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方法論記事

大腸菌の膜結合プロテアーゼFtsHおよびアダプターLapBによるLpxC分解のin vitroアッセイ

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DOI:

10.3791/71092

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2026年6月22日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

この記事について

サマリー

大腸菌 は主にLPS合成の最初の段階を触媒する脱アセチル酵素LpxCの分解を制御することでリポ多糖(LPS)生合成を調節します。このプロトコルの目的は、再構成されたAAA+プロテアーゼFtsHおよびアダプターLapBをプロテオリポソームで用いて、LpxCの感度の高い定量的 in vitro 分解アッセイを確立することです。

要約

本プロトコルは、再構成されたAAA+(多様な細胞活性に関連するATPase)、プロテアーゼFtsHおよびプロテオリポソーム中のアダプターLapBを用いた、LpxCの感度の高い定量的in vitro 分解アッセイを提示します。AAA+プロテアーゼはATP依存性を持つ分子機械であり、タンパク質の恒常性を維持し、細胞質や細胞膜内の多様な細胞プロセスを調節します。細胞質上の対応物と比較すると、膜結合型AAA+プロテアーゼは、 vitroでの活性再構成や測定に技術的な課題があるため、依然として不十分な特徴付けが残っています。ここでは、FtsH–LapB–LpxCシステムをモデルとして用いて、プロテオリポソームにおける蛍光ベースの分解アッセイを開発します。FtsHとLapBはプロテオリポソームに再構成され、ネイティブ膜環境を模倣し、LpxCは蛍光染料Atto488で共有結合標識されています。分解はプロテオリポソームと標識されたLpxCおよびATPを組み合わせて開始し、トリクロロ酢酸(TCA)によって終結します。成功したアッセイとは、TCA沈殿後に可溶性上清液の蛍光分率が時間依存的に増加し、LpxCプロテオリシスによって生成される蛍光ペプチド断片の放出に対応していることによって定義されます。この信号により、定義された条件下での初期劣化速度を直接定量化することが可能になります。従来のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ベースのアッセイと比較して、この方法は感度を大幅に向上させ、定量的動力学解析を可能にします。さらに、プロテオリポソーム系はアダプターやアンチアダプターなどのタンパク質成分や脂質組成がLpxC分解にどのように影響するかを体系的に調査することを可能にします。FtsH–LapB–LpxC系向けに開発されたものの、このアッセイは他の膜結合型AAA+プロテアーゼや基質にも容易に適応でき、膜関連プロテオ分解のin vitroでの一般的な研究プラットフォームを提供します。

概要

AAA+プロテアーゼは保存されたATP依存性分子機構であり、タンパク質の品質管理および調節プロテオリシスにおいて中心的な役割を果たします1,2。これらのマシンはAAA+ ATPaseドメインの六量体環を含み、ATPを加水分解し、認識し、展開し、基質を分解のために区画プロテアーゼドメインに転座させます。ClpXP3やLon4のような細胞質AAA+プロテアーゼは、確立されたin vitroアッセイで広く解析されていますが、膜結合型AAA+プロテアーゼは依然として比較的十分に理解されていません。このギャップは、膜タンパク質を定義された脂質環境に再構成し、そのプロテオ分解活性をvitroで定量的に測定する技術的な課題を大きく反映しています。この方法の全体的な目的は、膜結合プロテアーゼのプロテオ分解活性を調査するための感度の高い定量アッセイを確立することです。

FtsHは大腸菌における唯一の必須AAA+プロテアーゼであり、膜結合型AAA+プロテアーゼ5,6,7の典型的な役割を果たします。N末端の膜貫通ヘリックスによって内膜に固定されたFtsHは、多様な細胞質および膜関連基質を分解し、膜タンパク質の品質管理、ストレス応答、脂質恒常性を調節します。その最も特徴づけられた基質の一つはLpxCであり、これはリポ多糖(LPS)生合成の最初の段階を触媒する可溶性脱アセチル化合体です。FtsHによるLpxCの効率的な分解には、膜タンパク質LapBが必要であり、これはLpxCを特異的に認識し、プロテアーゼ14,15,16,17,18に届けるアダプターとして機能します。

生理学的に重要であるにもかかわらず、FtsH介在プロテオ分解のin vitroでの定量解析は限られており、特にLpxCのような細胞質基質に対しては限られています。従来のin vitro分解アッセイでは、洗剤ミセル13,19で精製されたFtsHが用いられ、膜固定プロテアーゼの膜環境を提供しません。さらに、劣化アッセイはしばしばSDS–PAGEベースの基質消失検出に依存しており、これは労力集約的でスループットが低く、動力学解析には感度が十分でないことがあります。近年では、FtsHをビセルに再構成して膜基質の分解を研究するために用いられ、これは洪希徳のグループ20によって先駆けられました。しかし、細胞質基質を分析するための類似のシステムは依然として存在しません。ここでは、ホンヒドクのビセル再構築をプロテオリポソーム再構成に適応させ、膜環境を模倣します。さらに、水溶性基板LpxCは蛍光標識されており、FtsH/LapB依存性のLpxC分解の動態をVitroで感度かつ定量的に測定することが可能です。

この方法は、水溶性基質のFtsH介在プロテオリシスを定量的に測定する必要がある場合に用いるべきです。既存のアプローチに比べていくつかの利点があります。第一に、基質の消失ではなく蛍光を用いたプロテオリシス生成物の検出により、感度とダイナミックレンジが大幅に向上し、プロテオリティック活性の定量的比較が容易になります。第二に、プロテオリポソームの使用により、FtsH機能に必要な膜の文脈を維持しつつ、タンパク質と脂質組成の正確な制御が可能になります18。最後に、FtsH–LapB–LpxCシステムを用いて開発されたこのプロトコルは、膜に結合したAAA+プロテアーゼおよびその細胞質基質に容易に適応でき、膜関連分解機構が必要です。

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プロトコル

1. Atto488を用いたLpxCのラベリング

  1. LpxC製剤
    1. 以前に報告されたLpxCタンパク質の発現および精製は18。精製済みLpxCのバッファーを、高解像度ゲルろ過カラム(例:Superdex 200 Increase 10/300 GLカラム)を用いて、50 mMリン酸バッファー(pH 7.6、6 mM NaH2PO4、44 mM Na2 HPO4、150 mM NaCl)に交換します。
    2. 4°Cで超音波カラムを用いてLpxCを最終濃度5 mg/mL以上に濃縮します。
  2. Atto488でLpxCをラベル付けする
    1. LpxC 0.5 mgを50 mMリン酸バッファー(pH 7.6)に希釈し、最終体積225 μLにします。1 Mの炭酸水素ナトリウムを25 μL加えて、pHを約8.3に調整します。
    2. Atto488反応性染料0.24mgを0.1 M重炭酸ナトリウムバッファー20 μLに溶解し、ストック溶液(0.012 mg/μL)を準備します。原料溶液2μLを0.1 M炭酸水素ナトリウムバッファー18 μLと希釈し、最終濃度0.0012 mg/μLを作製します。
    3. すぐにAtto488作動溶液4μLをタンパク質溶液に加えます(LpxCのモル比:Atto488は3:1に相当)。チューブをアルミホイルで包み、4°Cで2時間、優しく攪拌(18rpm)で培養します。
      注:Atto488のストックおよび作業用溶液はどちらも液体窒素でフラッシュ冷凍し、-80°Cで保存可能です。
  3. LpxC–Atto488の遊離染料からの分離
    1. PD-10脱塩カラムを超純水10 mLと平衡させ、その後50 mMリン酸バッファー15 mL(pH 7.6)を投与します。
    2. ラベリング反応混合物をカラムに塗布し、樹脂に完全に浸透させます。
    3. 50 mMリン酸バッファー5 mL、pH 7.6で溶出します。LpxC–Atto488(第一帯)と遊離Atto488染料(第二帯)に対応する2つの明確な帯が見えるはずです。最初のバンドから~0.5 mLのアリコット単位で分画を採取します。
    4. SDS-PAGEで溶出された画分を解析します。クーマッシー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色の前に紫外線照射下で蛍光を視覚化します。
    5. LpxC–Atto488を含む分画をプールし、標識されたタンパク質を約2 mg/mLまで濃縮します。
    6. マイクロボリューム分光光度計を用いてタンパク質濃度とAtto488濃度を測定することで標識効率を推定します。
      注:Atto488濃度(pmol/μL単位)とLpxC濃度(mg/mL単位)の比率が2〜5の範囲であれば、適切な標識レベルを示します。これは、標識後のAtto488とLpxCのモル比が1:15から1:6の範囲に相当します。
    7. LpxC–Atto488を1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブにアリコートし、液体窒素で急凍し、-80°Cで保存します。この時点でプロトコルは最大3ヶ月間一時停止可能です。
      注意:液体窒素は非常に冷たいです。適切な防護具(クライオグローブや目の保護具)を着用して扱ってください。

2. FtsH/LapBのプロテオリポソームへの再構成

  1. リポソームの調製
    1. 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)をクロロホルム中に100mgをガラス試験管に移します。溶媒を穏やかなN₂の流れで蒸発させ、その後真空下で一晩乾燥させます。
      注:POPCは相転移温度が~-2°Cであり、膜生物物理学、リポソームの製法、細胞モデルシステムで広く使用されています。
      注意:クロロホルムは目、皮膚、肝臓、腎臓、神経系に害を及ぼす可能性があります。取り扱い時には適切な防護具(手袋、目保護具、マスク)が必要です。フードの中でガラスのシリンジを使って扱います。
    2. 乾燥したPOPCフィルムにバッファーA(20 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl)を1,315 μL加えます。脂質を再懸濁させるには、1分間の水浴超音波検査と最大速度で1分間の渦巻きを交互に行い、合計約15分、または完全に分散するまで続けます。(最終脂質濃度:100 mM)
      注意:脂質再懸濁を改善するためには、水浴ソニックケーター内のガラス試験管の浸漬深度を調整して攪拌を最大化してください。再懸濁脂質は-20°Cで保存可能です。 この時点で、プロトコルは最大1ヶ月間一時停止可能です。
    3. リポソーム懸濁液を200μLの部分に分けて-20°Cで保存します。
  2. リポソームの押し出
    1. 200μLのリポソームアリコートを室温の水浴で解凍し、800μLのバッファーAで希釈して最終体積1mLにします。
    2. リポソームに液体窒素と室温の水浴を交互にして3回の凍結・解凍サイクルを行います。
    3. 注射器、2つのフィルターサポート、バッファーA付きの200nmポリカーボネート膜をすすいでください。ミニエクストルーダーを組み立て、リポソームを20回押し出します。
      注意:リポソーム懸存液は押出後に透明に見えるはずです。
    4. 1 mLの押出リポソーム懸濁液を3本のチューブ(1本あたり330 μL)に分け、それぞれ600 μLのバッファーAで希釈します。
  3. トリトンX-100膨張滴定
    注:Triton X-100は低臨界ミセル濃度(CMC)洗剤であり、多くの場合で最も効果的であることが証明されています
    注意:Triton X-100は主に重度の目の損傷、皮膚の刺激、摂取時に有害な影響を引き起こす有害な化学物質です。取り扱い時には適切な防護具(手袋や目を保護する)が必要です。
    1. 100μL(v/v)のTriton X-100を100μLの超純水と900μLの超純水を混ぜ、シェイカーで培養してTriton X-100を完全に溶解させて準備します。
    2. 分光光度計を用いて540 nm(A₅₄₀)でリポソームの吸収を測定します。
    3. 10%トリトンX-100の5μLアリコットを順次に加え、加えた後に優しく混ぜ、A₅₄₀を計量します。トリトンX-100をA₅₄₀が最大値に達するまで加え続け、さらに4〜5回トリトンX-100を加え、吸収度がピーク値の約60%まで低下します。
    4. 滴定曲線に基づき、リポソームを10%トリトンX-100を35μL加えて膨張させ、室温で1時間穏やかに攪拌しながら培養します。
  4. FtsH/LapBのリポソームへの再構築
    1. 前述のFtsHおよびLapBタンパク質を発現・精製します。
    2. 非極性ポリスチレン吸着剤(例:Bio-Beads SM-2)を10巻メタノールで1回、エタノール10巻で1回、超純水10巻で10回洗います。洗浄した吸着剤は4°CのバッファーAに保管します。
    3. トリトンX-100腫れたリポソームの各チューブごとに、500 mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)3 μL、22.5 μgのFtsH、22.5 μgのLapBを加えます。バッファーAを用いて総容量を1mLに調整し、RTで1時間穏やかに攪拌しながら培養します。
      注:プロテオリポソーム再構成21では、タンパク質と脂質の比率が1:20から1:200(wt/wt)として日常的に使用されていました。ここでは1:100の比率が使われています。
    4. 洗剤は非極性ポリスチレン吸着剤との連続培養で除去します:40mgをRTで0.5時間、次にRTで40mgを1時間、40mgを4°Cで一晩、最後に40mgを4°Cで1時間保持します。
    5. 短時間遠心分離機で非極性ポリスチレン吸着剤を4°C(400 × g 、3秒間)でペレットします。上清液を超音波遠心機チューブに移します。非極性ポリスチレン吸着剤をバッファーA1mLで洗浄し、洗浄液と上清液を混ぜます。最終体積~6 mLに追加バッファーAを加えます。
      注意:安全のため、超遠心分離機チューブには少なくとも6 mLの液体が必要です。
    6. チューブと超遠心機を250,000 × g 、4°Cで45分間、固定角度ローター(例:MLA-80)でバランスさせ、プロテオリポソームをペレットします。
    7. 上清液を廃棄し、プロテオリポソームペレットを70μLのバッファーAに1 mM TCEPを補給して再懸濁させます。
      注:最終的なプロテオリポソーム体積は約100μLです。
    8. プロテオリポソームを液体窒素で急凍し、-80°Cで保存します。
      注意:この時点でプロトコルは最大1ヶ月間一時停止可能です。
  5. プロテオリポソームのSDS-PAGE解析
    1. プロテオリポソームを十分に混合し、5 μLの2× SDSローディングバッファー(0.1 M Tris-HCl、pH 6.8、5% SDS、20% グリセロール、0.01% ブロモフェノールブルー、200 mM DTT)と混合します。
    2. プロテオリポソームサンプルを525 ngのFtsH(20 μL中の0.06 μM FtsH hexamerに相当)と共に4–20% SDS-PAGEゲルにロードします。
    3. ジェルにCBBで染めます。
    4. ゲルをスキャンし、各サンプルのFtsHバンド強度を定量化します。525 ngのFtsHに相当するプロテオリポソーム懸濁液の体積を計算します。

3. LpxC–Atto488の in vitro 分解

  1. 分解バッファー(50 mMトリス酢酸塩、pH 8.0、10 mM 酢酸塩、10 mM 酢酸塩、5 mM ATP、25 μM Zn酢酸塩、80 μM NaCl、1.4 mM βメルカプトエタノール)で、FtsH/LapBプロテオリポソーム(0.06 μM ActH、80 mM NaCl、1.4 mM メルカプトエタノール)で、FtsH/LapBプロテオリポソーム(0.06 μM FtsH)および0.5, 1, 1, 2, 20, 40 μM LpxC-Atto488を含む20 μL反応で試験体分解アッセ イを実施 します。
  2. 基質の各濃度を測定するために、70μLの反応を準備します。
    1. 20μLの分画を取り、5%トリクロロ酢酸(TCA)48μLと1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブですぐに混合して焼き入れします(0分)。第2分と第3分をそれぞれ10分と20分で焼き入れします。
    2. 並行して、プロテオリポソームを欠く対応する制御反応を準備し、背景除去を行います。
      注:信頼できる結果を得るためには、3回の再現測定が推奨されます。
      LpxC–Atto488を扱う際は光の被曝を最小限に抑えましょう。
      注意:TCAは非常に腐食性の強い化学物質で、重度の皮膚火傷、永久的な眼の損傷、吸入時に激しい呼吸器刺激を引き起こします。適切な防護具(手袋、目保護具、マスク)を着用してください。
  3. サンプルを37°Cで30分間培養してタンパク質を沈殿させ、その後室温で18,800 × g で遠心分離機で20分間行います。
  4. サンプルを中和するには、500 mM Tris-HCl、pH 8.8の60 μLチューブに50 μLの上清液を移します。よく混ぜて100μLを黒い96ウェルプレートに移します。プレートリーダーを用いて蛍光を測定し、励起は498 nm、発光は520 nmです。

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結果

in vitro 分解アッセイの感度を向上させるため、基板LpxCに蛍光染料Atto488が標識されました。Atto488のスクシニミジルエステル基は、軽アルカリ条件下でLpxCの一次アミノ基と効率的に反応します。Trisバッファーにはこの反応を妨げる一次アミンが含まれているため、Trisバッファーで精製されたLpxCは標識前にゲルろ過によりリン酸バッファーに交換されました。標識反応では、LpxCとAtto488のモル比3:1を用いて中程度の標識と過剰標識の回避を図りました(議論参照)。遊離染料を除去した後、LpxC–Atto488の画分をSDS–PAGEで解析し、紫外線の下で蛍光を可視化しました(図1A)。同じゲルをCBBで染色し、LpxCタンパク質の存在を確認しました(図1B)。蛍光帯とタンパク質帯の一致は、標識されたLpxC調製液から遊離染料が効果的に除去されたことを示しています(図1<...

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ディスカッション

このプロトコルの最初の重要なステップはLpxCのAtto488標識です。in vitro 分解活性を正確に測定するためには、適度なラベル付けが不可欠です。最適化実験に基づき、LpxCとAtto488のモル比が9:1から3:1の間で最適です。過剰なAtto488は過剰な標識を招き、LpxCの本来の状態を乱す可能性があります。これらの条件下では、FtsH単独によるLpxC–Atto488の分解差とFtsH/LapBによる分解差は著しく減少します(データ未表示)。逆に、標識が不十分だと、感度の高い運動学的測定には弱すぎる蛍光信号が発生します。このプロトコルを他の水溶性基質の劣化測定に適応させる際には、基質とAtto488のモル比を3:1とすることが有用な出発点となります。

FtsH/LapBのプロテオリポソームへの再構成効率の決定は、プロトコルの第二の重要なステップです。FtsH/LapBによるLpxC分解を定量的に評価するには、プロテオリポソーム内のFtsH濃度を決定する必要があります。このプロトコル...

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開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL マイクロ遠心管USA scientific1415-2500
200 nm ポリカーボネート膜Avanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGE自家製
アデノシン 5'-三リン酸 二ナトリウム塩水和物SigmaA26209
Atto 488 タンパク質ラベリングキットSigma38371
Bio-Beads SM-2Bio-Rad152-8920非極性ポリスチレン吸着剤
黒色 96ウェルプレートCostar3915
ブロモフェノールブルーSigma114391
クンマシーブリリアントブルー R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
エタノールSigma459844
フィルターサポートAvanti Polar Lipids610014
ガラスシリンジAvanti Polar Lipids610017
ガラステストチューブKIMBLE45066-16150
グリセロールAvantor2136-01
酢酸マグネシウム四水和物Sigma228648
メタノールSigma179337
マイクロ遠心機Thermo Fisher Scientific75-002-436
ミニ押出機Avanti Polar Lipids610000
MLA-80 ローターBeckman367096固定角ローター
プレートリーダーTecanInfinite M1000 PRO
POPCAvanti Polar Lipids850457C
冷蔵マイクロ遠心機Thermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
炭酸ナトリウムSigmaS6014
塩化ナトリウムSigmaS9888
リン酸二水素ナトリウムSigma38400100
リン酸二ナトリウムSigma567547
ソニケーターFisherbrandFB-11201
分光光度計SCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944高解像度ゲル濾過カラム
卓上超遠心機BeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
トリクロロ酢酸SigmaT6399
トリス ベースSigma252859
トリトン X-100SigmaT8787
超遠心管Beckman355647
超濾過カラムMilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 ミキサーScientific IndustriesSI-0236
酢酸亜鉛二水和物Sigma379786
β-メルカプトエタノールSigma444203

参考文献

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