達経路を調節している可能性があります。がん細胞においてSASH1がPI3K-Akt-mTOR経路に関与していることが示されているため8、エクソソームを介したこの軸の調節が、栄養膜細胞におけるSASH1のダウンレギュレーションに寄与していると考えられます。P-EXOSがSASH1発現を調節する正確な分子カスケードを解明するためには、エクソソームカーゴのシーケンシングや経路特異的阻害剤を用いた今後の研究が必要となるでしょう。

本研究では、PEにおける胎盤組織の分子変化を調査するため、トランスクリプトームプロファイリングを単一細胞RNAシーケンシングと統合した。SASH1が低酸素誘導性の栄養膜細胞アポトーシスおよび炎症反応において重要な役割を果たしていること、またP-EXOSがSASH1の発現を抑制することで保護効果を及ぼすことが示され、PEの根底にある分子メカニズムに新たな知見をもたらし、潜在的な治療戦略を提示した。しかしながら、本研究にはいくつかの限界がある。第一に、機能的な知見は主に不死化栄養膜細胞株であるHTR-8/SVneoから得られたものであり、初代栄養膜細胞での検証が必要である。第二に、臨床的なPE胎盤組織において、免疫組織化学染色によるSASH1タンパク質発現の検証が行われておらず、これが知見のトランスレーショナルな解釈を制限しているため、今後の研究で対処されるべきである。第三に、SVM-RFE分類器のクロスバリデーション精度は中程度（〜0.6）であり、これはデータセット固有の不均一性を反映している。より堅牢な診断モデルを開発するには、より大規模な独立コホートが必要となる。第四に、P-EXOSがSASH1発現を抑制する正確な分子メカニズムは依然として不明である。第五に、SASH1のウェスタンブロット検出において非特異的な染色バンドが観察されており、これは抗体の特異性が最適でなかったためである可能性がある。本実験で使用した抗体はポリクローナル抗体であり、一般的にモノクローナル抗体と比較して免疫検出における特異性が低い。それにもかかわらず、これらの非特異的なバンドはSASH1タンパク質の知見や本研究の結論に影響を及ぼすものではない。PEにおけるP-EXOS-SASH1軸の機能的役割をさらに解明し、そのトランスレーショナルな可能性を評価するためには、in vivo実験、臨床検体分析、およびエクソソームカーゴの特性評価を組み込んだ今後の研究が必要である。

開示事項

本研究に利益相反はありません。

謝辞

本研究は、中国河北省衛生健康委員会の医学研究重点プログラム（No. 20210075）による助成を受けたものです。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI-1640培地Gibco11875085
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco16140071
エキソソーム除去FBSSystem BiosciencesEXO-FBS-50A-1
ペニシリン/ストレプトマイシンThermo Fisher Scientific, CN15140122
Lipofectamine 3000 トランスフェクション試薬 (P3000試薬含有)Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
Opti-MEM 低血清培地Thermo Fisher Scientific, CN31985070
SASH1 shRNAプラスミド (HuSH)origeneTL301836
SASH1 ORF発現プラスミドorigeneRC218866
空ベクトルコントロールorigenePS100001
逆転写キットThermo Fisher Scientific, CN4368814
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific, CNA46110
SASH1 プライマーSangon Biotechカスタム合成
β-アクチン プライマーSangon Biotechカスタム合成
細胞溶解バッファーBeyotimeP0013B
NanoDrop分光光度計Thermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
PVDFメンブレンThermo Fisher Scientific, CN88518
抗SASH1抗体ABclonalA15248
抗β-アクチン抗体Abcamab6276
HRP標識ヤギ抗ウサギ/抗マウス二次抗体BeyotimeA0208
ImageJ ソフトウェアNIH (パブリックドメイン)ImageJ
PKH67 緑色蛍光細胞リンカーキット (希釈液Cを含む)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN10711454001
DAPIBeyotimeC1002
共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM)LeicaLeica TCS SP8
ヒト IL-6 Quantikine ELISA キットR&D SystemsD6050B
ヒト IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISAR&D SystemsDY201
ヒト TNF-α Quantikine ELISA キットR&D SystemsDTA00D
マイクロプレートリーダーThermo ScientificMultiskan FC
In Situ 細胞死検出キット (TUNELアッセイキット)Roche11684795910
Triton X-100BeyotimeP0096
パラホルムアルデヒド (4%)BeyotimeP0099
蛍光顕微鏡OlympusBX53
冷却遠心機 (12,000 × g 対応)EppendorfEppendorf 5430 R
超遠心機 (120,000 × g 対応)Beckman CoulterOptima MAX-XP
R ソフトウェアThe R Foundationv4.2.1
GraphPad PrismGraphPad Softwarev10.0
Seurat (Rパッケージ)Satija Lab (オープンソース)v4.0.4
Harmony (Rパッケージ、バッチ補正)オープンソースv1.2.0
Scrublet (Pythonパッケージ、ダブレット検出)オープンソースv0.2.3
clustree (Rパッケージ)オープンソースv0.5.1
glmnet (Rパッケージ, LASSO)オープンソースv4.1.8
e1071 (Rパッケージ, SVM-RFE)オープンソースv1.7-14
xgboost (Rパッケージ)オープンソースv1.7.7.1
randomForest (Rパッケージ, Boruta)オープンソースv4.7-1.1
Gene Expression Omnibus (GEO) データベースNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
STRING データベースstring-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
Cytoscape ソフトウェアCytoscape Consortiumv3.10.4
ggplot2 (Rパッケージ)オープンソースv3.5.1
limma (Rパッケージ)オープンソースv3.58.1
pheatmap (Rパッケージ)オープンソースv1.0.12
ClusterProfiler (Rパッケージ)オープンソースv4.8.3
DOSE (Rパッケージ)オープンソースv3.28.2
ggpubr (Rパッケージ)オープンソースv0.6.0

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