乳がん診断における血漿miR-362-3pとドップラー超音波の組み合わせの診断効果

サマリー

乳がんの診断率は比較的低いです。4回表法を用いて、miR-362-3pとドップラー超音波を組み合わせて乳がんの診断価値を解析しました。ドップラー超音波とmiR-362-3pの組み合わせは診断効果を効果的に高め、乳がん診断の有望な方法を提供しました。

要約

乳がんは世界で2番目に多い悪性腫瘍であり、女性の命を深刻に脅かし、莫大な経済的負担をもたらしています。本研究は、miR-362-3pとドップラー超音波の組み合わせによる乳がん診断の価値を探ることを目的としています。本研究には合計182名の乳がん患者と147名の良性乳腺疾患患者が含まれていました。患者の血漿中のmiR-362-3pレベルはリアルタイム蛍光定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を用いて測定されました。カイ二乗検定を用いて、両患者群間のドップラー超音波のパラメータの違いを解析しました。受信者特性(ROC)曲線を用いて、miR-362-3p、抵抗指数(RI)、パルサリティ指数(PI)の診断効果を評価しました。乳がんにおけるドップラー超音波と血漿miR-362-3pの組み合わせの診断効率は、四重表法を用いて分析されました。乳がん患者ではmiR-362-3pのレベルが著しく低下しました。二次元超音波パラメータには有意な差がありました。miR-362-3p、RI、PIは乳がんの診断価値があります。これら3つの要因の診断価値はより高かった。超音波検査とmiR-362-3pの組み合わせは、乳がん診断における感度、正確性、陰性予測値を大幅に向上させました。 ドップラー超音波とmiR-362-3pの組み合わせは、乳がんの診断効率を高める可能性があり、非侵襲的かつ潜在的な補助診断ツールを提供する可能性があります。

概要

国際がん研究機関の統計によると、2020年に乳がんの発生率は肺がんを上回り^ました。乳がんは悪性腫瘍で、一般的に発生し、世界中の女性のがん関連死の主な原因の一つ^です。乳がんの適時診断は患者の予後に役立ちます。組織生検は乳がん診断のゴールドスタンダードです。しかし、これは侵襲的な診断の一種であり、初期乳がん患者には適用されません^。

ドップラー超音波は乳がんのスクリーニングおよび補助診断に一般的に用いられる画像技術^です。ドップラー超音波は結節の大きさ、血流信号、リンパ節転移の状態を正確に評価^{できます。}乳ドップラー超音波は、電離放射線がないこと、安全性、非侵襲性、そして繰り返し検査可能な検査能力といった利点から、乳がんのスクリーニングおよび診断において最も広く用いられる画像技術の一つ^{となっています。}しかし、低密度または小容量の乳がんを検出する際には、組織背景の影響を受けやすく、診断感度が著しく低下し、早期診断の臨床ニーズを満たすことが困難になります^。したがって、ドップラー超音波技術の限界を克服できる血漿バイオマーカーの開発が必要です。これら二つの方法の組み合わせが乳がん診断の感度を高めることができれば、臨床的価値と実用的な意義が大きくなります。

マイクロRNA(miRNA)は、約20から24ヌクレオチドの長さを持つ非コードRNA分子のクラス^です。miRNAの特徴の一つは、進化過程において高い保存性を持つことです。miRNAは広範な組織分布を持ち、さまざまなヒト組織細胞で特異的に発現するだけでなく、血液や唾液など複数の体液でも安定して存在^{可能です。}これらの分布特性は、非侵襲的診断マーカーの開発に利点をもたらします。機能的には、miRNAは3'未翻訳領域(UTR)^10,11に補完結合することでmRNAを分解し、細胞炎症反応、酸化ストレス、アポトーシス、増殖と分化などの重要な病理学的・生理学的プロセスに関与します¹²。多くの研究により、miRNA発現プロファイルの異常な変化が乳がんの発生および発症と密接に関連していることが確認されています^13,14。miRNA発現の異常は、がん遺伝子や腫瘍抑制遺伝子の発現ネットワークを調節することで、乳腺上皮細胞の悪性形質転換を促進することがあります。miR-362-3pは腫瘍の進行を抑制する典型的な因子です。複数の報告でmiR-362-3pが乳がんの進行を抑制することが示されました 15,16,17。Asiriらは、miR-362-3pの低発現が乳がん患者における予後悪化および総生存期間の短縮と密接に関連していると報告しました¹⁵。機構論的には、miR-362-3pはDEAD-box helicase 5(DDX5)を標的化し、がん細胞の増殖、浸潤および移動を促進することで乳がんにおいて抗腫瘍効果を発揮しました¹⁶。さらに、カン率いるチームは、miR-362-3pが乳がん組織で有意にダウンレギュレーションされていることも発見し、miR-362-3p発現の標的的調節は乳^{がん管理における}新たな治療戦略となる可能性があります。しかし、miR-362-3pが乳がんの早期診断マーカーとして機能するかどうかについては報告がありません。

本研究では、血漿中のmiR-362-3pの発現レベルを測定し、同時に乳がん患者のドップラー超音波のコア画像パラメータを解析しました。本研究では、血漿miR-362-3p発現レベルとドップラー超音波画像パラメータの応用価値を詳細に調査し、この統合診断アプローチが乳がんのスクリーニングおよび良性・悪性乳疾患の鑑別診断において有効であることを明確に示しました。

プロトコル

この調査はヘルシンキ宣言の原則に沿って実施されました。承認は山東第二医科大学臨床医学院付属病院倫理委員会(承認番号:wyfy-2023-ky-124)によって下されました。研究に関与したすべての被験者からインフォームド・コンセントが得られました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 実験対象

サンプルサイズの計算は、独立したサンプル t検定に基づくG*Power 3.1ソフトウェアを用いて実施されました。中程度の効果量(Cohen's d = 0.5、臨床観察研究で広く用いられる)、両側検定(α = 0.05)、および検密力(1−β)=0.95が設定されました。計算結果、各グループにつき少なくとも105名の参加者が必要であることが示されました。最後に、182名の乳がん患者と147名の良性乳房病変患者が登録され、両群の実際のサンプル数は最小必要サンプル数を大きく上回り、研究結論を支持する十分な統計的検出力を確保し、II型誤差のリスクを許容範囲内で制御しました。すべての参加者は統一された包含・除外基準に従い、厳格かつ連続的に登録されました。

2023年から2024年にかけて、すべての患者は山東第二医科大学臨床医学院付属病院に入院しました。良性病変:病理検査で非悪性病変が確認されました。乳がん:悪性腫瘍は病理検査で確認されました。全参加者から一晩の断食後に静脈血液サンプルが採取されました。静脈血液サンプルは抗凝固処理され遠心分離され、標準手順に厳密に従い血漿を分離し、その後長期保存のために−80°Cに移され、その後miRNA抽出に使用されました。すべての血漿サンプルは、miRNA分解を防ぐため、RNA抽出前に最大2回の凍結・解凍サイクルに厳格に制限されました。すべての患者は研究プロトコルについて十分に説明され、登録前に自発的に書面によるインフォームド・コンセントを提出しました。

乳がん患者の包含基準:(1) 病理学的に原発性乳がんと確認された患者。(2) 入学前に手術治療がないこと。(3) サンプル採取前に放射線治療または化学療法を受けていないこと。

良性乳腺疾患患者の包含基準:(1) 病理学的に良性と確認された乳房病変。(2) 他の全身性悪性腫瘍や前がん病変がないこと。(3) 妊娠せず、授乳もしていない。(4) 重度の急性感染症または慢性炎症性疾患がないこと。

乳がんおよび良性乳房病変患者の除外基準:(1)重度の乳房感染症または急性重篤疾患。(2) 重度の肝臓または腎機能障害、または自己免疫疾患。(3) 6か月以内にホルモン療法を受けた患者。

2. ドップラー超音波検査

患者の両側乳房はドップラー超音波を用いて4つの象限で徹底的に検査されました。2次元超音波スキャンを用いて、病変の特徴、境界、形状、内部エコー、後エコー波、アスペクト比を記録しました。カラ―ドップラーフローイメージングを用いて、病変の血流パラメータ(抵抗指数(RI)、脈拍指数(PI)、最大血流速度(V_max)を評価しました。血流信号は、以前に報告された分類システム¹⁸に基づいて評価されました:グレード0:血流信号なし;グレードI:血流信号が最小限;グレードII:血流信号の長さが病変直径の半分を超える;グレードIII:血流信号が豊富。

3. 乳がんの超音波診断における肯定的定義

これには(1) 曖昧な境界線;(2) 不規則な形状;(3) 内部エコーの不均一;(4) 後方エコーの弱化;(5) アスペクト比>1;(6) RI > 0.70;(7) PI > 1.50;(8) 最大血流量(Vmax)>18.00 cm/s;(9) 血流信号≥グレードII。上記の疑わしい基準のいずれかを満たす病変は超音波陽性とされ、怪しい特徴のない病変は超音波陰性と分類されます。

4. リアルタイム蛍光定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)

プラズマmiRNAは専用のmiRNA抽出キットを用いて抽出されました。成功裏に抽出されたRNAサンプルは、特殊なmiRNA逆転写キットを用いてcDNA合成に用いられました。miR-362-3pの逆転写反応条件:この反応の総体積は20μLでした。PCR反応手順は以下の通りです:(1) 混合物を37°Cで15分間インキュベート、(2) 逆転写反応を42°Cで50分間実施、(3) 酵素を95°Cで5分間不活性化。 製品は4°Cで保存されました。 qPCR反応条件:反応系の総体積は20μLでした。増幅条件は以下の通りに行われました:(1) cDNAを前変性させ、DNAポリメラーゼを95°Cで2分間活性化。(2) DNA鎖がアニーリングされ、60°Cで30秒伸長します。 上記の2つのステップは合計40サイクルにわたって実施されました。遺伝子の相対発現は式2^-(ΔΔCt)で計算されました。miR-362-3pの相対発現はU6によって校正されました。U6を内因性対照として使用することを正当化するため、プラズマコホートでBestKeeperアルゴリズムを用いてU6の安定性が評価されました。すべてのサンプルにおけるU6 Ct値の変動係数(CV)は2%未満であり、高い発現安定性を示しています。したがって、U6は本研究におけるmiR-362-3p発現の正規化の参照遺伝子として検証・選択されました。プライマーの下流シーケンスはキットによって提供されました。プライマーシーケンスは以下の通りです。

miR-362-3p:GCCGAGAACACTACATTCA。

U6:CTCGCTTCGGCAGCACATATACT。

5. 受信者動作特性(ROC)曲線

ユーデン指数を用いて、ROC曲線の感度および特異度値を計算することで、乳がん診断におけるmiR-362-3pの最適なカットオフ値を決定しました。統合診断モデルはSPSSの二値ロジスティック回帰を用いて構築され、miR-362-3p、RI、PIを独立変数として入力しました。Enter法では各被験者の複合診断の予測確率値を生成するために変数が含まれていました。予測確率(PRE)の公式は。ROC曲線はPREに基づいてプロットされました。デロン検定は、異なるROC曲線間の曲線下面積(AUC)値の違いを比較するために用いられました。

6. 結果パラメータの定義

主要なアウトカムパラメータは、乳がんに対する血漿miR-362-3pとドップラー超音波の複合モデルの全体的な診断効果であり、病理診断をゴールドスタンダードとしました。副次的アウトカムパラメータには、ドップラー超音波単独および血漿miR-362-3p単独の診断性能が含まれていました。

7. データ統計

miR-362-3pの発現レベルおよび2群のROC曲線は統計およびグラフ作成ソフトウェアを用いて解析されました。 t検定 は両群間の連続変数の違いを比較するために用いられました。カイ二乗検定と四重表法はSPSS 26.0を用いて解析されました。カイ二乗検定はカテゴリ変数の統計的差異を評価するために用いられました。2指数の組み合わせ(miR-362-3P + ドップラー超音波)が主要な解析とされ、臨床実践における定性的診断結論として定型的でした。乳房画像報告・データシステム(BI-RADS)分類から異常な特徴があれば、病変は陽性と定義されました。四重表法を用いて、ドップラー超音波とmiR-362-3pの統合診断の特異度、陽性中率、陰性中率、および精度を算出しました。ドップラー超音波とmiR-362-3pの診断結果には、真陽性(a)、偽陽性(b)、偽陰性(c)、真陰性(d)が含まれていました。計算式:感度 = a / (a + c);特異性 = d / (d + b);陽性的中率 = a / (a + b);陰性的予測値 = d / (d + c);精度 = (a + d) / (a + b + c + d)。3つの診断方法(miR-362-3p、超音波検査、複合診断)は、R×Cの結成表用にPearson χ² 検定を用いて実施されました。 P < 0.05は統計的に有意とされました。

結果

乳がん患者ではmiR-362-3pのレベルが有意に低下しました

182名の乳がん患者と147名の良性乳房病変患者の臨床ベースライン情報および臨床病理学的特徴を比較しました。詳細なデータは 表1にまとめられています。RT-qPCRは2つの患者群の血漿miR-362-3pのレベルを測定するために用いられました。結果は、乳がん患者における循環中のmiR-362-3p発現が良性乳疾患患者よりも著しく低いことを示しました(図1A)。ROC曲線解析により、miR-362-3pは乳がんと良性乳房病変の区別において良好な診断性能を示すことが示唆されました(図1B)。182名の乳がん患者は、miR-362-3pの発現量を中央値のカットオフ値に基づき、miR-362-3pの高発現サブグループとmiR-362-3pの低発現サブグループに分けました。さま...

ディスカッション

乳がんは悪性腫瘍の中でも最も一般的なタイプの一つであり、^{人間の健康を}脅かす主要な公衆衛生問題^{となっています。}高い発生率と死亡率は、患者の家族に深刻な心理的トラウマを与えるだけでなく、社会や経済にも大きな負担をかけています。ほとんどの乳がん患者は診断時点で局所浸潤または遠隔転移を経験しています^21,22。これにより治療の難しさが大幅に高まり、臨床現場での生存率が低下します。したがって、早期かつ正確なスクリーニングと診断が乳がん患者の予後を改善するための重要なステップです。

ドップラー超音波は乳がん検診、病変の質的診断、治療後の予後モニタリングの全過程で広く応用されています^23,24...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	USA	367861	静脈血の採取とmiRNA分析のための血漿調製用。
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	6チャンネルの96ウェルフルオロメトリック定量PCR機器で、光ファイバー導電とコールドCCDイメージングを採用し、各ウェルで遅延なしに蛍光を同期的に収集します。ダイナミックレンジは10桁に達し、従来のqPCRと高解像度溶解曲線（HRM）分析の両方に対応します。ソフトウェアはRDML形式のエクスポートをサポートし、研究と臨床検査の両方に対応し、遺伝子発現定量、SNPタイピング、メチル化分析などの実験で一般的に使用されます。
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Shanghai, China	KG0811	qPCR反応の準備と実施に使用されます。
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	miRNA抽出と逆転写中のサンプル保管、試薬調製、遠心分離に使用されます。
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Beijing, China	DP501	スピンカラムベースの技術を使用して、ヒト血漿サンプルからmiRNAを含む全RNAの分離と精製用。
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	ポリ(A)テーリング法による精製miRNAの第一鎖cDNAへの逆転写用。
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	SYBR Green Iベースの化学を用いたmiRNAの定量リアルタイムPCR検出用。
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Germany	4729692001	Roche LightCycler 480機器での定量リアルタイムPCRアッセイに使用されます。
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	周波数範囲5–14 MHzの高周波リニアアレイプローブで、乳房や甲状腺などの表在器官の検査用に特別に設計されています。高解像度と優れた組織コントラストを特徴とし、弾性描像法と自動乳房体積スキャンをサポートします。
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	リアルタイム3D/4Dイメージングと弾性イメージング機能をサポートするカラードップラー超音波診断システムで、腹部、心血管、婦人科および産科、乳房など複数の部門で広く使用されています。
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	96チャンネルの勾配PCR機器で、勾配温度最適化をサポートし、高温度制御精度を備え、cDNA合成と従来のPCR増幅に使用されます。