方法論記事

ガラスカバースリップ上の接着性二次元細胞培養における、単一およびマルチプレックス免疫蛍光染色のためのコスト効率の高いワークフロー

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DOI：

10.3791/71114

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2026年9月1日

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1Laboratório de Vetores Virais (LVV), Centro de Investigação Translacional em Oncologia (CTO)/LIM24, Centro de Estudos e Tecnologias Convergentes para Oncologia de Precisão (C2PO), Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (FMUSP)

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、接着性の二次元細胞培養における単一および多重免疫蛍光（IF）染色の費用対効果の高いワークフローについて解説します。安価なガラスカバースリップ、標準的な24ウェルプレート、および抗体消費量を最小限に抑える低容量の染色条件を用いることで実験コストを削減しつつ、標準的な蛍光顕微鏡を用いてタンパク質の局在を調べるための代表的な手法を提供します。

要約

免疫蛍光（IF）顕微鏡法は、細胞の形態や細胞内組織を維持しつつ、単一細胞レベルの解像度でタンパク質の局在および共分布を可視化するために広く用いられている手法である。本プロトコルの目的は、標準的な実験器具を用いて、接着性2D細胞培養における単一および多重免疫蛍光染色の実用的かつ費用対効果の高いワークフローを提示することである。この手法は、一般的な24ウェルプレートに配置した安価なガラスカバースリップ上で細胞を培養することに基づいており、一次抗体のホスト種の使い分け、スペクトルの異なる蛍光色素、および多重IFの解釈性を担保するためのコントロール条件（一次抗体なし、抗体なし、単一染色、およびクロストークコントロールを含む）を導入することで多重化を実現している。また、信号品質を損なうことなく試薬および抗体の消費量を削減するために、少量の液量での染色ステップを採用している。このワークフローでは、特殊なイメージングプレートやチャンバーを必要とせず、日常的な広視野または共焦点蛍光顕微鏡での観察が可能である。総じて、本プロトコルは、接着性細胞培養におけるタンパク質の局在および共分布を代表的に評価するための、簡便で実用的な免疫蛍光ワークフローを提供する。他の細胞種や抗体パネルに適応させる場合は、抗体のバリデーション、固定および透過化条件、蛍光色素の選択、顕微鏡およびフィルターセットとの適合性など、ターゲットに応じた最適化が必要である。

概要

免疫蛍光（IF）顕微鏡法は、固定細胞におけるタンパク質の細胞内局在、相対的な量、および共局在を可視化するために広く利用されており、これにより分子マーカーを細胞形態や細胞内コンテキストに結びつけることができる1,2。バルクでの読み取り（例：免疫ブロッティング）や解離的なシングルセルアッセイ（例：フローサイトメトリー）とは異なり、IFは細胞の空間的組織化を維持するため、細胞間の表現型の不均一性や、シングルセル解像度での細胞内タンパク質分布の変化を評価するのに特に有用である3,4,5。実験的な問いにおいて、複数のマーカーを同時に評価する必要性が高まっているため、マルチプレックスIFを用いることで、同一検体内で2つ以上の標的を同時に検出することが可能となる。これは一般的に、異なる宿主種で作製された一次抗体と、スペクトル的に異なる蛍光色素を組み合わせることで実現され6（図1）、直接および/または間接的な検出戦略が用いられる（図2）。しかし、マルチプレックス化には、特に抗体の交差反応性とスペクトルのクロストークという重要な技術的課題が伴い、慎重なパネル設計と厳格なコントロール条件下で対処しなければ、結果の解釈可能性が損なわれる可能性がある7,8。

この手法の全体的な目的は、免疫蛍光法で検証済みの抗体に広く適用可能であり、接着性2D培養のルーチンイメージングに最適化された、実用的かつ低コストなワークフローを提供することです。マルチプレックス化は、ホスト種の分離、分光的に異なる蛍光色素、および背景レベルと染色の性能を検証するコントロール群によって実装されます9,10。特殊なチャンバー付きスライドではなく、標準的な24ウェルプレートに12 mmのガラスカバースリップを使用することで、このワークフローでは専用の高コストな消耗品を避け、ほとんどの細胞培養ラボで標準的に在庫されている材料を採用しています。また、このワークフローでは、比較可能なチャンバー付きカバースリップ形式（通常300–500 µL/cm2を必要とする11,12）よりも、単位成長面積あたりの染色液の使用量が大幅に少なくなっており（≈1.13 cm2に対して150 µL、すなわち≈133 µL/cm2）、これにより面積あたりの抗体および試薬の消費量を約2〜4倍削減できます。したがって、本プロトコルは、標準的な広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて、細胞骨格および核の対比染色とともに、マーカーの局在と共分布の定性的なマルチターゲット評価をサポートします。このワークフローは、ホスト種の分離と分光的な区別にに基づいた従来の固定細胞マルチプレックスIFを目的としており、反復的または高次元のマルチプレックスアプローチ向けに設計されたものではありません。

プロトコル

本研究では、ヒト被験者または動物実験 subjects は使用していません。すべての実験は、公的細胞バンク（Banco de Células do Rio de Janeiro、Cat. No. 0276）から入手した確立細胞株であるD17イヌ骨肉腫細胞株を用いて実施されました。したがって、倫理委員会の承認は必要ありませんでした。

1. 細胞株の維持

  1. 使用する細胞株に適した完全培地を用い、標準的な培養条件（37 °C, 5% CO₂、加湿インキュベーター）で接着細胞を維持する。
    注：代表例として、イヌ骨肉腫細胞D17（Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276）を、10% 胎児牛血清（FBS）および 1% 抗生物質・抗真菌剤を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) で維持し、trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) を用いてコンフルエンスが 70–80% に達した時点で継代し、検証済みの継代範囲（例：継代数 5–20）内で使用する。
  2. 検証済みのマイコプラズマ検出アッセイを用いて、実験前にマイコプラズマ陰性であることを確認する。

2. 24ウェルプレートとガラスカバーガラスの準備

注：カバーガラスの表面は、70%エタノールに浸漬して洗浄してください（5分間、これを3回繰り返す）。×以下に述べるいずれかの方法で滅菌する前に（処理を行い）、滅菌後、カバーガラスは使用時まで密閉容器に入れて室温で保存してください。

  1. 清潔な12 mmの円形ガラスカバースリップをガラス製ペトリ皿（またはカバースリップホルダー）に入れ、オートクレーブ滅菌する。あわせて、先みの細い金属製ピンセットもオートクレーブ滅菌する。
  2. 代替法：使用前に、カバーガラスとピンセットを70%エタノールで洗浄し、自然乾燥させた後、バイオセーフティキャビネット内で紫外線（UV）照射による表面除染（30分間）を行う。滅菌済みのカバーガラスは、使用時まで密閉容器に入れて室温で保存する。
  3. バイオセーフティキャビネット内で、滅菌済みピンセットを使用して、24ウェル組織培養プレートの実験群に指定された各ウェルに、滅菌済みカバーガラスを1枚ずつ移します。
  4. オプション：使用する細胞種に応じて必要な場合は、メーカーの指示または確立されたラボのガイドラインに従い、カバーガラスに接着促進コーティングを施してください。
    注：コーティング剤の選択肢（ポリ-L-リシン、コラーゲンI、またはフィブロネクチン）およびその作動濃度は、以下に記載されています。 材料一覧表ガラス上で培養されるほとんどの付着性細胞株では、未コーティングの滅菌済みカバーガラスで十分です。コーティング成分が抗原性を持つ可能性があるため、選択するコーティング剤はパネル内のどの抗体とも交差反応しないものである必要があります。
  5. カバーガラスにコーティングを行った場合は、過剰なコーティング液を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄した後、細胞を播種する前にバイオセーフティキャビネット内でカバーガラスを風乾させる。

3. 実験群

  1. マルチプレックス設計に適した一連のコントロールを含めます。
    注：抗体なしコントロール（一次抗体および二次抗体のいずれも使用しない）は、固有の自家蛍光を明らかにします。また、一次抗体なしコントロール（一次抗体を含まない二次抗体カクテル）は、すべてのチャネルにおける非特異的な二次抗体の結合およびバックグラウンドを同時に評価します。本プロトコルではスペクトルが完全に異なる二次抗体を使用するため、この単一のコントロールにより、各二次抗体がそれぞれのチャネル内で独立して評価され、各蛍光色素ごとの二次抗体のみコントロールと同じ目的を果たします。各一次抗体と二次抗体のペアを個別に適用する単染色コントロールは、マルチプレックスでの組み合わせ前に各抗体の性能を検証し、マルチプレックス条件と比較することで、各蛍光色素ペアのスペクトルのクロストークを評価することを可能にします。可能な限り、標的抗原を発現しているポジティブコントロールを使用して、アッセイの性能を確認します。

4. カバーガラスへの細胞播種（プレーティング）

  1. バイオセーフティーキャビネット内で、トリプシン（またはその他の適切な解離方法）を用いて細胞を剥離し、中和後、完全培地で再懸濁する。
  2. 自動細胞計数器または血球計数器を用いて細胞数を計測する。
  3. 細胞を6 × 104–1 × 105 cells/mLに希釈する。
  4. 1ウェルあたり0.5 mLの細胞懸濁液を添加する（最終濃度：3 × 104–5 × 104 cells/well）。
    注：必要に応じて、滅菌済みピペットチップを使用して、カバーガラスを傷つけないように注意しながら、ウェルの底に平らに密着させる。
  5. 細胞が接着し、目的のコンフルエンスに達するか、あるいは実験上のタイムポイントに達するまで、標準条件（37 °C, 5% CO₂）でインキュベートする。

5. 細胞処理（任意）

  1. 実験計画に従って処理のタイミングを選択します。処理には、適用に応じて、薬理学的治療、サイトカイン刺激、標的遺伝子の発現を誘導またはノックダウンするための遺伝子操作、またはその他の実験的介入を含めることができます。
  2. コントロール群と処理群を識別するために、ウェルにラベルを貼ります。
  3. 規定の時間ポイントまでインキュベートします。過成長はバックグラウンドを増加させ、形態を損なうため、過剰なコンフルエンスを避けてください。
    注：設計上、播種直後に固定する必要がある場合を除き、細胞は固定前にカバーガラスに接着している必要があります。
  4. 迅速に分泌される標的（例：サイトカイン）の場合、固定前にブレフェルジンA（BFA）を最終濃度1–10 µg/mL（通常は5 µg/mL）で培地に追加し、37 °C、5% CO₂で4–6時間インキュベートします。
  5. BFAを含む培地を除去し、直ちに「固定」のステップに進みます。

6. 免疫蛍光染色

注：固定以降は、無菌操作は不要です。染色はベンチ上で行い、「CAUTION」と記載された試薬を取り扱う場合は常に化学薬品用ドラフトチャンバーを使用してください。サンプルをいかなる時点でも乾燥させてはいけません。吸引時は薄いバッファーの膜を残し、直ちに次の溶液を加えてください。

  1. 固定（いずれかを選択）：
    注：固定液は、標的の局在およびエピトープの感受性に応じて選択します（「考察」を参照）。パラホルムアルデヒド（PFA）（パラホルムアルデヒドから調製したホルムアルデヒド）は、ほとんどの標的に適しており、ファロイジンと併用可能です。一方、メタノールは特定の核内またはリン酸化エピトープに有効な場合がありますが、F-アクチンの染色は阻害されます。
    1. PFA固定（ほとんどの標的に推奨）：
      1. 培地を吸引し、Tris緩衝生理食塩水（TBS）（0.5 mL/ウェル）で穏やかに1回洗浄する。
      2. PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で調製した4% PFAを（0.5 mL/ウェル）加え、室温で10分間インキュベートする（≈25 °C).
      3. PFAを吸引し、3回洗浄する× TBSで洗浄します（速やかに吸引し、ウェルを乾燥させないようにしてください）。
        注意：警告：PFAは毒性があり、発がん性の可能性があります。PFA溶液の取り扱いは、適切な個人用保護具（実験衣、手袋、および眼の保護具）を着用し、認定された化学薬品用ドラフトチャンバー内で行ってください。吸入および皮膚への接触を避け、廃棄物は施設内の化学物質安全指針に従って処理してください。
  2. あるいは、メタノール固定（一部の核抗原や特定のリン酸化エピトープに有用）：
    1. 100%メタノールを－まで予め冷却しておく。20 °C.
    2. 氷冷したメタノールを細胞に直接添加し（0.5 mL/ウェル）、−20℃で5分間インキュベートする。20 °C.
    3. 洗浄3× TBSで洗浄する（速やかに吸引し、ウェルを乾燥させないこと）。
      注：メタノール固定後、さらなる透過処理は不要な場合があり、抗体またはエピトープに応じて最適化する必要があります。メタノール固定は膜エピトープを損傷させ、フルオロフォア標識ファロイジンによるF-アクチン染色の妨げとなる可能性があります。注意：メタノールは毒性があり、揮発性で、極めて引火性が高い物質です。換気の良い場所または化学薬品用ドラフトチャンバー内で取り扱い、適切な個人用保護具を着用し、裸火や熱源から遠ざけてください。任意の停止点：固定後、サンプルを以下に保存してください。 4 °C 低濃度の固定剤を含むPBS（例：0.1% PFA含有PBS）中で最大1週間保存し、各抗原について保存期間の妥当性を検証してください。
  3. アルデヒドのクエンチ（任意）
    1. 室温で5分間、TBSに溶解した50 mMグリシン（0.5 mL/ウェル）とともにインキュベートする（≈25 °C).
    2. 洗浄3× TBS + 0.05% ポリソルベート20を用いて。
      注：グリシンは、PFA固定後に残存する遊離アルデヒド基を中和し、固定に起因する自家蛍光を低減させ、抗体染色の特異性を向上させます。
  4. 透過処理
    1. 膜タンパク質を標的とする場合は、透過処理を省略してステップ6.5.1に進んでください。
    2. 細胞内または核内タンパク質を標的とする場合は、TBSで希釈した0.1～0.3%の非イオン性界面活性剤（0.5 mL/ウェル）を用いて、室温で5～10分間透過処理を行います（≈25 °C).
    3. 洗浄3× TBS + 0.05% ポリソルベート20 (TBST)を用いて。
      注：オクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤の濃度および処理時間は、標的に合わせて最適化してください。適切であるかどうかの判断基準は、正しいコンパートメントでのシグナル、形態の維持、明確なF-アクチン、および低いバックグラウンドです（「考察」を参照）。サポニンを使用する場合、その後のすべての抗体溶液および洗浄バッファーにサポニンを添加し続けてください。注意：オクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤は、吸入または皮膚への接触により有害であり、眼刺激を引き起こす可能性があります。手袋を着用して取り扱い、エアロゾルの発生を避けてください。
  5. ブロッキング
    1. ブロッキング溶液（5% 牛血清アルブミン (BSA)）を1ウェルあたり0.5 mL加える。 （TBS中で）30分間室温でインキュベートし（≈25 °C).
    2. ブロッキングバッファーを吸引除去する。
    3. （洗浄せずに）直接一次抗体反応へ進みます。
  6. 一次抗体反応
    注：一次抗体および二次抗体の希釈倍率は、タイトレーションによって経験的に決定します（「考察」を参照）。
    1. 0.05%ポリスルベート20および1%BSAを含むTris緩衝生理食塩水（TBST-BSA）を用いて、シングルまたはマルチプレックスの一次抗体パネルを調製します。 1%)を用い、各ターゲットに対して最適化済みの抗体濃度を使用して。
    2. マルチプレックス免疫蛍光染色では、異なるホスト種に由来し、それぞれ異なる抗原を標的とするすべての非標識一次抗体（例：マウス抗インターフェロン-β (IFN-β) + ウサギ抗p14ARF抗体 + ヤギ抗アクチン抗体)を混合し、単一の抗体カクテルとする。
    3. 追加 150 µL ウェルあたりに添加し、カバースリップ全体が抗体溶液で完全に覆われていることを確認します。
      注：少量の液量での蒸発を防ぐため、プレートを加湿チャンバー（例：湿ったティッシュを入れた密閉ボックス）内でインキュベートします。
    4. 室温で1.5時間インキュベートする（≈25 °C) または 12〜16時間、以下の条件で 4 °C.
    5. 洗浄3× 室温で各3分間、TBSTで（≈25 °C）、各洗浄後、速やかに吸引してください。
  7. 二次抗体のインキュベーション（および、該当する場合は直接標識された一次抗体のインキュベーション）
    注：このステップ以降、光退色を防ぐため、サンプルは遮光して保管します。クロストークを最小限に抑えるため、二次抗体および直接標識された一次抗体には、スペクトル的に異なる蛍光色素を使用します。また、非認知的一次抗体への結合を最小限に抑えるため、種特異的な高度クロス吸着二次抗体を使用します。核および細胞骨格マーカーを含む蛍光色素パネルの設計、および顕微鏡の励起・蛍光波長の適合性については、「考察（Discussion）」で詳述します。
    1. 事前に最適化した濃度を用いて、二次抗体を1% TBST-BSA溶液で希釈します。マルチプレックス検出を行う場合は、使用した一次抗体の宿主種に対応するすべての二次抗体（宿主種につき1種類の二次抗体）を単一のカクテルとして混合します。
    2. 追加 150 µL 1ウェルあたり、カバーガラス全体が完全に覆われるようにしてください。
    3. 室温で1時間インキュベートする（≈25 °C).
      注：パネルに1つ以上の直接標識一次抗体が含まれている場合は、それらを二次抗体カクテルと一緒に加え、室温でのインキュベーション時間を1.5時間（約 25 °C).
    4. 洗浄 3× 室温でそれぞれ3分間、TBSTで（≈25 °C）、各洗浄の直後に速やかに吸引します。

7. 核の対比染色およびf-アクチン染色

  1. TBSで希釈した核対比染色剤Hoechst 33342（1:5000）を加え、室温で15分間インキュベートする（≈25 °C）、遮光して保存します。F-アクチンを抗アクチン抗体ではなくファロイジンで標識する場合は、同溶液にファロイジン（1:400）を加えてください。
  2. 洗浄3× TBSTで洗浄し、各洗浄後には速やかに吸引してください（ウェルを乾燥させないこと）。
  3. 回収または封入までカバーガラスを浸漬状態に保つため、各ウェルにTBSを0.5 mL添加する。

8. カバーガラスの回収とスライドへの封入

  1. カバーガラスがTBSに浸かっている状態で、細い針またはメスの先端をカバーガラスの端の下に差し込み、片側が部分的に持ち上がるまでゆっくりと押し上げます。精密ピンセットでカバーガラスを掴み、ウェルから取り出します。
    注意：カバーガラスが浸かっていない状態で取り出そうとすると、表面張力によってウェルの底に強く密着し、破損のリスクが高まる可能性があります。
  2. ピンセットでカバーガラスを保持し、バキュームアスピレーターまたは吸水紙を用いて、端から余分なTBSを慎重に吸い取ります。細胞が付着している面には触れないようにしてください。
    注意：残留液体が多いと封入剤が希釈され、画像の鮮明度やコントラストが低下するため、余分な液体は取り除く必要があります。
  3. 少量の封入剤（≈3 µL）を滴下した清潔なガラススライドの上に、カバーガラスの細胞面を下にして置きます。
    注意：市販の自己硬化型退色防止剤または自家製80% glycerol/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 封入剤が使用可能です。グリセロールベースの封入剤は透明なマニキュアで封印し、核染色剤を含まない封入剤は対比染色後に選択します。保存期限および蛍光色素の安定性に関するガイドラインは、「考察」の項に記載しています。
  4. 画像取得前に、スライドを遮光した状態で水平に≈24 hの間静置し、硬化させます。

結果

このプロトコルでは、ガラスカバースリップ上で培養された接着性イヌ腫瘍細胞の単一および多重免疫蛍光染色を行い、細胞形態を維持しながら、核、細胞質、および細胞骨格のマーカーを同時に可視化します。代表的な結果を図3.に示します。

成功した実験では、遺伝子操作（セクション5.1）によりイヌp14ARFおよびイヌIFN-βを発現するように構築されたD17イヌ骨肉腫細胞において、背景染色が低く、非特異的な染まりも最小限に抑えられた、空間的に適切な強い蛍光シグナルが認められました。p14ARF発現細胞（図3A）では、免疫蛍光染色により、p14ARFの既知の細胞内分布と一致する、主に核への局在が明らかになりました。0.3%オクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤による透過処理を用いることで、核の形態および細胞骨格の完全性を維持しつつ、抗体を核エピトープへ効率的に到達させることができました。これは、明瞭な核の対比染色および抗アクチン抗体（オレンジ色発光フルオロフォア）で可視化されたアクチン構造によって確認されました。

IFN-β発現細胞（図3A）では、タンパク質の分泌を遮断するためにBFAでインキュベートした後、細胞質シグナルが観察されました。これにより、この可溶性サイトカインの細胞内蓄積と検出が可能となりました。これらの条件下では、緩やかな透過処理を行うことで、細胞質の内容物を過剰に抽出することなく、抗体を浸透させることができました。良好な染色の特徴は、点状から拡散した細胞質の蛍光、最小限の核へのクロストーク、および維持されたアクチン構造であることでした。

主要なパラメータが適切に最適化されていない場合、不十分な結果が観察されました。非透過化条件下（オクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤 0%：図3Bおよび補足図1）で示されているように、透過化が不十分な場合は、核内のp14ARFシグナルが弱くなるか、あるいは消失しました。逆に、過剰な透過化（オクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤 ≥0.5% またはインキュベーション時間の延長）は、細胞骨格染色の部分的な消失、背景蛍光の増加、および細胞形態の悪化を招く可能性があります。迅速に分泌されるタンパク質（例：IFN-β）を用いた実験では、BFAを省略すると細胞内シグナルが弱くなることが多くあり、これはプロトコルの不備ではなく、迅速な分泌を反映した結果と考えられます。

単一染色コントロール（Supplementary Figure 2）では、各ターゲットに対応するチャネルのみにシグナルが認められ、観察された免疫蛍光染色の特異性が裏付けられた。一次抗体なしおよび抗体なしコントロールを含む陰性対照条件（Supplementary Figure 2）では、期待通りの核染色が認められ、抗体依存性チャネルのシグナルは無視できる程度であったことから、自家蛍光が低く、二次抗体の非特異的結合が最小限であることが示された。

以上の代表的な結果は、固定、透過化の強度、および標的依存的な戦略（分泌阻止など）を標的の生物学的特性に合わせることで、異なる細胞内局在を持つタンパク質の検出が可能であることを示しています。適切に最適化することで、背景ノイズが少なく細胞形態が保持された、強力で特異的な蛍光が得られますが、不適切な条件下では、信号が弱くなったりノイズが増えたりし、細胞構造が変化したりします。

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図 1: 単色および多重免疫蛍光染色のワークフローの概要フローチャート。細胞培養の維持から画像取得までの主要なステップ。標的に応じた選択が必要な2つの判断ポイントである、固定方法（PFAまたはメタノール）と透過処理（標的の細胞内局在に基づく）が含まれる。迅速に分泌される標的に対するbrefeldin A (BFA) 前処理などのオプションの実験的処理は、固定前の分岐として示されている。明確化のため省略したオプションのステップ（例：アルデヒドクエンチング）は、完全なプロトコルに記載されている。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 2: 抗体を用いた蛍光検出戦略の概略図。直接検出では蛍光標識一次抗体を使用し、間接検出では非標識一次抗体と蛍光標識二次抗体を組み合わせて使用します。本プロトコルではこの間接検出戦略を採用しています。マルチプレックス解析において間接検出を行う場合は、異なる宿主種で作製された非標識一次抗体を用いる必要があり、これにより各二次抗体が交差反応を起こさず、対応する一次抗体を選択的に認識することが可能になります。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 3: D17イヌ骨肉腫細胞のマルチプレックス免疫蛍光染色。D17細胞（5 × 104）を24ウェルプレートのガラスカバースリップ上に播種し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて25 °Cで10分間固定した。anti-p14ARF（1:200; 緑色蛍光色素）、anti-actin（1:200; オレンジ色蛍光色素）、およびanti-interferon-β (IFN-β)（1:200; 近赤外蛍光色素）の一次抗体と、対応する1:500の二次抗体を用いて、マルチプレックス免疫蛍光染色を行った。核を対比染色した。IFN-βの検出前に、タンパク質分泌を阻止するため、細胞をBFA（5 µg/mL, 4 h）で処理した。（A）0.3%非イオン性界面活性剤を用いて25 °Cで10分間、細胞を透過処理した。（B）透過処理を行わずに処理した細胞（0%非イオン性界面活性剤）。2回の独立した生物学的反復から得られた代表的な画像であり、それぞれ2回の技術的反復で行った。本図にはマージしたチャンネルのみを示しており、個別のチャンネルは付随図 1に提示している。条件間でラベルわたりの差が観察され、特に核内標的であるp14ARF（A; 矢印）において、非透過処理群（B）ではシグナルが消失していた。パネルAおよびBは、同一の設定（付随表 1）で取得および処理した。本パネルに対応するネガティブコントロールおよびシングル染色コントロールは付随図 2に示す。スケールバー：100 µm。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足図1：図3に対応する個別の蛍光チャネルを、透過処理あり（左列）および透過処理なし（右列）のマーカー別に整理した。並べて表示されている条件：Hoechst 33342 (A, B)、p14ARF (C, D; 緑色蛍光色素)、アクチン (E, F; オレンジ色蛍光色素)、およびIFN-β (G, H; 遠赤色蛍光色素)、ならびにそれぞれ図3Aおよび3Bに対応するマージ画像 (I, J)。矢印は代表的なp14ARFの核染色を示し、楕円はそれぞれ代表的なアクチン (E) およびIFN-β (G) の染色を示す。透過処理なしの条件下では、p14ARFの核シグナルの消失とともに、IFN-βおよびアクチンの標識が不十分であることが顕著である。(D; アスタリスク)で観察される残留シグナルは、共存する蛍光色素からのスペクトルクロストークを反映しており、これは対応する単染色および二次抗体のみのコントロール (補足図2) で消失していることにより確認された。スケールバー：100 µm。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図2：図3のマルチプレックスパネルに対応する複合免疫蛍光コントロール。 各コントロール群について、個別のチャンネル（Hoechst 33342、緑色蛍光色素、橙色蛍光色素、および遠赤色蛍光色素）を、マージ画像（5列目）と共に示す。（A–E）抗体なしコントロール：一次抗体および二次抗体を用いずに処理した細胞。（F–J）二次抗体のみコントロール：一次抗体を用いず、二次抗体カクテルでインキュベートした細胞。（K–O）p14ARF単独染色コントロール（緑色蛍光色素）。（P–T）Actin単独染色コントロール（橙色蛍光色素）。(U–Y) IFN-β単独染色コントロール（遠赤色蛍光色素）。取得および処理設定は、図3（補足表1）で使用したものと同一である。スケールバー：100 µm。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表1：蛍光フィルターキューブの仕様および取得順序。図3、補足図1、および補足図2で撮影したすべての視野について、倒立広視野蛍光顕微鏡（40×/0.80 対物レンズ)を用いて、以下に記載するフィルターキューブを記載の順序で用いて連続的に画像を取得した。画像は単一の光学面として取得した（zスタック処理は行わなかった）。励起強度は、入射光フィールドダイヤフラムをすべてのチャンネルでポジション6に固定し、指示されたレベルの蛍光強度コントロールを用いて設定した。カメラ設定（8ビットデジタル化、3072×2048フォーマット、ガンマ 1.0）および固定のデジタルシャープニング設定は、補足図2のコントロール画像を含むすべてのチャンネルおよびパネルで同一とした。表示用に、単一の線形輝度・コントラスト調整をすべてのチャンネルとパネルに同一に適用した。画像はTIFF形式で書き出した。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表2：免疫蛍光染色のワークフローにおける一般的な技術的問題のトラブルシューティングガイド。プロトコル全体における一般的な問題、考えられる原因、および改善策。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

このカバーガラスを用いた免疫蛍光ワークフローを安定して実施するためには、いくつかの重要なステップがあります。すべての手順は24ウェルの培養ウェルという限定された環境内で行われます。これにより、ハンドリングが簡素化され、サンプルの操作が制限されるとともに、少量の試薬でカバーガラス全体を完全に被覆させることが可能となり、実験あたりの抗体消費量を抑えることができます。これらの低容量溶液は蒸発しやすいため、インキュベーションは加湿チャンバー内で行うのが最適であり、サンプルを絶対に乾燥させてはいけません。短時間であっても乾燥すると、背景蛍光が増加し、細胞の形態が損なわれます。吸引時は、カバーガラス上にバッファーの薄い膜を残し、すぐに次の溶液を添加してください。

細胞の過剰増殖はバックグラウンドを増大させ、細胞構造を損なうため、バックグラウンドを抑え形態を保持するには、適切な細胞播種密度と、固定時のコンフルエンシーの制御が不可欠である。同様に、インキュベーション時間と温度の両方が固定効率、抗体結合、およびバックグラウンドシグナルに影響するため5,13、全工程においてこれらを精密に制御する必要がある。周囲の環境条件が変動する場合、25 °Cに設定した温度制御付きインキュベーターまたはドライオーブンを使用し、各レプリケート間でインキュベーション時間を一定にすることで、再現性が向上する。

固定は、抗原の保存状態や細胞構造を決定づけるため、最初にして決定的なステップであり5、標的の局在とエピトープの感受性に応じて固定液を選択します。PFAは、構造を維持し、抗原分布を保持し、ファロイジンによるF-actin染色の互換性があるため、ほとんどの膜結合性、細胞質、核、および細胞骨格の標的に推奨されます。架橋固定後に検出が困難な特定の核抗原、特にリン酸化エピトープやアルデヒド感受性エピトープにはメタノールが好まれる場合がありますが、メタノールは膜の完全性を損ない、可溶性タンパク質を抽出し、ファロイジン/F-actin染色を妨げるため、標的ごとに互換性を検証する必要があります13,14,15,16。可溶性サイトカインやその他の急速に分泌されるタンパク質の場合、PFA固定にBFA前処理を組み合わせることで、固定前の細胞内シグナルを保持できます。BFAは小胞体からゴルジ体へのタンパク質輸送を遮断し、分泌タンパク質の細胞内蓄積を促進するため、免疫蛍光法による検出が可能になります。固定条件が相反する標的を同時に検出する必要がある場合は、経験的な最適化が必要です。小さなジアルデヒドであるグリオキサールは、PFAの代替として報告されており、架橋速度が速く、抗原保存性が向上し、免疫蛍光法や超解像顕微鏡法との互換性があるとしています。我々はグリオキサール固定の直接的な経験はありませんが、文献で支持されているオプションとして提示します17,18。

固定後、適切な透過処理を行うことで、構造的な完全性を維持しつつ、抗体を細胞内および核内のエピトープに到達させることができます5。透過処理が不十分な場合は、形態が維持されているにもかかわらず、抗体のアクセスが制限されるため、通常、シグナルが弱くなるか消失します。一方、透過処理が過剰な場合は、可溶性タンパク質が抽出され、膜が破壊され、細胞骨格の染色性が失われ、背景光が増加します。したがって、界面活性剤の種類、濃度、およびインキュベーション時間は、標的に合わせて最適化する必要があります。適切な透過処理は、以下の4つの基準で判断できます：(i) 期待される細胞内コンパートメントに特異的なシグナルが認められること、(ii) 形態が保持されており、Hoechst 33342およびファロイジンによってそれぞれ核および細胞質の境界が鮮明に分解されていること、(iii) F-actinの染色が明確であること（細胞骨格のシグナルが拡散または消失している場合は、透過処理が過剰であることを示すため）、(iv) ネガティブコントロールにおいて背景光が低いこと。これらの基準を満たさない場合は、非イオン性界面活性剤であるオクチルフェノキシエタノールの濃度および/またはインキュベーション時間を経験的に調整します。膜結合抗原と細胞内抗原を同一パネル内で組み合わせる場合は、より緩やかな条件（界面活性剤の低濃度化、インキュベーション時間の短縮）を用いることで、細胞内へのアクセスを可能にしつつ膜エピトープを保持でき、5 minから始めて段階的に時間を増やすタイムコース試験が有効です。代わりにサポニンを使用する場合は、その透過効果が可逆的であるため、その後のすべての抗体溶液および洗浄バッファーにサポニンを添加し続ける必要があります。

抗体濃度は、一般的な推奨に従うのではなく、滴定によって経験的に決定します。実際的なアプローチとしては、製造者が推奨する希釈倍率（例：推奨が1:200の場合、1:50、1:100、1:200、1:400など）の上下に少なくとも3〜4段階の濃度を含む連続希釈系列を作成し、同一条件下で複製カバースリップに適用する方法があります。各希釈液について、期待されるコンパートメントにおける特異的シグナルの強度、染色サンプルを対応する一次抗体なしコントロールおよび二次抗体のみのバックグラウンドを抗体なしコントロールと比較したS/B比（シグナル対バックグラウンド比）、および形態の保持状態を評価します。バックグラウンドが最小限で、かつ強力で特異的なシグナルが得られる最低濃度を選択します。持続的な高いバックグラウンドは、さらなる滴定、ブロッキング時間の延長、または洗浄条件の厳格化によって一般的に軽減できます。一方で、シグナルが弱い場合は、過剰な固定、不適切な抗体濃度、一次抗体が標的エピトープを認識できていないこと、二次抗体と一次抗体の宿主種の不一致（例：マウス宿主の一次抗体に抗ウサギ二次抗体を適用した場合）、または有効期限切れや不適切な保存（特に繰り返しの光曝露）による二次抗体の劣化に伴うフルオロフォアシグナルの消失が考えられます。すべての希釈段階でシグナルが得られない場合は、一次抗体インキュベーション時間を延長するか、4 °Cでオーバーナイトに変更すること、細胞株における抗原発現を確認すること、固定および透過化条件に対する抗体の適合性を検証すること、一次および二次抗体のロット、保存状態、有効期限を確認すること、顕微鏡にフルオロフォアに適した励起・ emissionフィルターが備わっているか確認すること、そして問題が解決しない場合は、別のクローンの抗体を試す価値があります。ワーキングソリューションを調製する際、必要なカクテル量は、（ウェル数 × 150 µL）に、ピペッティングロスを補うためのおよそ10%の余剰分を加えた量となります。各抗体のストック量は、この合計量を希釈倍率で割った値（例：1:200希釈の場合、825 µL ÷ 200 = 4.13 µL）であり、残りをTBST–BSA 1%で調整します。二次抗体カクテルについても、対応する希釈倍率を用いて同様の計算を行います。

マルチプレックス性能は、最終的にフルオロフォア（蛍光色素）パネルの設計に依存します。一次ターゲット、核対比染色、および細胞骨格マーカーに割り当てられるフルオロフォアは、スペクトルの重なりや信号の重複を避けるために調整される必要があり、また、イメージングシステムは選択したすべてのフルオロフォアの励起および検出をサポートしている必要があります。9,10各フィルターキューブの励起および蛍光波長範囲は、以下に記載されています。 付随表1これにより、パネル全体におけるスペクトルの適合性を直接比較することが可能になります。本パネルを他の蛍光色素に適用する場合、可能な限り隣接チャンネルとの重なりが最小限となる組み合わせを選択し、また本手順で行ったように、標的を組み合わせる前にシングル染色コントロールを用いてクロストークがないことを確認することが推奨されます。マルチプレックスパネルにおいて、共存する蛍光色素に起因する残留信号が、取得したすべてのチャンネルで観察されました（補足図1）が認められたが、対応する単染色および二次抗体のみのコントロールでは認められなかった（付随図2）、これは広視野イメージングで使用されたブロードバンドフィルターセットによるスペクトルのクロストークを示しており、（共焦点顕微鏡によるレーザー励起を用いることで低減できる可能性があります）。p14ARFの核小への局在と、アクチンおよびIFN-の繊維状かつ細胞質への分布との空間的な分離を考慮すると、βこのクロストークによって、マルチプレックスパネルにおけるp14ARFの局在解析の解釈が損なわれることはありません。本ワークフローは従来の蛍光色素ベースのマルチプレックス法に依拠しており、同時に検出可能な標的数は、利用可能な抗体宿主種およびスペクトル的に異なる蛍光色素の数によって制限されます。より高次のマルチプレックス化は、サイクリック免疫蛍光法やスペクトルイメージングによって達成可能です。これらはそれぞれ、染色の反復と退色処理、あるいは重複する蛍光色素の線形アンミキシングを可能にしますが、本稿の範囲外である専用の装置およびソフトウェアを必要とします。19,20.

封入剤は、画質と信号の持続性の両方に影響を与えます。市販の自己硬化型退色防止封入剤、または自家製の代替案としてPBS中80%グリセロール（退色防止剤および自己硬化機能なし）を使用できます。自家製グリセロールベースの封入剤を使用する場合は、乾燥とカバーガラスの移動を防ぐために透明なネイルポリッシュで密封します。また、核染色を済ませた後は、核染色剤を含まない封入剤を選択します。画像は、硬化後速やかに取得するのが最適です。すぐにイメージングできない場合は、硬化したスライドを暗箱に入れ、4 °Cで2～4週間、または−20 °Cで最大6ヶ月間保存できます。ただし、光安定性の低い蛍光色素（例：緑色蛍光色素）は、最適な保存条件下であっても時間とともに信号が減衰することに留意してください。市販の退色防止封入剤は、自家製グリセロールベースの封入剤に比べて蛍光色素の安定性を大幅に向上させます。後者を使用する場合は、24～48時間以内に画像を撮影することを強く推奨します。透明なネイルポリッシュはほとんどの蛍光色素と互換性があり、保存前に少なくとも30分間の暗所での硬化時間を設ければ、信号の保存に顕著な影響は与えません。

固定ステップ以降は、無菌操作は不要であり、染色はベンチ上で行うことができます。ただし、「CAUTION」と表示された試薬については、認定済みの化学薬品用ヒュームフードを使用してください。D17およびその他の腫瘍由来細胞株は、該当するリスクグループ1または2の材料に関する機関のバイオセーフティガイドラインに従って取り扱います。培養細胞、カバーガラス、チップ、培地、および液体廃棄物に接触したすべての材料は、廃棄前に除染します。液体廃棄物は、最終濃度10%の漂白剤で30分以上不活化し、固形廃棄物は適切な生物学的廃棄物容器に廃棄します。PFA、メタノール、またはオクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤を含む化学廃棄物は分別し、機関の化学安全規制に従って廃棄します。

本ワークフローは汎用的に利用できるように設計されていますが、固定的な普遍的手順としてではなく、ターゲットに応じて適応させるべきものと考えてください。適用の成功は、各抗原の局在、溶解度、エピトープのアクセシビリティ、および固定・透過処理に対する感受性に関する研究者の理解にかかっています。2つの制限事項を強調しておく必要があります。第一に、ここでの染色の評価は、形式的なシグナル対バックグラウンドの定量化ではなく、陰性コントロールおよび予想される細胞内局在との比較に基づいた定性的なものである点です。したがって、ここで報告されている一貫性は、定量的に検証された性能ではなく、複製カバーガラスおよびコントロール条件下での再現可能な定性的染色を反映しています。よくある問題、考えられる原因、および修正処置をまとめた統合トラブルシューティングガイドは、Supplementary Table 2に記載されています。定量的な読み取りを必要とする研究室では、オープンソースの画像解析ソフトウェアを使用して、平均強度の測定、バックグラウンド除去、関心領域（ROI）ベースの定量化、および強度プロファイリングを行うことができます21。第二に、代表的なデータは単一の接着性イヌ腫瘍細胞株（D17）から得られたものであるため、他の細胞型、種、または抗原の組み合わせに拡張する場合は、固定、透過処理、および抗体条件についてターゲット固有の再最適化が必要となります。

要約すると、本プロトコルは、標準的な実験器具を用いて、試薬消費量を抑えつつ一貫した染色性能を実現し、ターゲットに応じた適切な調整も可能な、接着性2D培養における単一および多重免疫蛍光染色のための柔軟で費用対効果の高いワークフローを提供します。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) の助成金 2023/01697-7 (JL) および 2022/15913-0 (BES) の支援を受けました。また、助成金 401811/2024-7 (BES) およびフェローシップ 310497/2021-3 (BES) を含む、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) からの支援も受けています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル組織培養プレートCorning3524カバースリップへの細胞播種および染色
抗生物質・抗真菌薬Gibco15240062細胞培養における細菌および真菌の混入を防止するために使用されます。
抗体希釈液（1% BSA含有TBST）院内で調製—10 mL分：5% BSAブロッキング溶液 2 mL ＋ 5 µL Tween-20 + 7.995 mLの1x TBS（調製液）を加え、最終容量を10 mLとする（最終組成：1% BSA, 0.05% Tween-20 in TBS; pH 7.6）。使用直前に調製すること。保存する場合は、以下で保持する。 4 °C 汚染を防ぎ、1週間以内に使用してください。
ブロッキング溶液院内調製—10 mL分：0.5 gのBSAを10 mLの1x TBS（10x TBSストック溶液1 mL ＋ 蒸留水9 mL）に溶解させる。pH 7.6。30分間、以下の条件でインキュベートする。 25 °C; 新鮮な状態で調製すること。
(TBS含有5% BSA)
ブレフェルジンASigma-AldrichB76515 µg/mLサイトカイン検出前のタンパク質分泌を阻止するための4時間の前処理。
BSA（牛血清アルブミン）Sigma-AldrichA7906ブロッキング用にはTBSで5%、抗体希釈液にはTBS + 0.05% Tween-20で1%。
コラーゲンベースの試薬（カバーガラスコーティング用、任意）Corning 354231牛真皮由来I型コラーゲン；～まで希釈した 50 µg/mL 0.01 N HCl中で；5で印加し–10 µg/cm² (≈100 µL/well); 室温で1時間インキュベートします（≈25°C）；吸引し、PBSで洗浄した後、細胞を播種する。
カバーガラス、ガラス製、12 mm 丸型クニッテルガラス100013付着細胞培養および染色のための基質。
D17 canine osteosarcoma cell line（イヌ骨肉腫細胞株D17）Banco de céリオデジャネイロのイカ276代表的な細胞モデル。10% FBSおよび抗生物質・抗真菌剤を添加したDMEMで維持。維持条件は以下の通り。 37 °C, 5% CO2。
(BCRJ)
脱イオン水/蒸留水院内調製—緩衝液の調製。
DMEM（ダルベッコ修正イーグル培地）Gibco12100-046細胞培養用完全培地。
エタノールSupelco1.00983カバースリップおよびピンセットの除染。
ウシ胎児血清Sigma-AldrichF7524細胞培養培地への添加。
(胎児牛血清)
フィブロネクチンGibco33016015細胞外マトリックス糖タンパク質；細胞培養培地で0.0125 mg/mLに希釈；以下で適用 100 µL/well 室温で1時間インキュベートし（≈25°C）を、細胞播種前に行う。
極細先端金属製ピンセット多様な—カバーガラスの取り扱い。
蛍光顕微鏡Leica MicrosystemsDMi8DMi8 広視野蛍光顕微鏡 (Leica Microsystems)、HC PL FLUOTAR 40×0.80 DRY対物レンズ；パネル内の蛍光色素（AF488、AF555、AF647、Hoechst）に対応。
ガラス製顕微鏡スライドガラスバイオスライド—イメージングのための染色済みカバーガラスの封入。
ガラス製ペトリ皿またはカバースリップホルダー各種—カバーガラスのオートクレーブ滅菌および保管。
グリシンSigma-Aldrich8.16E+0950 mM溶液10 mLの調製：37.5 mgのグリシンを10 mLの1x TBSに溶解し、pH 7.6とする。5分間、〜で（保持する）。 25 °C; 固定後、透過処理前の任意のアルデヒド消去ステップ。新鮮に調製すること。
Hoechst 33342InvitrogenH357010 mLの作業溶液の調製：ストック溶液をTBSで1:5000に希釈する。核対比染色；遮光してインキュベートすること；使用直前に調製すること。
加湿チャンバー各種／自作—抗体インキュベーション用。あるいは、湿らせた吸収紙を入れた密閉プラスチック容器を用いて作成する。
ImageJオープンソース (NIH)—画像取得後の解析に使用されます。
画像取得ソフトウェアLeica Microsystems LAS X 3.7.3Leica DMi8での画像取得に使用。
メタノールMerck1.06009代替固定法（核抗原／リン酸化エピトープ）；〜まで予冷して −20 °C5分間のインキュベーション。ファロイジン/F-アクチン染色を阻害する可能性があります。
封入剤Sigma-AldrichG228910 mL調製する場合：グリセロール 8 mL ＋ PBS（pH 7.6）2 mL を加え、十分に混合する。退色防止能はなく、自己硬化もしない。乾燥およびドリフトを防ぐため、ネイルポリッシュでカバーガラスの縁を密封し、スライドを以下に保存する。 4 °C 遮光し、光退色を最小限に抑えるため速やかに撮影してください。
（グリセロールベース）
封入剤 (ProLong商標 ガラス）InvitrogenP36984抗退色剤を含有し、遮光条件下で室温にて約24時間以内に自己硬化して永久封入されるため、ネイルポリッシュによる封止は不要です。スライドは2℃で保存してください。–8 °C、イメージングまで遮光して保存する。
NaClSigma-AldrichS9888TBSバッファーのイオン成分。洗浄および抗体インキュベーション工程において、細胞および組織の形態を維持するために生理的浸透圧を保持します。
針（細ゲージ、例：25G）–27G)種々の—細胞単層を損傷させることなく、ウェル底面からカバーガラスを穏やかに持ち上げて剥離させるためのレバーとして使用します。
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich15812710 mL分：0.4 gのパラホルムアルデヒド粉末を8 mLのPBSに溶解し、60℃まで加熱する。–65 °C 1N NaOHを数滴加え、溶液が透明になるまで調整し、冷却後、pHを7.4に調整して、PBSで10 mLに定容する。その後、以下のフィルターでろ過し、 0.2 µm 使用前にろ過すること。新鮮に調製するか、分注して以下の温度で保存すること。 −20 °C、凍結融解の繰り返しを避けてください。
蛍光標識ファロイジンInvitrogen選択した蛍光によって異なります。10 mLの作業溶液を調製する場合：製造元の指示に従い、ストック溶液をTBS（pH 7.6）で1:400に希釈する。代替的な細胞骨格/F-アクチンラベル。使用直前に調製し、遮光して保存すること。
リン酸緩衝生理食塩水Sigma-AldrichP4474-1L等張リン酸緩衝液（pH 7.4）；固定および洗浄工程において細胞形態を維持するため、生理学的浸透圧を保持します。
(リン酸緩衝生理食塩水)
ポリ-L-リシン（カバーガラスコーティング、任意）Sigma-AldrichP8920静電的な細胞接着を促進する合成ポリカチオン性コーティング試薬。蒸留水を用いて0.1 mg/mLの濃度で調製し、カバーグラス表面を十分に覆う量を使用する。30分間、以下の条件でインキュベートする。 25 °C 細胞播種前。
一次抗体、アンチアクチン（ヤギ由来）Santa Cruz BiotechnologySC-1615抗アクチン抗体：ポリクローナル、非標識、抗ヤギ二次抗体で検出。使用希釈倍率は1:200。
一次抗体、抗IFN-β （マウス宿主）Aviva Systems BiologyOAPB00536抗IFN-β 抗体；ポリクローナル、非標識、抗マウス二次抗体で検出。使用希釈倍率は1:200。
一次抗体、anti-p14ARF（ウサギ由来）CalbiochemPC409抗p14ARF抗体：ポリクローナル、非共役、抗ウサギ二次抗体を用いて検出。本製品は製造中止となっており、当該ターゲットの研究を計画する場合は、新しい抗体のバリデーションが必要である。使用希釈倍率は1:200。
二次抗体、抗ウサギ、Alexa Fluor 488標識Thermo Fisher ScientificA32731TR抗ウサギAF488標識抗体。使用希釈倍率1:500で使用。
二次抗体、抗ヤギ、Alexa Fluor 555標識Thermo Fisher Scientific A-21432抗ヤギAF555共役抗体。使用希釈倍率1:500。
二次抗体、抗マウス、Alexa Fluor 647標識Thermo Fisher ScientificA-21235抗マウスAF647標識抗体。最終希釈倍率1:500で使用。
Tris緩衝生理食塩水 (TBS)、10倍濃縮ストック溶液院内調製—100 mL調製時：6.06 gのTris baseと8.77 gのNaClを80 mLの蒸留水に溶解させる。濃塩酸を用いてpHを7.6に調整し、最終容量を100 mLとする。オートクレーブ滅菌を行う。蒸留水で1:10に希釈して作業溶液（1x TBS）とする（最終組成：50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6）。室温または[以下欠落]で保存する。 4 °C 最長3か月間。
TBST (TBS + 0.05% Tween-20)院内で調製—10 mLの場合：10倍TBSストック溶液 1 mL ＋ 蒸留水 8.995 mL ＋ 5 µL Tween-20 (0.05% v/v)；pH 7.6。染色ステップ間の洗浄バッファー。調製後、約1週間以内に使用すること。 4 °C.
Tris baseSigma-Aldrich252859TBSストック溶液の調製に使用される緩衝剤であり、免疫蛍光染色の洗浄液および希釈バッファーにおいて、生理学的範囲（pH 7.6）でのpH安定性を維持します。
Triton X-100（オクチルフェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤）Sigma-AldrichX10010 mLの場合： 10 µL 0.1% TX100用：1x TBS 9.99 mLにTriton X-100を添加 30 µL 0.3% TX100を含む1x TBS 9.97 mL中（ターゲットにより異なります。核内ターゲットの場合はより高い濃度が必要です）。
トリプシン-EDTAGibco25200056細胞の剥離に使用します。
Tween-20Sigma-AldrichP9416洗浄バッファー（TBST）および抗体希釈液（1% TBST-BSA）としてTBSに使用する。

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