卵巣がん細胞における相同組換え修復のマーカーとしての核RAD51焦点の検出を目的とした免疫蛍光基アッセイ

サマリー

RAD51の核焦点は相同組換え(HR)活性のマーカーです。本論文は、がん細胞内のこれらの焦点を検出するための簡単な免疫蛍光法を記述し、HR機能の評価とDNA損傷因子への応答の前臨床研究を支援します。

要約

RAD51は相同組換え(HR)経路の中心タンパク質であり、DNA二本鎖断線(DSB)の正確な修復に不可欠です。DSB形成後、DNA末端切断は損傷部位におけるRAD51核タンパク質フィラメントのリクルートと組み立てを促進する単本鎖DNA基質を生成します。この過程により、核RAD51焦点が形成され、HR活動の広く受け入れられた機能的読み取り方法およびHR習熟度の代理マーカーとして機能します。HRの欠損は特に卵巣がんや乳がんで一般的なため、RAD51焦点形成の評価はDNA修復能力の評価や、プラチナ化合物やポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤などのDNA損傷治療への応答予測の重要なアプローチとして浮上しています。これらの治療効果はHR修復の状態に強く影響されます。本論文は、培養卵巣がん細胞におけるRAD51核焦点の検出および定量のための、シンプルで信頼性が高く再現性のある免疫蛍光ベースのプロトコルを記述しています。この方法は、イオン化放射線(IR)によるDNA損傷誘導、その後、固定、RAD51およびγH2AXに対する抗体による免疫染色、共焦点顕微鏡、そしてRAD51/γH2AXの共局在在焦点の手動定量解析を含みます。このプロトコルは基礎条件下または遺伝的・薬理学的摂動後に適用され、HR機能への影響を明らかにします。代表的な結果は、DNA損傷後にHRに熟能を持つ卵巣がん細胞においてRAD51焦点が強固に誘導されることを示し、RAD51の枯渇はDSBsの同等レベルにもかかわらず焦点形成を著しく減少させることを示し、アッセイ特異性を裏付けています。全体として、このプロトコルはHR能力を評価するための堅牢かつ再現性の高い機能的アッセイを提供し、前臨床および潜在的にトランスレーショナルながん研究に広く応用されています。

概要

DNA二本鎖切断(DSB)は、不正確な修復がゲノムの安定性を損なうため、DNA損傷の中でも最も深刻な形態の一つです。腫瘍の発生や細胞死に寄与する可能性があります(^1,2,3)。これらの脅威に対抗するため、細胞はいくつかのDNA修復経路を用いており、その中にはDSB2,4,5を修復する最も正確な機構と考えられている相同組換え(HR)が含まれます。誤りの多い修復経路とは異なり、HRは相同DNA配列をテンプレートとして用いて損傷部位の遺伝情報を復元します。したがって、HRは主に細胞周期のS期およびG2期に機能し、この時期には姉妹染色分体が修復テンプレートとして利用可能^{となります。}特に、HRは複製ストレスなどの内因性疾患や、電離放射線(IR)やDNA損傷性化学療法剤などの外因性損傷から生じるDSBの正確な修復に不可欠です^2,5。

RAD51はHR経路の中心的効果因子であり、HR媒介による^DSBs2,5修復中のホモロジー探索および鎖侵入において重要な役割を果たします。DSB形成後、DNA末端は切断を受けます。これはMRE11–RAD50–NBS1(MRN)複合体および関連因子によって開始され、3′の単一鎖DNAオーバーハングを生じます。これらの単鎖領域は最初に複製タンパク質A(RPA)で覆われ、二次構造の形成を防ぎ修復中間体^4,5,6を安定化させます。その後、HRはBRCA1、PALB2、BRCA2の協調作用によって開始され、切断されたDNA上にRAD51のリクルートとロードが促進され、RPAを置換してRAD51を含む核タンパク質フィラメント^4,5,6の形成を促進します。組み立てられたフィラメントは、姉妹染色分体内の相同DNA配列を探し、触媒鎖交換を促進し、損傷した^DNA4,5,6の忠実な修復を促進します。DSB部位でのRAD51の蓄積は、免疫蛍光7,8,9,10で検出可能な点状核焦点として顕微鏡的に現れます。これらの焦点の形成はHR機構の成功した関与を反映するため、RAD51焦点解析は細胞7,8,9,10におけるHR容量およびDNA修復能力を評価するための広く使われる機能的アプローチとなっています。重要なのは、このアッセイがDNA損傷後に細胞がHR応答を実行する能力を測定し、HR関連遺伝子やタンパク質の発現レベルだけに依存するのではなく、

HRの欠損はがんでよく観察され、特にBRCA1、BRCA2、RAD51パラログ、またはHRに関与する他の遺伝子に変化を持つ腫瘍で顕著であり、特に卵巣がんや乳がんで顕著です(^{4,11,12,13,14})。HR欠損症は、合成致死性の原理により、プラチナ療法などのDNA損傷因子やポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤に対する感度を高めるため、治療上重要な意味を持ちます 4,11,12,13,14,15 .したがって、HR活動を評価するための信頼性の高い機能的アッセイは、機構的研究とトランスレーショナル研究の両方において極めて重要です。

このプロトコルは、卵巣がん細胞のDNA損傷後に核RAD51焦点を検出・定量するための免疫蛍光法アッセイを記述します。このワークフローは、IRを用いたDNAのDSB誘導、その後RAD51およびγH2AXの免疫蛍光検出、共焦点顕微鏡による共局在在核焦点の定量化を含みます。このプロトコルは、HRに熟能を持つOVCAR-8細胞と獲得されたPARP阻害剤耐性ABT^R2細胞を用いて実証され、DSB形成後のHR活動を評価するための再現性のある機能的アプローチを提供します。RAD51焦点解析はHR活動の機能的指標として広く用いられていますが、利用可能な手法は特定の実験環境に焦点を当て、制御されたDNA損傷誘導、DNADBS形成の確認、アッセイ検証対照、標準化された画像ベースの定量化に関する詳細な指針が不足していることが多いです。さらに、ゲノム瘢痕解析、突然変異署名、遺伝子やタンパク質発現解析などのHR機能評価の代替手法は、HR状態の間接的な測定を提供し、DNA損傷部位へのRAD51を細胞内でリクルートする能力を直接評価するものではありません。DR-GFPのようなレポーターベースのアッセイはHR活動の直接的な測定を提供しますが、安定した遺伝子工学が必要であり、多くの実験モデルには容易に適用できません。したがって、ここで説明するワークフローは、IR誘導DNA損傷とRAD51/γH2AXの二重免疫蛍光染色を組み合わせ、DSB形成の検証と損傷したクロマチンへのRAD51のリクルートを同時に定量します。このアプローチは、培養がん細胞におけるHR能力の直接的な機能的評価に実践的で生物学的に関連性があり、広く応用可能な方法を提供しつつ、アッセイコントロール、検証ステップ、標準化された焦点定量手法を取り入れています。

プロトコル

本プロトコルで使用されるすべての材料および試薬は、製造者情報、カタログ番号、抗体希釈量を含む 材料表に記載されています。プロトコルの概要は 図1に示されています。

注:このプロトコルでは卵巣がん細胞株のOVCAR-8およびABT^R2が使用されており、以前に^{15、16、17、18、19}、²⁰で記載されています。OVCAR-8細胞は、もともと国立がん研究所のドミニク・スクディエロ博士から提供されたラリー・カルニッツ博士(メイヨークリニック)によって提供されました。ABT^R2細胞はメイヨークリニックのスコット・カウフマン医師から親切に提供^{されました。}ABT^R2はBRCA2のPARPi耐性誘導体です。BRCA2発現の回復により耐性を獲得した変異卵巣がん細胞株PEO1。BRCA2修復によりRAD51の負荷とHR活性が再確立されたため、ABT^R2細胞はHR熟能モデルの代表的な役割を果たします。細胞株の同一性は、文献で報告されている15,16,17,18,19,20の文献に基づき、出所と確立された特徴に基づいて検証されました。実験は、解凍後1か月以内に培養内に保持された低通過細胞(3–12)を用いて行われました。細胞株は6か月ごとにマイコプラズマ検出キットを用いてミコプラズマ汚染の有無を定期的に検査し、本研究で使用されたすべての培養液がマイコプラズマフリーであることが確認されました。

注意: パラホルマルデヒドは有毒であり、適切な個人用防護具を着用しながら認定された化学煙幕で準備・取り扱うべきです。ヒト由来の細胞株は、適切な封じ込め操作を用いて、機関のバイオセーフティ手順に従って取り扱うべきです。Triton X-100、取り付け媒体、ネイルポリッシュはメーカーの安全指示に従って取り扱うべきです。IRは訓練を受けた人員のみが、かつ機関の放射線安全方針に従って実施すべきです。化学廃棄物、生物廃棄物、放射線関連廃棄物は、地域の制度的および規制要件に従って処分します。

1. 細胞培養と維持

1. ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培養培地の培養細胞を、37°Cの加湿インキュベーターで8%胎児用牛血清を補足し、5%のCO₂を含んでいます。
   注:これらの培養条件は、OVCAR-8およびABT^R2細胞15,16,17,18,19の以前の研究で用いられたものと一致しています。これらの条件下では、両細胞株とも強靭な成長と再現可能なDNA損傷応答の表現型を示します。
2. 必要に応じて、最適化された^{実験条件に従って}摂動(例:遺伝子ノックダウン/ノックアウト)^{を行います。}
   注: このプロトコルでは、免疫蛍光解析前の遺伝子摂動の代表例として、siRNA媒介による RAD51 のノックダウンが示されています。
   1. 180μLのRPMI-1640培地に^6細胞5 個×10個、胎児用牛血清を添加して調製します。
   2. 20μMのsiRNA溶液を20μL(1回のトランスフェクションで2μMのsiRNA)を加え、優しく混ぜます。
      注: 以下のsiRNAを使用します:非標的制御ルシフェラーゼsiRNA(siLUC):5′-CUUACGCUGAGUACUCGA-3′; RAD51 siRNA(siRAD51.):5′-GGGAUUGUGUGAAGCCAA-3′。すべてのsiRNAはHorizon Discoveryから購入されました。
   3. セルの懸流を4mmの電気穿孔キューベットに移します。
   4. BTX ECM 830エレクトロポレーターを使用し、280 Vで10msパルスを2回実行する電気孔細胞。
   5. 細胞を完全な培養培地に移し、標準的な培養条件下で10cmの皿で24時間培養します。
   6. ステップ1.2.1–1.2.4で説明されているのと同じ条件でsiRNAの電気穿孔を繰り返します。
   7. 標準培養条件下で15cmの皿でさらに48時間培養します。
   8. ステップ2で説明した免疫蛍光アッセイのために細胞の一部をシードします。残りの細胞は免疫ブロッティングによるRAD51ノックダウン検証のために保存します。
   9. 免疫ブロッティングによるRAD51ノックダウンの検証
      1. 氷冷溶解バッファー内の溶融細胞には、50 mM HEPES(pH 7.6)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、10 mM NaF、30 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM Na₃VO₄、10 mM β-グリセロリン酸、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(1錠1錠/10 mLの溶解バッファー)を含んでいます。
      2. 溶合液を18,800 g で遠心分離し、4°Cで5分間× 上清液を新しいマイクロ遠心分離機チューブに移し、適切なタンパク質アッセイでタンパク質濃度を測定します。
      3. 適切な量のタンパク質解裂液を4/×レームリのサンプルバッファーと混合し、最終的な1×濃度にします。
      4. 最終濃度20%にβ-メルカプトエタノールを加え、SDS-PAGEの前に95°Cで12分間加熱します。
      5. SDS-PAGEによって等量のタンパク質を分離し、適切な膜に転送して免疫ブロット解析を行います。
      6. 膜を5%ミルクで室温で30分間、振ってブロックします。
      7. 膜を室温で3回(各5分)洗浄し、1×トリチウムバッファー入り生理食塩水(tween 20(TBST)を室温で振って洗います。
      8. 膜を4°Cで16〜18時間、振動しながら16〜18時間、ウサギ用ポリクローナル抗RAD51抗体(1:1,000希釈)または抗ACTIN抗体(1:1000希釈)で培養します。
      9. 膜を室温で1×TBST(各5分)で振って洗います。
      10. ホースラディッシュ過酸化酵素(HRP)結合抗ウサギまたは抗マウスのIgG二次抗体(希釈1:10,000)を室温で1時間、振って培養します。
      11. 室温で1×TBST(各5分)で膜を洗浄し、適切な化学発光検出法で免疫反応性バンドを検出し、非標的制御siRNAでトランスフェクトした細胞に対してRAD51の枯渇を確認します。

2. 細胞シーディング

1. 細胞が対数成長段階(約70〜80%の合流率)に達したら、培養培地を吸引し、無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を優しく洗浄して残留血清を除去します。
2. 細胞単層を覆うのに十分な0.25%トリプシン–EDTA溶液(例:T175フラスコ1〜2mL)を加え、37°Cで2〜5分間培養し、顕微鏡で細胞剥離を観察します。
3. 細胞が剥離されたら、FBSを含む完全培養培地を同量に加え、直ちにトリプシンを中和します。
4. 細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに集めます
5. 種まき前にトリパンブルー排除法とヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンターを用いて細胞の生存率と濃度を測定します。
6. 4 ×^{10 4} cells/mLの濃度で完全培養培地に単一細胞懸濁液を準備します。
7. 8ウェルガラスチャンバースライドの各ウェルに200μLのセル懸濁液をシードし、最終密度1ウェルあたり8,000セルを実現します。
8. 細胞の付着を可能にするために、37°Cで24時間、5%のCO₂で培養します。
   注: 種子をまく細胞の数は細胞の種類によって異なる場合があります。ピペッティングの変動を考慮し、少なくとも1つの追加ウェル分の余剰セル懸濁液を準備してください。各条件を重複または複数種まきして再現性を確保しましょう。心拍の薬理学的調節を望む場合は、細胞は夜間付着後(種まき後12〜16時間)後に処理されるべきです。シーディング密度は必要に応じて調整し、薬理学的薬剤が細胞増殖や生存可能性に与える影響を考慮し、治療および下流解析時に細胞が適切な合流に達するようにすべきです。HRは主に細胞周期のS期およびG2期に発生するため、培養を対数成長で維持し、過剰な結合を避けてください。細胞周期の進行を変化させる可能性のある治療を含む実験では、EDUの組み込み、DNA成分解析、その他の細胞周期測定が行われ、RAD51焦点の結果の解釈を容易にすることがあります。各実験に未処理(–IR)および照射(+IR)対照を含み、それぞれ基礎およびDNA損傷誘発によるRAD51焦点形成を確立します。siRNAを介した摂動を行う際には、非標的制御siRNA(例:siLUC)や標的特異的siRNA条件(例:siRAD51)を含みます。抗体最適化時には、非特異的染色および背景蛍光を評価するために、一次抗体なしおよび二次抗体なし対照群を推奨します。

3. IRによるDNA損傷の誘導

1. チャンバー上の細胞を6 Gy²¹ の線量でIRに曝露し、DNAのDSBを誘導します。
2. すぐにスライドを37°C、5%のCO₂で加湿インキュベーターに戻してください。
3. IR後6時間培養します。
   注: IRはRS-2000生物放射器を用いて供給され、160 kVおよび25.0 mA(棚位置5)で動作しました。細胞は室温で6 Gy単回量(約4.8 Gy/min)照射され、すぐに5%のCO₂を用いた37°Cのインキュベーターに戻され回収されました。照射装置はメーカーの推奨に従って定期的に校正され、すべての手順は機関の放射線安全ガイドラインに従って実施されました。IR後の6時間の潜伏時間は以前に^15、17、22に設定されています。最適なタイミングは細胞タイプによって異なるため、各細胞株ごとに最適化されるべきです。

4. 固定と透過化

1. 細胞を乱さないようにウェルから培養培地を慎重に吸引してください。
2. 細胞を1×PBSに1 PBSで12分間、新たに調製した3%パラホルムアルデヒドで固定します。
3. 固定剤を優しく吸引し、1孔あたり1×PBSの500μLでウェルを3回洗浄します。
4. 0.2%のトリトンX-100を室温で1×PBSに浸透させて12分間細胞を浸透させます。
5. 井戸を1×PBSで3回洗浄します。
   注: 各井戸の壁に溶液を加えたり取り除いたりすることで、固定、透過、洗浄の各工程を優しく行い、細胞剥離を最小限に抑えましょう。特に記載がない限り、1回の洗濯で1×PBSを500μL使用してください。

5. ブロッキング

1. 5%(w/v)の牛血清アルブミン(BSA)を1×PBSに溶かしてブロッキング溶液を準備します。
2. 細胞を室温で60分間ブロッキング溶液でキュベートし、非特異的な抗体結合を減らします。

6. 一次抗体培養

1. ブロッキング溶液を取り除き、細胞を1×PBSで3回洗浄します。
2. 適切な希釈濃度で一次抗体をブロッキング溶液で準備します。ウサギ用ポリクローナル抗RAD51抗体(1:1000)およびマウスモノクローナル抗リン酸化ヒストンH2AX(γH2AX)(1:1000)抗体が用いられ、γH2AXはDSBsのマーカーとして機能します^23,24。
3. 各ウェルに希釈した一次抗体溶液100μLを加えます。
4. 蒸発を防ぐために、スライドを室温で加湿チャンバーで16〜18時間孵育します。
   注:2つの一次抗体を同一溶液で組み合わせて同時に染色することができます。

7. 二次抗体培養

1. 適切な希釈で二次抗体をブロッキング溶液で準備します。Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG(1:350)がRAD51の検出に、Alexa Fluor 594結合ヤギ抗マウスIgG(1:350)がγH2AXの検出に用いられます。
2. 一次抗体溶液を吸引し、細胞を1×PBSで3回洗浄します。
3. 各ウェルに希釈した二次抗体溶液100μLを加えます。
4. スライドは暗闇の室温で1時間培養します。
   注意:2つの二次抗体は同時に検出するために組み合わせることが可能です。このセクション以降は、光が遮られた場所ですべての工程を行い、光漂白を最小限に抑えてください。

8. 核の着色処理と取り付け

1. Hoechst 33342溶液を1:1,000の希釈で1×PBSに調製し、核を染色します。
2. 二次抗体溶液を吸引し、1×PBSで細胞を一度洗浄します。
3. 希釈したHoechst 33342溶液で室温で90秒間細胞を培養します。
4. Hoechst 33342溶液を吸引し、1×PBSでセルを3回洗浄します。
5. 1×PBSを取り出し、上部チャンバーをガラススライドから外し、各ウェルに約25μLのアンチフェードマウントトを加えます。
6. 取り付けられたセルにガラスカバーを滑らせて、マウントと均一に接触するようにします。
7. 気泡を優しく取り除き、ネイルポリッシュで縁を密着させます。
   注:核のカウンターステインは核の基準を提供し、核RAD51およびγH2AX焦点の正確な位置特定と定量を可能にします。

9. DSBにおけるRAD51焦点のイメージングおよび定量化

1. 画像はすぐにスライドするか、暗闇のスライドボックスで4°Cの温度で保存し、分析が終わるまで保存します。
   注: 信号劣化や光漂白の可能性を最小限に抑えるために、できるだけ早く、できれば取り付け後1週間以内に画像を取得してください。
2. 適切なレーザーラインとフィルターセットを備えた共焦点顕微鏡で画像を取得します:核にはHoechst 33342(405 nm)、RAD51にはAlexa Fluor 488(488 nm)、γH2AXにはAlexa Fluor 594(561/594 nm)。
3. 細胞内構造の解像に適した高倍率対物レンズを用いて共焦点イメージングを行います。
4. γH2AXと共局在する離散的な核焦点を数えてRAD51焦点を手動で定量化する;γH2AXと共局在しない焦点は除外します。
   注: RAD51 siRNA処理後のIR誘導RAD51およびγH2AX核焦点の確認とRAD51シグナルの低減を定量解析前に抗体の性能を検証すること。形態が完全に残り、染色パターンが明確な核において、γH2AXと共局する離散的な核RAD51焦点のみを定量化します。びまん性または非核着色、非共局在するRAD51シグナル、重なり合うまたは多核細胞、有糸分裂細胞、アポトーシーシス細胞は除外します。各実験内で同一の画像設定を維持し、すべての条件で一貫した手動スコアリング基準を適用してください。各生物複製に対して、各条件で複数の視野から約50個の核を解析し、少なくとも3つの独立した生物学的複製を行います。適切な統計解析を用いて、核ごとのRAD51/γH2AX共局在在焦点の数を報告します。

10. 統計解析

1. 約50個の核からRAD51/γH2AXの共局在在焦点を定量化します。
2. 少なくとも3つの独立した生物学的複製からの平均 ± SD としてデータを提示します。
3. 適切な統計検定(例:2グループ比較にはペアなしの2尾学生t検定、複数グループ比較には一方向ANOVAなど)を用いて統計比較を行います
4. p . < 0.05を統計的に有意なものと考えてください。
5. GraphPad Prism(バージョン10.6.1)を用いて統計解析とグラフ生成を行います。

結果

IRはOVCAR-8細胞のDNAのDSBでRAD51焦点の形成を誘導します
HR活性を機能的に評価するため、IRによるDNADSB誘導後のHR熟練OVCAR-8卵巣がん細胞におけるRAD51焦点形成を調べました。アッセイ特異性を確立し、観察された焦点が正当なRAD51依存性HRイベントであることを確認するために、細胞は非標的制御制御ル シフェラーゼ siRNA(siLUC)または RAD51標的siRNA(siRAD51)のいずれかをトランスフェクトしました。IRに入る前に^15、16、17 。

IRがない場合、siLUCおよびsiRAD51トランスフェクトされたOVCAR-8細胞はγH...

ディスカッション

ここで述べる核RAD51焦点の免疫蛍光検出は、培養卵巣がん細胞におけるHR活性を評価する信頼性かつ機能的なアプローチを提供します。ゲノム解析やトランスクリプトミクス解析がHRの状態を間接的に推定するのとは異なり、RAD51の焦点形成は、細胞がDNAのDSB部位でコアHR機構をリクルートし組み立てる能力を直接反映します。したがって、このアッセイはDNA損傷後のHR能力の敏感な読み取りとして機能し、HR修復調節や治療反応を調査する機構的研究に適しています。このプロトコルではIRを用いて制御された再現可能なDSBレベルを誘導し、γH2AXの形成とその後のRAD51リクルートを促しました。選択された6 Gyと6時間の回復期間は、活性心拍修復中のRAD51焦点形成のピークを捕捉するよう最適化^{されました。}これらのパラメータは細胞タイプ、増殖速度、または基準DNA修復能力に応じて調整が必要になることがあり、プロトコルを他の細胞株モデルに適応させる際には最適化が推奨されます。

このア...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	自家製	NA	SDS-PAGE用分離ゲル
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	自家製	NA	SDS-PAGE用スタッキングゲル
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	日常的な移植および細胞播種の前に、接着細胞を剥がすために使用される。
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	1倍に希釈し、洗浄ステップ、ブロッキング溶液、抗体希釈、固定、および浸透に使用される。
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	自家製	NA	ゲル内のタンパク質サンプルを実行する
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	自家製	NA	ゲルから膜にタンパク質を転送する
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	緩衝液
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	SDS-PAGE用
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	PARPi耐性卵巣がん細胞株を獲得した
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	自家製	NA	細胞溶解緩衝液
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	ゲルの重合のための分子生物学およびフリーラジカル開始剤として使用される酸化剤
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	γH2AXフォーカスを検出するために使用される一次抗体。1：1000希釈で使用
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	相同組換え活性のマーカーとしてRAD51核フォーカスを検出するために使用される一次抗体。1：1000希釈で使用
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	免疫蛍光染色中に非特異的な抗体結合を減少させるために使用されるブロッキング溶液（PBS中の5％BSA）を調製するために使用される。
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	イメージングシステム
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	免疫蛍光イメージング、γH2AXフォーカス分析、RAD51フォーカス定量化、タンパク質の共局在、および3D画像の取得
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	自動セルカウンター
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	着色細胞を保護し、高解像度イメージングを可能にするために、実装されたサンプルの上に配置される。
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	哺乳類細胞への遺伝子送達用途に適した電気ポアレーションシステム
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	細胞の成長と生存をサポートするためにRPMI-1640（8％として）に追加する。
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	緩衝液
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	γH2AX一次抗体を検出するために使用される二次抗体。1：350希釈で使用
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	RAD51一次抗体を検出するために使用される二次抗体。1：350希釈で使用
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	統計分析、グラフ作成、データ可視化。
HEPES 1M	Corning	25060-C1	pH 7.2-7.6範囲でのpH保持緩衝液
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	核染色に使用された
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	ウェスタンブロッティングでマウス（β-アクチン）一次抗体を検出するために使用される二次抗体。
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	ウェスタンブロッティングでウサギ一次抗体（RAD51）を検出するために使用される二次抗体。
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	ブロッキング試薬
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	サンプル緩衝液
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	細胞培養がマイコプラズマ汚染がないことを確認するために定期的に使用される。
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	自家製	NA	SDS-PAGE用分離ゲル
Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8226	ウェスタンブロット分析でβ-アクチンを検出するために使用される一次抗体（ウェスタンブロット分析のローディングコントロールとして）。
Non-targeting control luciferase siRNA