方法論記事

マウス乳腺における遺伝子ノックアウトと活性化の並行 生体内 スクリーニング

DOI：

10.3791/71115

⸱

2026年7月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、マウス乳腺における並行 したin vivo 遺伝子ノックアウトおよび活性化研究を可能にするスケーラブルな管内CRISPRスクリーニングアプローチを記述しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フォワード遺伝学スクリーニングは、数千の遺伝要素をプール方式で攪乱し、大規模な遺伝子型から表現型への地図を作成するために日常的に用いられています。細胞培養システムで行われることが多いものの、累積された証拠はin vivo スクリーニングが vitroでは再現できない新しい生物学的特徴を明らかにする力を持っていることを支持しています。しかし、このアプローチの広範な応用は、主に遺伝子活性化よりも機能喪失による摂動に重点が置かれていること、そして複雑な遺伝子ライブラリを特定の組織 に生体内で届けることに大きな技術的障害があることによって制限されています。これらの課題を克服するために、マウス乳腺内で数万個の離散的な上皮クローンを生成することで効率的かつ迅速なゲノムスクリーニングを可能にする、シンプルで多用途な管内注射戦略を記述します。さらに、ライブラリーの生成、管内注入、スクリーンのデコンボリューション、CRISPRノックアウトおよび活性化ライブラリーの解析に必要なすべての詳細を提供し、包括的な in vivo スクリーニングを実現します。これらのツールをCRISPR-KOALA(ノックアウトおよび活性化連結アッセイ)と呼び、46個からゲノムの5分の1までのプールライブラリにおいて、コードゲノムおよび非コードゲノム内の新しい腫瘍抑制因子およびオンコジーンを特定しました。重要なのは、このアプローチと解析が他の臓器にも応用でき、恒常性や疾患中の遺伝子の生物学的機能を研究することができる点です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機能ゲノミクススクリーニングは、スケール1で遺伝子機能を検証するための強力な枠組みを提供します。CRISPR-Cas遺伝子編集技術の開発により、数百から数千の遺伝子を並行して体系的に摂動することが可能となり、哺乳類細胞株におけるCRISPRベースのプールスクリーニングは現代がん生物学研究の基盤となっています。これらのin vitroアプローチにより、多様ながん文脈において必須遺伝子3、腫瘍抑制因子4、合成致死相互作用5が特定されています。しかし、中心的な制約の一つは、免疫系やストローマとの相互作用、栄養勾配、微小環境内の組織構造など、腫瘍の複雑な生物学的特徴を生体内で捉えることができないことです。この限界に沿って、最近の研究では、多くの正真正銘のがん駆動遺伝子が、特に細胞培養には欠如する微小環境の手がかりに依存している場合、体外で測定可能な効果を発揮できないことが示されています。

マウス乳腺は、in vivo機能ゲノミクススクリーニングにおいて非常に有利な組織環境を提供します。乳腺上皮細胞は非常に再生性が高く、発情周期中にクローンの拡大を繰り返し、分岐した管ネットワークに組織されており、容易にアクセスし遺伝的に操作することができます(11,12,13)。これらの特徴は数十年にわたるモザイク遺伝解析と系統追跡実験を支え、乳腺を組織恒常性と疾患の際に細胞内在および微小環境依存の遺伝子機能を検証するための扱いやすいシステムとして確立しました。23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33。重要なのは、遺伝的乱れを上皮区画に限定できるため、形変異、細胞競合、系統忠実度、腫瘍進行の基礎を完全な組織文脈で直接研究できることです。

遺伝的撹乱を成人乳腺に直接現場で届けるためのいくつかの戦略が開発されていますが、ハイスループット用途には依然として大きな技術的課題が残っています。アデノウイルス媒介によるCre組換え移植は、成人乳腺34,35,36,37における条件対立遺伝子の体細胞組換え誘導に広く用いられており、従来の遺伝子組換えマウスモデル(GEMM)に必要な複雑な生殖細胞育種を必要とせずに遺伝子機能を効率的に操作する方法を提供しています。高抗体価アデノウイルスは組織常駐細胞にCRISPR-Cas9成分を届けることもできますが、これらのベクターは宿主ゲノム38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49に統合されません.これにより、スクリーニングのスケールは~10〜55遺伝子に大きく制限され、各gRNAターゲット部位は分子反転プローブ38,39,40,41,42,43,44,45,46,47を用いて個別にシーケンスする必要があります.さらに、既存の導管内投与法は乳管系への直接アクセスを可能にしますが、乳腺50の侵襲的外科的曝露か、比較的大型のハミルトン注射器の使用が必要で、これらは扱いにくい51です。これらの手法はウイルスの局所的な送達には効果的ですが、比較的侵襲的で技術的に難しく、プールされたレンチウイルスライブラリーのスケーラブルな配信には最適化されていません。これらの研究は総合的に、in situウイルスの摂動が可能であることを示していますが、現行のツールは高スループットin vivo CRISPRスクリーニングに必要な安定したプール化かつシーケンス検索可能な摂動をサポートしていません。

これらの制約に対処するため、私たちや他の研究者はレンチウイルスベクターの統合に取り組み、安定した遺伝的遺伝子改変を可能にします。細胞培養システムとは異なり、生体内組織は単一の臓器内で生成できる異常細胞の数に厳しい制約を課しており、ゲノム全体のスクリーニングは実用的ではありません。したがって、生体内CRISPRスクリーニングは、カバレッジと実現可能性のバランスを取った生物学的情報に基づいた標的ライブラリの設計を必要とします。さらに、ここでレビューしたほとんどのin vivo CRISPRスクリーニングは、遺伝子活性化が補完的かつ重複しない生物学的知見を明らかにするという証拠が増えているにもかかわらず、ほぼ独占的にレンチウイルスによる機能喪失の摂動に焦点を当てています。私たちや他の研究者は、レンチウイルスCRISPR摂動を成人乳腺上皮に統合することで、安定した遺伝可能な遺伝子改変を生み出し、ゲノムDNAから回収・定量できることを実証しました。36,55,56,57,58。この手法を用いて、プールされたin vivo CRISPRスクリーニングを実施し、腫瘍性転換の新たなドライバー36,55を特定し、レンチウイルス送達およびCRISPRスクリーニングの実現可能性と生物学的関連性を確立しました。しかし、これらの研究は、同じ甲状腺内で機能喪失と獲得機能の両方のスクリーニングモデルを広く採用・拡張可能な、シンプルで標準化かつ拡張可能なプロトコルの必要性も浮き彫りにしました。

ここでは、成体マウス乳腺55におけるCRISPRノックアウトおよび活性化ライブラリー(CRISPR-KOALA)の並行生体内スクリーニングを可能にする、シンプルで多用途な管内注射戦略を説明します。CRISPR-KOALAは、CRISPR-KO機能のために従来の20-21塩基の「シングルガイド」(SG)RNAまたはCRISPR-A用に14塩基の「デッドガイド」(dg)RNAのいずれかを使用します。dgRNAはCas9を標的部位に効率的に誘導しますが、Cas9のエンドヌクレアーゼ活性59、60、61を阻止するため、活性Cas9を発現する単一のマウスでノックアウトおよび活性化の両方を行うことができます。dgRNA trcrに2つのPP7ヘアピンを導入することで、PP7被覆タンパク質P65:HSF1トランスアクティベーター62のリクルートが可能となり、遺伝子の効率的なin vivo55の過剰発現につながります(図1)。標的gRNAライブラリー設計と高価レンチウイルス産生、ガラス微細血管を用いた非外科的管内送達を組み合わせることで、このアプローチは組織構造や微小環境相互作用を保持しつつ、空間的に離散的な上皮クローンを数万個生成します。重要なのは、レンチウイルスによる宿主ゲノムへの統合により、高スループットシーケンシングによるgRNAの回復と定量が可能となり、生体内での機能ゲノムスクリーニングのプール化が可能になることです。これにより、Cas9発現マウスの同じ乳腺内で、同じ細胞内で並行または同時にCRISPR-KOとCRISPR-Aの摂動が可能になります。

本書では、gRNAライブラリー設計、レンチウイルスの産生と濃度、導管内送達、ライブラリーの脱畳み込み、データ解析を含む詳細なステップバイステッププロトコルを提示します(図1)。この手法は、マウス乳腺における 生体内 CRISPRノックアウトおよび/または活性化スクリーニングのための実用的かつ拡張可能な枠組みを提供し、組織恒常性、異なる疾患文脈、他の組織、ラットなど他の種における遺伝子機能の研究にも応用可能です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物処置はカナダ動物ケア協議会のガイドラインに従って行われ、フェノゲノミクスセンター動物ケア委員会(プロトコル26-0272H)によって承認されました。

1. CRISPRライブラリのクローニング

注:この節では、配列合成オリゴヌクレオチドからレンチウイルス性骨格体へのCRISPRノックアウトおよびCRISPR活性化ライブラリーのプールクローニングについて説明します。私たちは最大4,000個のgRNAを含むライブラリーを日常的に生成しており、これは8〜20匹のマウスで400X〜1,000倍のカバレッジでスクリーニング可能です。gRNAの数やカバー範囲は必要に応じて調整可能であり、統計的な検出力を維持するために必要なマウス数に影響を与えます。機能獲得の強い表現型には十分な最低400倍のカバレッジを維持することを推奨します。

  1. ガイドRNAライブラリー設計
    1. CRISPRライブラリ設計のために、単一の実験内でスクリーニング対象となるすべてのマウス遺伝子のリストを作成し、CRISPRノックアウト(CRISPR-KO)ライブラリとCRISPR活性化(CRISPR-A)ライブラリごとに別々のターゲットリストを維持します。
      注:CRISPR-KOとCRISPR-Aライブラリーは別々に生成され、レンチウイルストランスダクション段階で組み合わせて同時スクリーニングを行うことができます。
    2. CRISPR-KOライブラリでは、CRISPick62、63、CHOPCHOP64、VBC Score65などの高得点予測アルゴリズムを用いて、1遺伝子あたり4〜5個の単一ガイドRNA(sgRNA)を選択します。
      注:VBCスコアは非常に高い有効性とオンターゲット活性66を示します。ツールを問わず、予測されるオンターゲット活性が高く、オフターゲットの可能性が最小、標的を特定できるエクソンを持つガイドを優先してください。
    3. CRISPR-Aライブラリでは、CRISPick62,63またはCHOPCHOP64を用いて、遺伝子ごとに8〜10のガイドを選択します。ユーザーが指定したガイド長を許可するツール(CHOPCHOPなど)では、ガイド生成前にガイド長を14 bpに設定してください。20 bpガイドしか生成できないツールを使用する場合、プロトスペーサー隣接モチーフのすぐ5'に14 bp配列を保持し、これらの配列をデッドガイドRNA(dgRNA)に変換します。これは遺伝子のプロモーター領域を標的とします。
      注:dgRNAは切断されたガイド配列であり、CRISPRベースの転写活性化を全長sgRNAの約50〜85%の効果で実現し、DNA切断59,60,61を誘導しません。
    4. 単一の実験に対応するすべてのsgRNAまたはdgRNAを別々のリストにまとめて、均一なクローニング、ウイルス生産、 in vivo スクリーニングを可能にします。
      注:一緒にスクリーニングされるsgRNAとdgRNAは、ウイルス産生後にプール化されます。
    5. CRISPR-KOおよびCRISPR-Aスクリーニング用のプールされた陰性コントロールライブラリー(非標的55,67および非遺伝子gRNA配列68を含む)を生成し、遺伝子破壊や活性化に依存しない背景効果を制御します。
      注:必要に応じて、非標的および非遺伝子のgRNAを別々にライブラリーとして作り、2つの独立したネガティブコントロールライブラリを作成することも可能です。
  2. オリゴヌクレオチドプールの設計と増幅
    1. 各gRNAに標的配列、目的レンチウイルス骨格と互換性のある制限酵素オーバーハング、ライブラリ特異的プライマー配列を含むプールされたオリゴヌクレオチドを設計し、複雑なオリゴヌクレオチドプールから選択的に増幅できるようにします(図1、表1)。
    2. 各gRNAライブラリーに固有のプライマーペアを割り当て、共有オリゴヌクレオチドプールから個々のライブラリーを独立して増幅できるようにします。一意なプライマーペアは 表1に記載されています。
    3. 市販のアレイ合成プラットフォームからオリゴヌクレオチドライブラリをオーダープーリングし、各プール内のすべてのgRNAの等モル表現を保証します。
    4. プールされたオリゴヌクレオチドのテンプレートから、ライブラリー特異的プライマーを用いて以下の反応混合物から個々のgRNAライブラリを増幅します。反応は特定のポリメラーゼの推奨組成に準着するように修正可能です。プールされたオリゴヌクレオチドのテンプレートと、テンプレートなしのネガティブコントロール反応を1つで3つの反応を準備します。
      4 ngプールオリゴヌクレオチド型
      2.5 μL 10 μM フォワードライブラリ特化プライマー
      2.5 μL 10 μM 逆ライブラリ特化プライマー
      10 μL 5倍反応バッファー
      0.5 μL 高忠実度DNAポリメラーゼ
      X μLの非ヌクレアーゼ水
      50μL 総体積
    5. 以下のサイクル条件を用いてPCR増幅を行い、ライブラリー特有のプライマーの融点に基づいてアニーリング温度を調整します。
      98°Cの1サイクル、30秒
      98°Cで10秒、62〜65°Cで20秒、72°Cで3秒のサイクルを18回行います
      72°Cの1サイクルを5分間
      注意:ライブラリ内で均等なgRNA表現を維持するために、増幅サイクルは18〜19を超えないでください。
    6. 2.5%アガロースゲルを120Vで約45分間分離し、期待されるgRNA挿入サイズ(プライマー設計によります)に対応するバンドを切除します。 図2A)。
    7. ゲル抽出キットでPCR製品を精製し、最終浸出工程で20μLの超純水で洗脱します。
      注:(間近)精製されたgRNA挿入物はクローニング前に-20°Cで保存されることがあります。
  3. レンチウイルス性骨格の調製と消化
    1. gRNA挿入物のクローニング用に、取り外し可能なスタッパー配列を含むレンチウイルス性骨格プラスミドを準備します。 in vivo では、CRISPR-KOおよびCRISPR-AライブラリーはそれぞれpLKO-Cre(Addgeneプラスミド#158032または256774)およびpXPR502-PPH-Cre(Addgeneプラスミド#256776)を使用します。
    2. 適切な制限酵素とバッファーを使用して、レンチウイルス骨格DNA5〜10μgを総反応容積200μLで消化します。pLKO-Cre CRISPR-KOバックボーンにはEsp3Iを、pXPR502-PPH-CreのCRISPR-AバックボーンにはSapIを使いましょう。
      5–10 μg バックボーンプラスミド
      20 μL 10倍酵素バッファー
      5 μL制限酵素
      X μL 非ヌクレアーゼ水
      200 μL 総体積
    3. 消化反応を37°Cで2〜3時間培養します。
    4. 各消化反応に組換えアルカリリン酸2μLを加え、37°Cで1時間インスポレートして消化した骨格を脱リン酸化します。
    5. 1%アガロースゲルで分解生成物を分離し、線形化された骨格に対応するバンドを切除します(図2B,C)
      注:両方の骨格において、ベクターによって異なりますが、約2000〜2500 bpの位置でシュッファー断片が明確な帯として見えます。
    6. 摘出した骨格DNAをゲル抽出キットで精製し、極少量の超純水で洗脱して高いDNA濃度(通常20μL)を維持します。
      注:(一時停止)精製された消化骨格は、結紮前に-20°Cで保存されることがあります。
  4. gRNAライブラリーの消化と結合
    1. 精製レンチウイルス骨格DNA750 ng、gRNAライブラリー挿入DNA(43 ng)、制限酵素3 μL、T4 DNAリガーゼ7.5 μL、10 mM ATP 15 μL、適切な反応バッファーと滅菌蒸留水を用いて、オールインワン消化・連結反応を組み立て、合計反応容積150 μLに到達させます。
      注意:プラスミド骨格分解の段階で最初に使用された制限酵素と同じものを使用してください。推奨された骨格を用いると、精製されたレンチウイルス骨格750 ngとライブラリ挿入DNA43 ngの比率は、推奨される骨格を用いる場合、ベクター対挿入物のモル比はおおよそ1:7となります。
    2. 各結合混合物を3つの等しいアリコットに分けて、変換効率とライブラリの複雑さを高めます。
    3. バックグラウンドライグメントを評価するために、骨格DNAを含む1つの陰性対照反応を準備します。
    4. 消化-結紮反応を30°Cで一晩培養します。
    5. 翌朝、各反応アリコートに適切な制限酵素1μLを加え、37°Cで1時間インキュベーションして骨格分解の完了を促します。
    6. 各反応に10 mM ATPを2 μL、T4 DNAリガーゼ2 μLを加え、25°Cで2〜3時間インキュベークして完全結合します。
    7. 各ライブラリーごとに3つの個別の消化・連結反応を統合し、カラムベースのオリゴヌクレオチド浄化法で精製し、それぞれ21μLの超純無菌蒸留水で洗脱します。7μLの超純度滅菌蒸留水中で単一の精製負対照反応を洗脱します。
      注意:塩やEDTAを含むバッファー内でのリゲーション生成物を溶出しないでください。これらは細菌の電気穿孔効率を大幅に低下させます。(間)精製された結合生成物は電気穿孔前に-20°Cで保存することができます。
  5. ライブラリの電気孔化と膨張
    1. 0.1cmの電気穿孔キュベット、2μLの精製結合生成物を含むマイクロ遠心分離管、そして電気穿孔の少なくとも20分前に氷上に置かれた14mL丸底ポリプロピレン培養管を用意します。
    2. 電気能力を持つ細菌細胞を氷上で解凍し、25μLの細胞と2μLの精製ライゲーション生成物を、事前に冷却されたマイクロ遠心分離機チューブ内でピペッティングで優しく混ぜます。
    3. 細胞-DNA混合物を予備冷却した0.1cmの電気孔槽キュベットに移し、1.8 kV、25 μF、200–600 Ωで電解孔化します。
      注:成功した電気孔抽出の時間定数は通常、4.6 msから4.9 msの間で発生します。
    4. すぐに、電気能力を持つセルとともに予備された37°Cの予温されたリカバリー培地1 mLをキューベットに加え、セルを優しく再懸浮させ、懸濁液を14 mLの丸底ポリプロピレンチューブに移します。
    5. 回収した細胞を30°Cで180rpmで振って90分間培養します。
    6. 回収した細胞の10μLプレートを90μLのLBブロスに希釈し、アンピシリンを含むLB寒天プレートに置き、30°Cで一晩インキュベーションして形質転換効率と背景結紮を評価しました。
      注:クローニングが成功した場合、インサートプレートには数百のコロニーが残り、骨格のみの陰性対照プレートでは>30コロニーのみのコロニーが形成されるはずです(図3)。
    7. さらに、U6プロモーターからミニプレップとサンガーシーケンスフォワードのために~10コロニーを選んでライブラリの検証を行ってください。成功裏にクローニングされたライブラリーは、10のミニプレップに重複ガイドなしで、90%のミニプレップの90%がgRNAの明確なシーケンスを含<んでいます。さらに、制限酵素はミニプレップとプールされたプラスミドライブラリーを消化し(ステップ1.5.10)、アガロースゲルでバンドサイズを確認し、レンチウイルス構造体が異常な組換えをしていないかを確認します。
      注:ライブラリの表現は、希釈プレートのコロニー数とライブラリ内の総gRNA数を比較することで評価でき、1,000倍のカバレッジを目指します。この計算を助けるために複数のシリアル希釈が用いられることがあります。
    8. 形質転換効率が十分であれば、残りの回収細胞を適切な抗生物質を含む15cmのLB寒天培地にプレートし、30°Cで一晩培養して密集したコロニーを形成します。
      注:回収した細胞を100μLずつ15cmの寒天プレート10枚にプレートし、十分なコロニーを回収してください。
    9. 翌日、細胞スクレーパーを使ってアンピシリンを含んだ500mLのLBブロスに細菌コロニーをこそげ取り、クローン化されたgRNAライブラリを表す単一の細菌培養を作り出します。
    10. プールした細菌培養液を30°Cで約3時間振って拡散し、maxiprepキットを使ってプラスミドDNAを分離します。

2. 生体内 スクリーニングのためのレンチバイラル生産

注:導管内送達および in vivo プールスクリーニングにおいては、乳腺上皮細胞の効率的な伝達を確保するためにレンチウイルス製剤を高濃度(理想的には1 x 108 pfu/mLから1 x 109 pfu /mLの範囲)に集中させる必要があります。以下のプロトコルは、 in vivo 利用に最適化された高抗体価レンチウイルス産生について説明します。

  1. レンチウイルス産生細胞の調製
    1. HEK293TN細胞を、10%胎児用牛血清、1%ペニシリン・ストレプトマイシン、培養細胞を37°Cで5%CO2で補足したDulbecco's改変Eagle培地(DMEM)に維持します。
    2. 細胞は2〜3日に1回通過し、対数成長を維持し、細胞の90%の合流率を超えないようにします。最適なウイルス産生のために、<20の細胞を使いましょう。
    3. トランスフェクションの前日に、15cmの組織培養プレートにポリL-リジン(0.02 mg/mL)を室温で1時間コーティングします。ウイルスの調製剤を1バッチ分に9皿用意します。
    4. ポリL-リシン溶液を取り出し、リン酸塩緩衝生理食塩水でプレートを2回洗います。
    5. 1.1 x 107 HEK293TN細胞を9枚のポリL-リジン被覆15 cm組織培養皿にシードし、トランスフェクション時に細胞が約90%の合流率に達することを保証します。
      注:最大ウイルス価を必要としない用途では、レンチウイルス産生を少ないプレート数(例:3枚または6枚)に縮小し、収率を比例して減少させることができます。トランスフェクションのために試薬(プラスミドDNA、PEI、DMEM)を適切に縮小してください。
  2. PEIベースのレンチウイルストランスフェクション
    1. レンチウイルス産生用のプラスミドDNAを、95 μgのgRNAライブラリープラスミド、95 μgのパッケージングプラスミドpsPAX2(Addgeneプラスミド#12260)、65 μgのVSV-GエンベローププラスミドpMD2.G(Addgeneプラスミド#12259)からなる3つのプラスミドシステムを用いて、レンチウイルス産生用のプラスミドDNAを準備します。
    2. レンチウイルス産生用の3つのプラスミドを10.8mLの血清フリーDMEMに組み合わせ、約10秒間ボルテックスで十分に混合します。
    3. 薄めたDNA溶液に1 mg/mLのポリエチレンニミン(PEI)366 μLを滴ごとに加え、約10秒ほどボルテックスで十分に混合し、室温で10〜30分間培養します。
    4. 複合形成中にHEK293TNプレートから培養培地を吸引し、血清フリーDMEMを14mL追加します。
      注:胎児用牛血清は細胞によるプラスミド取り込みを阻害することがあります。
    5. 1.2mLのDNA-PEI複合体をプレート全体に滴ごとに分散し、均等な分布を確保するためにロックします。
    6. 細胞を37°Cで5%のCO2 で6〜8時間培養します。
    7. 各プレートの培地を、20mLの予熱済みDMEMに10%胎児用牛血清(1%ペニシリン-ストレプトマイシンなし)を加え、37°Cで5%CO2で細胞培養を続けます。
      注意:PEIへの長期曝露と血清不足はウイルス量を減少させるため、夜間のトランスフェクションは推奨されません。
  3. ウイルス収穫と超遠心分離
    1. ショ糖クッション溶液200 mLを、ショ糖40g、塩化ナトリウム11.7g、1 M HEPES 4 mL(pH 7.4)、0.5 M EDTA(pH 7.9)1 mLを適切な無菌蒸留水の容量で混合し、0.45 μmの低タンパク質結合ポリエーテルスルホンろ過ユニットでろ過滅菌します。この溶液は4°Cで数ヶ月間保存可能です。
    2. レンチウイルス上清液をトランスフェクション後48〜72時間以内に採取します。
    3. 10mLのDMEMに10%胎児用牛血清を補足し、0.45μmの低タンパク質結合ポリエーテルスルホンろ過ユニットに通します。流れを捨てましょう。上澄液をフィルターにかけて真空をかけます。
      注意:すぐに濃度測定ができない場合は、清算済みのウイルス上清液を4°Cで一晩保存してください。
    4. 超遠心分離機チューブに30mLの精製ウイルス上清液を加えます。
    5. 清化したウイルス上清液の下にゆっくりと4mLのショ糖クッション溶液を敷きます。
    6. 超遠心分離機チューブをスイングバケットローター対応のアダプターに取り付け、チューブのバランスを正確に調整します。
    7. チューブを104,000 × g で4°Cで少なくとも2時間遠心分離します。
      注:Beckman JS24.38ローターのようなスイングバケットローターは、ウイルスをショ糖クッションに適切にペレットで送り込むために必要です。
    8. 上清液は、チューブ底部に薄い白色または半透明の膜として見えるウイルスペレットを乱さずに慎重にデカントしてください。
    9. チューブを少なくとも10分間自然乾燥させ、ペレットを乱さずにチューブ内の残留液体をできるだけ取り除くために実験室用ワイプで拭き取ります。
      注:チューブの適切な乾燥は、最終的な回収量を減らすため、高いウイルス濃度を達成するために非常に重要です。
    10. ウイルスペレットを20μLの冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水に再懸浮させ、気泡を避けながら慎重に上下にピペットを動かします。
    11. チューブを氷の上で2時間、優しく攪拌しながらウイルスペレットを完全に再懸浮させてください。
    12. 濃縮ウイルスをクリーンなマイクロフュージチューブに移し、2,000 × g で遠心分離し、4°Cで5分間溶液を清算します。
      注意:このスピンは、手術中に注射針を詰まらせるゴミや残留粒子を除去します。
    13. 繰り返しの凍結・融解を避けるため、濃縮ウイルスを使い捨てに分けて保存し、-80°Cで保存します。
  4. LSL-tdトマトマウス胚性線維芽細胞(MEFs)を用いたレンチウイルス滴定
    1. 感染の1日前に6ウェルプレートに10万個のLSL-tdトマトMEF(Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909])をプレートし、10%胎児用牛血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補足し、37°Cで5%CO2を添加して培養します。細胞数のためにもう一つの井戸を盛り上げてください。
      注:LSL-tdトマトMEFはレンチウイルス内でクレのレポーターとして機能します。他のバグルンのウイルス滴定に適したリポーターシステムが使用されることがあります。
    2. 翌日、追加の井戸からLSL-tdトマトMEFの数を数え、感染時の細胞数を定量化します。
    3. Creリコンビナーゼをコードする濃縮レンチウイルスを、合計2 mLのDulbecco's modified Eagle培地に10%胎児用牛血清を添加して希釈します。一般的に、0.4 μL、0.1 μL、0.025 μLの濃縮ウイルスでクリーンな動的線形範囲が得られます(図4A–D)。
    4. LSL-tdトマトMEFの各ウェルに2 mLのウイルス希釈物を加え、それぞれ10 mg/mLのポリブレン2 μLを加えます。
    5. MEFに感染させるには、400 × g で37°Cで90分間回転させてください。
    6. ウイルス培地を2mLのDMEMに10%胎児用牛血清、1%ペニシリン・ストレプトマイシンを補足し、37°Cで5%CO2 を48〜72時間培養します。
    7. tdトマト陽性細胞を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで定量し、各希釈時の感染細胞の割合を決定します。
    8. 感染細胞の割合と感染時の細胞数に基づいて機能的滴価を計算します。
      注:CRISPR-KOおよびCRISPR-Aウイルスは別々に製造、濃縮、滴定されます。LSL-tdトマトMEFを用いて機能的滴価を測定し、CRISPR-KOとCRISPR-Aウイルスを一定の比率で混合し、誘導内注射前に用いられます。
  5. プラスミドおよびレンチウイルスライブラリの品質評価
    1. gRNAライブラリーが十分な深さとカバレッジでクローニングされ、クローニングおよびウイルス生成中にすべてのgRNAが維持されていることを確認するためには、プラスミドプールおよびトランスデューションされたMEFsのシーケンスを強く推奨します。
    2. レンチウイルスのカバレッジを評価するために、計算されたウイルス価に基づき>1000×カバレッジのMEFをトランスフェクトします。この段階で細胞の単一感染を保証する必要はありません。
    3. 48〜72時間後にトリプシンまたは細胞スクレーパーで細胞を剥離し、細胞をペレット状にします。市販のgDNA抽出キットを使ってDNAを抽出します。
    4. セクション5で説明されたプロトコルを用いて、プラスミド1μg、抽出したMEF DNA3μgをシーケンスします。500万リードのディープシーケンシングは、<5000 gRNAを持つほとんどのカスタムライブラリで十分です。
      注:プラスミドプールのリード数(R2> 0.6)とガイドの比較的均等な分布>(1log 10以内のガイドの70%)と、ライブラリ数を支配するガイドが存在しない場合、品質が良好であることを示す(図4E)。

3. マウス乳腺への導管内レンチウイルス注射

  1. 針とウイルスの希釈
    1. マイクロピペット針引き手を使ってガラスの微細毛細血管針を引き抜き、9〜10μLの管内注入に適した細かい先端毛細血管を作り出します。細い鉗子を使って針の先端を折り取ってください。
      注意:最適な位置は、液体を詰められる大きさでありながら、乳首の開口部に簡単に収まる細い針のサイズを作り出します。
    2. レンチウイルス製剤を無菌リン酸塩緩衝生理食塩水に0.05%(w/v)Fast Green FCF染料を補足し、最終濃度1× 10 pfu/mLまで希釈します。
    3. CRISPR-KOとCRISPR-Aウイルスを同じ複合プール内でスクリーニングする場合、無菌リン酸緩衝生理食塩水で2つのライブラリーを等しいウイルスタイターに調整し、両ライブラリーでgRNAの比率が均等になるように混合します。
  2. マウスの管内注射準備
    1. 成虫の雌マウス(生後8〜20週)を4%イソフルランで1L/min酸素で麻酔し、両眼に無菌眼用潤滑剤を塗布して角膜乾燥を防ぎます。
      注意:管内注射は非侵襲的な処置であり、鎮痛は必要ありません。これらの実験にはRosa26-LSL-Cas9、H11-Cas9、またはRosa-LSL-tdトマトマウスを使用します。
    2. マウスを覆い付きの温熱パッドの上に仰向けに固定し、体温を維持し、鼻コーンを通じて2%イソフルランと1L/min酸素を投与して麻酔を維持します。
    3. 第3胸部と第4腹部の乳首の周囲の毛を除毛クリームで除去し、滅菌綿棒で半径約0.5cmの円形の部分に10〜15秒間塗布します。皮膚の刺激を防ぐために、すぐに滅菌ガーゼと滅菌水でクリームを除去してください。
      注意:第3および第4乳腺は通常、最も注射が容易です。あるいは、第2および第5腺も同様に注射のために準備されることもあります。
    4. 乳首周辺の皮膚は、滅菌ガーゼを使って70%イソプロピルアルコールとヨウ素を順番に綿棒で消毒してください。
    5. マウスをバイオセーフティキャビネット内の解剖顕微鏡下に置き、乳首をはっきりと観察できるようにします。
    6. 70%エタノールで洗浄した細かい鉗子を使い、乳首に覆いかぶさった古い皮膚を優しく取り除き、乳管の開口部を露出させます。
      注意:この死んだ角化層は緩く付着しており、針の侵入を妨げる可能性があります。除去は生存可能な皮膚や下組織を損傷しないはずです。
  3. 管内注射
    1. 薄めたウイルス8μLをプルしたガラスの微細毛細管に注入します。
    2. 細かい鉗子で乳首部分を保持し、針先を乳首の開口部に優しく差し込みます(図5A)。適切に刺された針は抵抗を最小限に抑えてダクトに入ります。ウイルスの懸濁液を5〜10秒かけてゆっくりと乳管内に投与します。
      注:1 × 107 pfu/mLレンチウイルス8 μL投与すると、乳腺腔上皮細胞の感染率は約30%、乳腺基部上皮細胞の感染率は約5%で、間質36の感染はごくわずか(<0.5%)となります。ウイルス価は感染力の高減を調整できます。
    3. 解剖顕微鏡で注入中のファストグリーン染料の拡散を監視してください。皮膚下の管ネットワーク全体に染料の拡散を観察することで、誘導管内投与の成功を確認します(図5B)。
    4. 乳管樹に沿ってではなく乳首に隣接する乳腺脂肪パッド内に染料をたたまることで、注射失敗を特定します(図5C)。
    5. 両側の第三胸部と第四腹部乳腺に注射を繰り返し、マウス1匹あたり合計4つの乳腺を注入します。
      注:経験から、誘導内投与の成功率は注射の>95%で達成されています。脂肪パッド内に限定された失敗した注射は副作用を伴わず、残った腺は引き続き使用可能です。注射のさらなる検証は免疫組織化学およびフローサイトメトリー(図5D,E)によって実施可能です。
    6. 麻酔を中止し、マウスをきれいなリカバリーケージに移してください。
    7. ネズミが完全に歩けるようになるまで監視し、正常な行動が確認されたら指定されたバイオセーフティハウジングに戻してください。
    8. 注射から3日後にケージ全体を交換し、ウイルス性廃棄物として飼育や寝具を捨て、ネズミを清潔なケージに移して標準的な飼育環境に戻します。

4. 乳腺および腫瘍からのゲノムDNA分離

注意:マウスは動物飼育ガイドラインに従い、CO2曝露または麻酔薬の過剰投与および子宮頸部脱臼によって安楽死させてください。規制ガイドラインに従い、所望の時期または人道的なエンドポイントで乳腺または乳腺腫瘍を採取すること。感染細胞は、レンチウイルス感染後48時間以内に36.55、野生型マウスでは注射後5+か月まで、またはがん性マウスでは>24ヶ月後55で採取されています。以下の手順は、DNA消去剤で清掃された空間と、sgRNA/dgRNAカセットを含むプラスミドのない機器で行うべきです。プラスミドDNAの微量でも組織サンプルの汚染を引き起こすため、その後の深層シーケンシングPCRおよび陰性(組織なし)コントロールを実施し、調製をクリーンに保つ必要があります。

  1. 組織解離
    1. 乳腺については、各乳腺を2 mLの完全なエピカルトB培地(マウス)に0.2 mLの穏やかなコラーゲンゼ/ヒアルロンダーゼを15 mLの円錐形チューブで消化し、37°Cで一晩培養します。
    2. ペレットは450 × g で室温で5分間細胞を解離しました。
    3. 牛血清アルブミンコーティングピペットの先端を使って上部脂肪層を慎重に15mL円錐形チューブに移し、残った上清液は廃棄します。
      注:この段階の上部脂肪層には、分離されていない残留上皮オルガノイドが残り、脂肪組織と関連していることが多いです。この部分を別のチューブで処理することで、上皮細胞の回復が大幅に促進されます。
    4. 脂肪分画と細胞ペレットの両方をリン酸塩緩衝生理食塩水5mLで一度洗浄し、室温で450× g で5分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
    5. 洗浄した脂肪分と同じ乳腺の細胞ペレットを15mLの円錐形チューブに組み合わせ、5mLのリン酸塩緩衝生理食塩水を含みます。
    6. 450 × g で5分間ペレットで混合物を塗り、上清液を捨てます。
    7. 乳房腫瘍の場合は、無菌ハサミまたはメスで組織を小さな塊に細かく刻み、直接2mLのマイクロフュージチューブに移します。
  2. ゲノムDNA分離
    注意:ゲノムDNA抽出は、メーカーの指示に従うQiagen DNEasy血液・組織キットを使用するか、以下のフェノール-クロロホルムプロトコルを使用して行うことができます。
    1. DNA解析バッファーを1 M Tris-HCl(pH 8.0)5 mL、EDTA(pH 8.0)1 mL、5 M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mLを混合し、最終的な容量を滅菌蒸留水で500 mLにします。
    2. 各サンプルに1mLのDNA解析バッファーと10μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL)を加え、逆置で十分に混合します。
    3. サンプルを56°Cで一晩培養し、完全な溶解を許可します。
    4. 遠心分離機は16,000 g ×室温で5分間溶解し、不溶性の破片をペレットで除去します。
    5. 浄化された上清液を新しい2 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      注意:フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールは有毒で腐食性があります。化学溶媒を使ったすべての作業を、適切な個人用防護具を着用しながら化学換気フード内で行ってください。
    6. フェノール:クロロホルム、イソアミルアルコールを同量に加え、約15秒間渦巻きを繰り返して均一な混合物が形成されるまで激しく混ぜます。
    7. 有機相と無機相を分離するために、16,000 × g で4°Cで10分間遠心分離機を用います。
    8. 上部水相を新しい管に慎重に移し、間相を乱さないようにしてください。
      注意:タンパク質やRNAの汚染を最小限に抑えるため、白色間期からの吸引物は避けてください。
    9. 回収した水相にイソプロパノールを0.7量加え、約15秒の渦巻きで激しく混合します。
    10. 遠心分離機で16,000 × g 、4°Cで10分間。
    11. 上澄液を慎重に捨て、DNAペレットを70%エタノール500μLで洗い流します。
    12. 16,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、エタノールを完全に除去します。
    13. DNAペレットは室温で10分間自然乾燥させます。
    14. DNAペレットを滅菌蒸留水50μLに再懸濁させます。
    15. ゲノムDNAの完全な再懸濁を促進するために、サンプルは37°Cで1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
    16. DNA濃度と純度はナノドロップまたは蛍光定量で測定します。

5. CRISPRライブラリの次世代シーケンス


注意:gRNAフォールド変化の時間経過を計算できる基準サンプルを生成してください。感染から3日後に採取されたMEF(セクション2)や乳腺(セクション4)、および元のプラスミドmaxiprepを用いて、開始ライブラリやウイルス株におけるガイド表象を決定できます。

  1. ゲノムDNAからのgRNAカセットのPCR増幅
    1. 表2に記載されたプライマーペアを用いてサンプルを一意にインデックスし、シーケンス後に最大306サンプルの多重化および復多重化を可能にします。
    2. 1μgのゲノムDNAをテンプレートとして、25μLの2xQ5マスターミックス、2.5μLの10μMフォワードプライマー、2.5μLの10μMリバースプライマーを含む総反応体積のPCR反応を準備します。
    3. 汚染監視のために並行して無テンプレート制御反応を含みます。
    4. 以下のサイクル条件を用いてPCR増幅を行い、ライブラリー特有のプライマーの融点に基づいてアニーリング温度を調整します。
      98°Cの1サイクル、30秒
      98°Cで10秒、68°C(-1°C/サイクル)で10秒、72°Cで15秒の5サイクル
      98°Cで10秒、63°Cで30秒、72°Cで15秒の20サイクル
      72°Cのサイクルを2分間
    5. PCR産物を2.5%アガロースゲルで分離し、正しいアンプリコンサイズを確認します。
    6. pLKOベースのsgRNAライブラリーで約306 bp、pXPR502ベースのdgRNAライブラリーで約430 bpのバンドが存在するか確認してください(図6)。
      注:明確なノーテンプレート管理は試薬の純度を保証し、アッセイが交差汚染がないことを確認します。
    7. 適切なDNA精製法を用いてPCR産物を精製し、フルオメトリック定量を用いてDNA濃度を定量します。
  2. 次世代シーケンシング
    1. 予想されるライブラリの複雑さとサンプルクローン性に基づいて必要なシーケンス深度を決定します。
      注:クローンと疑われる腫瘍の場合、1サンプルあたり約100万本のリードでガイド表象を正確に定量化できます。乳腺からのシーケンス深度を計算するには、ライブラリ内のガイド数に1,000倍のカバレッジを掛け、さらにゲノムDNA/細胞あたり6 pgを掛けて、PCR増幅すべきサンプルあたりのゲノムDNAの総質量を算出します。シーケンスに必要な総リード数は、図書館内のガイド数に1,000枚を掛けたものです。
    2. 異なるサンプルから等モル濃度で精製ライブラリーをプールします。
    3. ショートリードのIlluminaシーケンスプラットフォームを用いてライブラリをシーケンスプーリングしました。
  3. データ分析
    1. サンプル固有のインデックスを用いて生のFASTQファイルをデマルチプレックスします。
    2. トリムはトリムモマティック69を使ってgRNAプロトスペーサー配列を読み取ります。CRISPR-Aサンプルではトリムリードは14 bp、CRISPR-KOではフォワードプライマーの末端から20 bpまでトリムが読み出されます。
    3. Bowtie70を用いて、アライントリムドリードを対応するgRNA参照ライブラリに割り当てます。CRISPR-KOには -v 2 および -m 1 のアライメントパラメータを、CRISPR-Aおよび混合プールには -v 2 および -m 2 を使用します。
      注:通常、リードの90%以上が正常にアラインアップされています。低いアライメントは通常、トリミングミス、入力ファイルの誤フォーマット、またはPCR中のサンプル汚染が原因です。
    4. MAGeCK72のカウント関数を用いて各gRNAのアラインメント済みリードを定量し、最終的なgRNAカウント表を作成し、後続解析を行います。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、マウス乳腺におけるプール 型in vivo CRISPRスクリーニングのプロトコルを提供します。このパイプラインは、オリゴヌクレオチド配列からプールされたgRNAライブラリーを設計・増幅し、gRNAライブラリをレンチウイルスの骨格にクローンし、高滴価レンチウイルスを生成し、成体乳腺へのレンチウイルスライブラリーを導管内送達し、シーケンスに基づくライブラリ表現のデコンボリューションのためにgRNAを回収するためにエンドツーエンドで使用できます(図1)。

プールされたgRNAライブラリーの増幅およびクローニングの成功は、まずアガロースゲル電気泳動によって評価されます。gRNAライブラリのPCR増幅は、プールされたオリゴヌクレオチドチップアレイからの均一増幅を示す離散バンドを得られます(図2A)。pXPR502 PPH-CreおよびpLKO Creの骨格の制限消化により、線形...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プール型in vivo CRISPRスクリーニングにおける重要な考慮点は、クローナル解像度2を保ちつつ、単細胞トランスダクションを限定しつつ十分なライブラリーカバレッジを達成することです。マウス乳腺では、上皮区画は保守的に1つあたり約3.5個×10個5細胞で構成されています。36。平均レンチウイルスのトランスダクション率が15%であり、細胞あたりの複数の感染の頻度を最小限に抑える場合、管内送達により1腺あたり約5×10個の4個の上皮細胞が伝達されます。36,55。したがって、第三胸部および第四腹部乳腺の両方に両側注射すると、マウスあたり約2 ×10 5個の上皮細胞が伝達され...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S.はViVerita Therapeuticsのコンサルタント兼創設者であり、彼の研究室はViVerita Therapeuticsと研究契約やサービス契約を結んでいます。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究に関連する有益なコメントや議論をいただいた研究室の皆様に感謝いたします。また、カナダ・トロントのルネンフェルド・タネンバウム研究所(LTRI)でのマウス研究におけるフェノゲノミクスセンターの皆様のご協力と専門知識に感謝し、感謝いたします。この研究は、カナダ保健研究所(PJT462506)からのプロジェクト助成金およびテリー・フォックス研究所プログラムプロジェクト助成金(TFRIプロジェクト#1107)からD.S.、そしてニコル・ファミリー財団によって支援されました。E.R.L.はカナダがん協会研究訓練賞とフランク・フレッチャー記念基金の支援を受けました。K.N.A.はH.L.ホームズ博士研究員賞およびがん研究学会からの助成金1318698および26089の支援を受けています。J.N.はカナダ健康研究所(CBR)の大学院奨学金(修士課程)およびカナダ健康研究所博士研究賞(#193389)の支援を受けました。Y.Lはカナダ健康研究所(CAHR)の研究優秀・多様性・独立フェローシップ(#ED6-190718)の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 micron フィルターSigmaS2HVU02RE
12k または 92k オリゴチップCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm 細胞培養プレートCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
アルカリホスファターゼNEBM0290L
アンプルシリンFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart バッファーNEBB6004S
ディープシーケンシング (Next-Seq または Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA 抽出キットQiagen69506
Dulbecco’s 改変 Eagle 培養基Wisent319-015-CL
Endura エレクトロコンピテント細胞Lucigen60242-1
EpiCult-B マウス培養基キットStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
胎児ウシ血清Wisent090-150
Gel DNA-クリーンアップキットZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser 電気穿孔キュベットBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
高速遠心機Beckman CoulterMLS-50
キムワイプKimberly-Clark34155
LB アガーWisent Technologies800-011-LG
マイクロピペットプラーSutter InstrumentP97
ミニプレッププラスミドキットFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (BsmBI バッファー)NEBR0580L
オリゴクリーンアンドコンセントレーターZymo ResearchD4061
オリゴクリーンアップキットZymo researchD4060
PAGE 精製 illumina シーケンシングプライマーIDT DNA
PCR マイクロピペットDrummond5-000-1001-X10
PEI (ポリエチレンイミン)Sigma408727-100ML
ペニシリンとストレプトマイシンWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
ポリ-L-リジンSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 ポリメラーゼ 2x マスターミックNEBM0494L
Qubit フローロメトリック定量InvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato マウスJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA リガーゼNEBM0202L
超遠心チューブBeckman Coulter344058
真空フィルターユニットFisher ScientificSCHVU02RE

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

233 233
動画は近日公開

関連記事