HEK-293細胞ベースのシステムにおけるSTING選別調査のための細胞フリーCOPII小胞再構成プロトコルの開発

サマリー

このプロトコルは、COPII小胞へのSTING組み込みを再構成するための最適化された細胞フリーシステムを記述し、ER輸出中の貨物選別の制御された生化学的分析を可能にします。

要約

cGAS–STING経路は自然免疫の中心的な構成要素です。活性化後、小胞体(ER)に常駐するタンパク質STINGはCOPII小胞にパッケージ化され、ゴルジ体に輸送されて下流シグナル伝達を開始します。このプロセスの重要性にもかかわらず、STINGをCOPII小胞に分類する分子メカニズムは依然として完全には解明されていません。ここでは、COPII小胞の in vitro 再構成のための最適化されたワークフローを示し、貨物選択の制御分析を促進します。HEK-293F懸濁細胞から高濃度細胞質(30–40 mg/mL)を製製し、半透膜化されたHEK-293T細胞を定義された膜源として生成する簡易な手順を組み合わせたスケーラブルな方法が示されています。従来の接着型セルベースシステムと比較して、このアプローチはスケーラビリティを向上させ、コストを削減し、再現性を高めます。STINGをモデルカーゴとして用いる場合、COPIIの小胞出芽およびカーゴの取り込みはウェスタンブロット解析によって検証され、定義された条件下で約20%の基礎包装効率が認められます。このシステムは、ヌクレオチド刺激を含む生化学的パラメータの制御操作を可能にし、貨物取り込みへの影響を評価できます。このプロトコルは、COPII媒介の貨物選別を調査するための堅牢かつ適応性の高いプラットフォームを提供し、さらにER輸出に関与する膜貫通タンパク質や調節因子の研究にも拡張可能です。

概要

cGAS-STINGシグナル伝達経路は、自然免疫系の基本的なメカニズムとして機能し、細胞質の二本鎖DNA(dsDNA)を感知して抗ウイルス応答を開始します。dsDNAを検出すると、酵素cGASは環状ジヌクレオチドcGAMPを産生し、これはSTING1,2に結合する第二のメッセンジャーとして働きます。重要なのは、STINGは定常状態下で小胞体(ER)に不活性な二量体として存在^{することです。}その活性化には、ERからゴルジ体への迅速かつ高度に調整された転座が必要です。STINGはゴルジ体で下流キナーゼであるTBK1およびIRF3を活性化し、タイプIインターフェロンおよび炎症促進サイトカイン4の産生に^{つながります。}

STINGの輸送は^ER5からのタンパク質輸出の汎用的な載体であるCOPII被覆小胞によって媒介されます。COPII被覆の組み立ては、小さなGTPase Sar1、内被いSec23/24複合体、外被いSec13/31複合体から成り、ER膜を小胞に変形させ、貨物^6,7を選択的にリクルートする役割を担っています。Sec22bはCOPII^小胞に分類され、COPIIの8のSec23/24複合体によって認識された構造的エピトープによって分類されます。その他のカーゴにはp24ファミリーやERGICマーカーERGIC-53があり、いずれも^9の選別にC末端の疎水性φCモチーフに依存しています。対照的に、リボフォリンI(RPN1)のような特定のERアンカータンパク質は小胞内に限定され、COPII小胞10を経由しないため、完全なER構造のマーカーとして機能します。したがって、細胞フリーCOPII小胞再構成実験では、Sec22bおよびp24がしばしばCOPII貨物と見なされ、リボフォリンは小胞製剤中のER汚染を監視するマーカーとして機能します。COPII輸送の一般的なメカニズムはよく解明されていますが、活性化されたSTINGをこれらの小胞に選択的に隔離させる具体的な分子手がかりは依然として不明です。これらの分類メカニズムを理解することは非常に重要です。なぜなら、STING輸送の調節障害は、乳児期発症のSTING関連血管症(SAVI)やCOPA症候群¹¹など、さまざまな自己免疫疾患や自己炎症性疾患と関連しているからです。しかし、これらの一時的かつ非常に動的なイベントを完全な細胞内で研究することは技術的に依然として困難です。

これらの課題に対応するため、COPII媒介による貨物選別の分子要件を検証するための最適化された細胞フリー再構成システムが開発されました。in vitro出芽アッセイは長らく細胞生物学¹²の定番手法でしたが、高品質な成分の調製にかかるコストと複雑さにより、その普及はしばしば制限されています。本研究では、HEK-293F懸濁細胞を経済的なアクティブ細胞質源として利用し、半透過HEK-293T細胞を堅牢な膜ドナーとして活用する効率的なワークフローを導入します。細胞フリーCOPII小胞再構成システムの全体的なワークフローは図1に示されています。 このシステムでは、Sec22bを陽性対照として小胞への貨物取り込み確認に用い、一方でRPN1を陰の対照としてER膜の汚染を監視・排除しました。STINGを概念実証カーゴとして用いるこの研究は、システムがSTINGソーティングの本質的な生化学的側面を効果的にモデル化していることを示しました。このプラットフォームは、STINGの選別を制御する細胞質因子や膜シグナルを特定するための多用途でスケーラブルなツールを提供し、多様な他の小胞輸送経路の研究にも応用が期待されています。

プロトコル

HEK-293F(RRID: CVCL_6642)およびHEK-293T(RRID: CVCL_0063)細胞株は北京協和医学院の細胞資源センターから取得されました。両細胞株は短タンデムリピート(STR)プロファイリングで認証され、マイコプラズマ汚染がないことが確認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

この研究には人間の参加者や脊椎動物は関与していません。したがって、倫理的承認は必要ありませんでした。すべての実験手順は機関のバイオセーフティガイドラインに従って実施されました。

1. HEK-293F細胞細胞質の調製

1. 100 mLの定義された哺乳類培養培地に1×10⁶ cells/mLのHEK-293F細胞を種子化し、1%ペニシリン・ストレプトマイシンを補給しました。細胞を500mLの円錐形フラスコで培養します。
2. 懸濁培養は37°Cで5%のCO₂を含み、シェイクインキュベーターで60時間培養します。
3. 細胞を300 × g で遠心分離し、4°Cで5分間採取します。 自動セルカウンターを使って合計セル番号を算出します。
4. 細胞ペレットを50mLの氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。遠心分離機で300 × g、4°Cで5分間。
5. 細胞ペレットを氷のように冷たいB88バッファー(20 mM HEPES、pH 7.3、ソルビトール250 mM、酢酸カリウム150 mM、酢酸マグネシウム5 mM)に再懸浮させます。
6. 氷上で細胞を溶除し、懸濁液を22ゲージの針を装着した5mLシリンジに通し、100回以上刺します。
7. 光学顕微鏡で細胞溶解を調べる。細胞の残骸は、4°Cで20,000 × g で10分間遠心分離して除去します。
8. 上清液を超音波遠心機チューブに移します。遠心分離機で 100,000 g× 4°Cで1時間使用。
   注意: 超遠心分離機のチューブが適切にバランスを取られ、機器の損傷や安全上の危険を防ぎましょう。
9. 澄んだ上澄液を採取します。3 kDa分子量カットオフ(MWCO)超ろ過装置を用いて、4,000 × g 、4°Cで試料を濃縮します。
10. ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。濃度を30〜40 mg/mLに調整します。
    注意: 液体窒素は適切な保護具を用いて取り扱い、極低温損傷を防ぎましょう。
11. 細胞質をアリコートで。アリコートを液体窒素にスナップ冷凍し、−80°Cで保存します(図2A)
    注意: 凍結から解凍のサイクルを2回以上避けてください。アリクォートは−80°Cで最大6ヶ月間保存します。

2. 半透湿HEK-293T細胞の製剤

1. 全身のヒトSTINGを15 mL DMEMで15 mL DMEMに15 mLの×^6細胞 10個の密度で発現するHEK-293T細胞をプレートし、胎児用牛血清10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を補足します。37°Cで5%のCO₂を含んで48時間孵育します。
2. 細胞は約60%の結合率で収穫します。
3. 培地を吸引し、10mLの氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。
4. 0.25%トリプシン-EDTAを2 mL加えます。室温で2〜3分間培養して細胞を剥離させます。
5. 200μLの大豆トリプシン阻害剤(1 mg/mL)を加えてトリプシン化を止めます。細胞を10mLの氷冷KHMバッファー(20 mM HEPES、pH 7.2、110 mM酢酸カリウム、2 mMアセテートマグネシウム)に再懸浮させます。
6. 細胞を250 × g で遠心分離して3分間ペレットします。上清液は捨てる。
   注意: デジトニンは有毒です。適切な個人用防護具を着用して、排気フードで取り扱いましょう。
7. 細胞を6mLの氷冷KHMバッファーに再懸浮させます。6μLのジトニンストック溶液(DMSOで40 mg/mL)を加えます。
8. 逆行で優しく混ぜます。氷で5分間孵化します。
9. 8mLのKHMバッファーを希釈したディジトニンを加えます。250 × g で遠心分離機で3分間、透過性のある細胞を採取します。
10. ペレットを14 mLの氷冷HEPESバッファー(50 mM HEPES、pH 7.3、90 mM酢酸カリウム)に再懸浮させます。氷で10分間孵化します。
11. 遠心分離機で250 × gで3分間加熱します。ペレットを1mLの氷冷KHMに再懸浮させます。Clバッファー(20 mM HEPES、pH 7.3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂)。
12. 遠心分離機は10,000 gで15秒 × 上清液は捨てる。
13. ペレットを50μL KHMに再懸浮させます。Clバッファー。BCAアッセイでタンパク質濃度を測定し、5〜7 mg/mLに調整します。

3. 細胞遊離COPII小胞再構成実験

1. 材料表に記載されたすべての試薬を準備してください。アリコートして−80°Cで保存します。
2. 110 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.2)、2 mM MgCl₂、プロテアーゼ阻害剤カクテル(1×)、0.2 mM GTP、およびATP再生系(40 mMクレアチンリン酸、0.2 mg/mL クレアチンホスホキナーゼ、1 mM ATP)を含む50 μL反応混合物を準備します。
3. cGAMPを最終濃度10μMに加えます。反応を室温で15分間培養します。
4. 50μgの半透過HEK-293T細胞を追加します。優しく混ぜてください。
5. 80μgのHEK-293F細胞質を加えて小胞形成を開始します。37°Cで45分間培養します。
6. 反応を氷に置いて芽吹を止めます。遠心分離機で12,000 × g で4°Cで20分間。
7. 小胞を含む上清液を採取してください。細胞小器官を含むペレットを保持してください。
8. 100,000 × g で4°Cで1時間、超遠心分離機で超清液を投与します。 小胞ペレットを30μLのタンパク質ローディングバッファーに再懸浮させます。
9. 95°Cで5分間加熱します。20,000 × g で遠心分離機で5分間沈殿物を除去します。
10. SDS-PAGを実行し、タンパク質をPVDF膜に移します。Sec22b、STING、RPN1に対する抗体を使ったプローブ。

結果

HEK-293F細胞質の調製過程で、細胞質を評価するために2つのパラメータが評価されました。HEK-293F細胞は高密度で培養され、高タンパク質濃度の細胞質抽出物が得られました。さらに、注射器を用いた溶解後の細胞破壊の程度を光学顕微鏡で評価し、適用条件下での効率的な細胞溶解が確認されました(図2B)。

半透過化HEK-293T細胞の生成において、培養は約60%のコンフルエンシーで収穫されました。この段階では、細胞内小器官が顕微鏡で観察されるように、よく分布し形態学的にも無傷であり、小胞再構成アッセイに適した膜源を提供していました(図3)。

この最適化されたシステムを用いて、STINGシグナルと小胞輸送の結合が検証されました。このワークフローで述べた通り、サンプルは全細胞小器官、小胞、上清各分割に分画され、その後の分析が行われました(

ディスカッション

重要な生化学反応のin vitroでの再構成は、細胞フリーシステムの基盤を築き、多くの画期的な発見に大きく貢献しています。これには、cGASを細胞質DNAセンサーとして特定したこと、アポトーシスにおけるシトクロムcの役割の解明、そして初のヒストン脱メチルラーゼであるJHDM1の発見(^16,17)が含まれます。このような定義された生化学的アプローチは、STING輸送における密接に結合したステップ、すなわち小胞体(ER)からの排出からゴルジ体への到達までの過程を解剖するのに特に強力であり、この過程は先天免疫シグナル伝達にとって重要です。

本研究では、STINGをモデルカーゴとして用いて最適化された細胞フリーCOPII小胞再構成システムが開発・検証されました。このワークフ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5mLの滅菌シリンジ	WEGO	V526273	機械式細胞溶解に使用
アデノシン5&プライム;三リン酸(ATP)	MCE	HY-B2176	水中100 mMの備蓄、pH 7.3、保存時はマイナス;80 & デグ;C
Adobe Illustrator	アドビ・システムズ・インコーポレイテッド	SCR_010279	概念図や回路図の作成に使用されます
ATP再生システム(10回)	—	—	クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、ATPを含むエネルギー再生混合物
BCAタンパク質アッセイキット	サーモ・フィッシャー	23227	比色タンパク質アッセイ
バイオレンダー	バイオレンダー	SCR_018361	概念図や回路図の作成に使用されます
BSA	バイオリジン	BN20815	ブロッキング試薬
二酸化炭素振動インキュベーター	志楚	ZCZY-CS8	温度、CO2、懸濁培養のための攪拌維持
CO2インキュベーター	サーモ・フィッシャー	3110	浸着培養のために温度とCO2を維持
従来型顕微鏡	オリンポス	CX43	細胞溶解および形態の評価に用いられます
クレアチンキナーゼ	ロッシュ	CKRO	バッファーに20 mg/mLのストックを保管し、マイナスで保存;80 & デグ;C
クレアチンリン酸	ロッシュ	CRPHO-RO	ATP再生システムの構成要素
デスクトップ遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	低速遠心分離に使用
デジトニン	シグマ	D5628	DMSOに40 mg/mLのストックを、マイナスで保存;20 & deg;C
DMEM	コーニング	10-013-CMR	HEK-293T細胞の培養培地
D-ソルビトール	サンゴン	A100691	1 Mのストック溶液を水に浸し、4 & 度で保存;C
ECL検出試薬	バイオリジン	BN16009	化学発光基板
電気泳動タンク	バイオ・ラッド	1658001	SDS-PAGE用の装置
胎児用牛血清(FBS)	コーニング	35-015-CV	血清サプリメント
固定角度ローター(TFT 80.2)	サーモ・フィッシャー	54456	超遠心分離用のローター
FreeStyle 293-Fセル	サーモ・フィッシャー	R79007	細胞質の調製に使用
ヤギ抗マウスIgG(H+L)	インビトロジェン	31430	HRP結合二次抗体
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)	インビトロジェン	31460	HRP結合二次抗体
GraphPad プリズム	GraphPadソフトウェア	SCR_002798	統計解析(一方行ANOVA)の実施および図4Dの定量棒グラフ生成に使用されます。
グアノシン5&プライム;三リン酸(GTP)	MCE	HY-113225	水中10 mMの貯蔵、pH 7.3、保存時はマイナス;80 & デグ;C
ヒトSTINGを発現するHEK-293T細胞	—	—	社内で生成;膜源として使用
HEPESバッファー(1 M、pH 7.3)	ビヨタイム	C0215	溶液調製用のバッファ成分
イメージングシステム	バイオ・ラッド	12003153	信号検出に使用
酢酸マグネシウム四水和物	ハンプトン・リサーチ	HR2-561	B88製剤用のバッファ成分
塩化マグネシウム六水和物	ハンプトン・リサーチ	HR2-559	バッファ成分
マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5420R	中速遠心分離に使用
マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5420	通常の遠心分離に使用
ナノドロップ分光光度計	サーモ・フィッシャー	840-317400	タンパク質定量に使用
OPM-CD Trans293 メディア	OPM	P82019	HEK-293F懸濁培養用の血清フリー培地
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシン(100回以上)	サービスバイオ	G4003	細胞培養用の抗生物質サプリメント
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)	サンゴン	A610425	プロテアーゼ阻害剤
ホスファターゼ阻害剤	ラボリード	C0104	タンパク質の脱リン酸化を防ぐ
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サービスバイオ	G4202	洗浄セル用バッファー
酢酸カリウム	シグマ	236497	1 Mのストック溶液を水に浸し、4 & 度で保存;C
電源供給	バイオ・ラッド	1645052	電気泳動のための電圧を供給
プロテアーゼ阻害剤カクテル、EDTAフリー	ロッシュ	4693132001	広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤混合物
PVDF膜	ミリポール	ISEQ00010	ウェスタンブロッティング用の膜
RPN1抗体(ウサギのmAb)	アブカム	AB197888	ERマーカー
SDS-PAGEゲル(4–20%)	—	—	タンパク質分離に使用
SDS-PAGEロードバッファ(5×)	ソーラービオ	P1040	タンパク質サンプル調製バッファー
Sec22b抗体(ウサギのmAb)	アブカム	AB181076	COPII貨物マーカー
大豆トリプシン阻害剤(SBTI)	シグマ	T9128	PBS中の1 mg/mLストック、保存はマイナス;20 & deg;C
STING抗体(ウサギ型単体抗がん)	CST	13647	一次抗体
TBSTバッファ	サービスバイオ	G0004	免疫ブロッティング用の洗浄バッファー
サーマルサイクラー	バイオ・ラッド	186-1096	加熱および孵化に使用
サーモスタティック金属浴	DLAB	5062102100	一定の温度を保つ
トランスファーセル	バイオ・ラッド	1703930	タンパク質移動に使用
トリプシン-EDTA(0.25%)	サービスバイオ	G4011	細胞剥離に使用
超遠心分離機	サーモ・フィッシャー	75000100	高速遠心分離に使用
超遠心分離機チューブ(2 mL)	サーモ・フィッシャー	54460	超遠心分離に対応可能なチューブ
超ろ過チューブ(4 mL、10 kDa MWCO)	ミリポール	UFC8010	細胞質濃度に使用されます