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方法論記事

社会的交流中の個々のマウスに超音波発声を検出し割り当てる方法

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DOI：

10.3791/71121

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2026年7月7日

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1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、複数マウスの社会的交流中に同期された映像および音声データを記録する方法を説明しています。この手法は、マイクロフォンアレイと音源の位置定位を用いて、個々のマウスに超音波発声(USV)を割り当てることで、動物や社会的文脈をまたぐ発声行動の定量的分析を可能にします。

要約

マウス(Mus musculus)は社会的交流中に超音波発声(USV)を使ってコミュニケーションを取っています。しかし、マウスのUSVは明確な視覚指標と関連がなく、人間の聴覚範囲外の周波数で発生するため、グループ内で個体が鳴くマウスを特定するのは依然として困難です。このプロトコルは、多動物の社会的交流中に同期したビデオおよび超音波音声データを記録する方法を説明し、行動と発声活動を同時に記録できるようにします。複数動物トラッキング、発声検出、音源の位置特定、個々の動物への発声割り当てを統合した計算パイプラインが概説されています。パイプラインの各段階で、追跡精度、発声抽出、位置特定精度、割り当て信頼度を評価するための検証手順についてさらに説明しています。このプロトコルを4匹の動物による実証データセットに適用すると、個別に分解された発声トラッキング、空間的に正確な音源推定、そして声の出力や音響的特徴の定量的測定が得られます。これらのアプローチは、声によるコミュニケーションと個々の行動を結びつける堅牢な枠組みを提供し、自由に交流するマウスにおける性差、個体差、社会的コミュニケーションの下流解析を可能にします。

概要

動物界における社会的コミュニケーションは行動動態の重要な要素であり、生存や繁殖などの過程を助けます1,2。哺乳類の間では、マウスは35kHzから110kHzまでの周波数をカバーするUSVを介して音響的に通信します。USVは行動の文脈に応じて情報を伝える複雑な特徴を示します。メスマウスはオスのマウスUSVsを好む傾向を示し5,6、オスとメスのマウスは求愛行動中に声で交流する7。これはUSVが主要な社会的シグナルとして機能していることを示しています。特定のUSVの特徴はマウスの異なる行動状態に関連しているため、個体に正確な発声を割り当てることは社会的相互作用を理解する上で不可欠です。

USVの機能と社会的行動との関係を解明しようとする広範な努力にもかかわらず、この分野での継続的な課題は、グループ相互作用中に個々のマウスにUSVを割り当てることです。問題は、USVの生産 中に口の動きが目に見えないこと、そしてUSVの周波数帯が人間の耳には聞こえないことの両方にあります。その結果、USVと社会的行動の関係に関するこれまでの研究は、観察可能な集団行動の範囲を制限する簡略化されたアッセイや制約された環境に限定されており、自由に交流する動物における発声行動の展開についての洞察は部分的にしか提供されていません。

聴覚コミュニケーションと社会的行動の関係を深めるためには、マウスの行動の全範囲を捉え、グループ内の個体に発声を割り当てる必要があります。ボーカライザーの同一性を解明することは、個人間の性別や文脈依存的な声域を決定する目的で不可欠です。8、特定の声の特徴が同種の行動をどのように駆動するかについての因果仮説の検証、そして該当する場合は同時に測定された脳信号(例:電気生理学)と声の出力を相関させることです13。.歴史的には、オスのマウスだけが発声器だと考えられていました。しかし、音源の位置特定により、メスのマウスもグループ環境でUSVを発生させることが明らかになりました。7、またはオスと組み合わせた場合に14。どの動物がUSVを発したのか特定できなければ、自由に交流する集団における声の特徴を個々の行動や社会的結果に結びつけるのは限られています。したがって、個々の動物に鳴き声を割り当てつつ自然な相互作用のダイナミクスを保つ局在化システムを利用することが不可欠です。

ここで説明するマイクアレイ音源定位システムは、以前に7,15で発表されており、アリーナ内のUSVの空間的起源を推定し、発声時に存在していたすべての動物の位置を追跡して、発声者に発声を割り当てることを可能にします。その後、音源推定と追跡された動物位置を確率ベースの指標を用いて統合し、USVを個々の動物に割り当てることを支援します。発声割り当ては、これまで曖昧だった集団の発声記録をラベル付き動物の発声データに変換し、発声の種類やタイミングを行動およびその後の同種行動に結びつける定量的分析を可能にします。本研究の目的は、この手法を実装するための詳細なプロトコルを提供することであり、以前に定量化・検証されていました。以下のプロトコルは、このシステムのセットアップ、キャリブレーション、実装方法を概説しており、マイクロフォンアレイの形状、音声・映像同期、自動音声検出および確率的音源推定、多動物の位置追跡、そしてUSVを放出動物に割り当てるための割り当て手順を含みます7,15。

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プロトコル

動物を対象としたすべてのプロトコルは、デラウェア大学動物ケア・利用委員会(プロトコル番号:1275)によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 音源の位置定位装置の構築

  1. 録音室を準備しろ。
    1. 直方体フレーム(76.2 cm × 76.2 cm × 61 cm;幅×長さ×高さ)を録音アリーナとして組み立て、防音装置に設置します。
    2. 壁はナイロンメッシュで作り、外側には吸音フォームで内側を敷いて音の反射を減らします。
    3. 記録室の外側、しかし近くに温度計を置いて、録音中の周囲温度を監視します。
    4. すべての録音は暗い環境で行ってください。
      注意:録音セッションを通じて安定した環境条件を維持し、環境パラメータを記録してください。
  2. 映像と音声の録画システムを設定してください。
    1. アリーナ上部に赤外線照明を設置し、暗闇でのビデオ撮影を可能にします。
    2. アリーナの上にビデオカメラを設置し、30Hzで連続録画するように設定してください。
    3. 音声取得システムを構成し、8チャンネルマイクアレイから超音波信号を250kHzのサンプリングレートで記録するよう設定します。
      注:このシステムでは8基のマイクが使用されましたが、実験的なニーズに応じてマイクの数を調整可能です。
    4. 共有の外部トリガーを使って映像と音声の記録を同期させ、時間的な整合性を確保しましょう。
    5. 映像と音声データが同時に記録され、各セッションごとに保存されていることを確認してください。
      注:ハードウェアと調達ソフトウェアはそれぞれ 材料表 および 表1に記載されています。
  3. マイクとアリーナを手配しろ。
    1. アリーナの壁に沿ってマイクを均等に配置(壁につき2つ)。
    2. マイクの中心は38.1cm、各角から19.05cm、アリーナの床から10.8cmの間隔で位置付けます。
    3. マイクの位置を目でマーキングし、後でキャリブレーションや検証を容易にします。
      注意:LEDはマイクの位置を示すために使用できます。

2. 社会的行動の記録準備

  1. 実験動物をセットアップします。
    1. 録画するマウスを選択します。ここでは、記録時点で生後8週から12週のC57BL/6Jマウス2匹と雌2匹のグループが使用されました。
      注:現在の実験パラダイムにおける株、性比、年齢範囲、記録日数は、異なる実験目標に合わせて調整可能です。この方法の実証のために、実験マウスの一部を2日間の記録日に再利用しました。12週以上のC57BL/6Jマウスは高周波音に対する感度低下を示すことがあります16。
  2. 動物たちを飼いましょう。
    1. 記録の14日前から、ネズミを個別に飼育してください。
      注:個別住宅は、過去の社会的経験がグループ間の交流に与える影響を最小限に抑えます。
    2. 各ケージに寝具やリッチメント、そして 自由に 餌や水を用意してください。
  3. 動物を視覚的に識別できるようにマークしてください。
    1. 記録の2日前に、密閉チャンバー内の精密蒸気器を用いて、酸素に2.5%イソフルランを1L/分の流量で麻酔します。各マウスが麻酔されたら、チャンバーから移し出し、背中にアクセスできるように平らに寝かせ、マーキング中は鼻のコーンから麻酔を受けます。
      注:現在の実験パラダイムで記述されている麻酔プロトコルは、当動物プロトコルで承認されており、各マウスに連続的に適用されましたが、動物や実験目標に応じて調整可能です。
    2. 各マウスが麻酔下にある間、無毒のヘアダイを使って背中に独自のパターンを施し、追跡中に視覚的に識別できるようにします。
    3. 造影剤が定着する間、各動物を継続的に監視し、約15分間麻酔を維持し、麻酔の持続時間を記録します。
    4. マウスをすすいで温めたリカバリーケージに入れ、完全に歩ける状態まで待ってください。
    5. ネズミを個別の清潔なケージに戻し、寝具や環境、餌や水へのアクセスを確保してください。
      注意:オスの嗅覚の手がかりの伝達を最小限に抑えるため、オスより先にマーキングを施してください。
  4. 異性曝露を行う。
    1. 録音の前日には、寝床なしで清潔なケージを用意してください。
    2. 実験マウスごとに、その動物をケージに入れ、その後に異性の新しいマウスを連れて行きます。
    3. 動物同士が10分間交流できるようにしましょう。
    4. 相互作用を観察し、行動イベントを手動で記録します。
    5. 曝露後は、実験動物を個別のケージに戻してください。
      注:異性曝露は現在の実験パラダイムに特有であり、その後のグループ録音時の発声行動の可能性を高めるため17;しかし、これは説明された方法の必須要素ではありません。交尾行動が観察された場合は別々に動物を分けてください。
  5. メスの発情状態を特定しましょう。
    1. 記録の約2時間前に、メスのマウス(メス被験者の場合)の発情状態を評価してください。
    2. リン酸塩緩衝生理食塩水30μLを用いて膣洗浄を行います。
    3. 洗浄サンプルをきれいな顕微鏡スライドに移し、均等に広げます。
    4. スライドを完全に乾かします。
    5. 各スライドにクリスタルバイオレットの染色を塗り、ピペットで水で優しくすすぎます。
    6. スライドを光学顕微鏡で観察する。
    7. 発情状態は核上皮細胞、角膜上皮細胞、白血球の相対的な割合に基づいて分類する18。
    8. 各女性の発情状態を記録してください。
      注:USVは発情期19、20期の女性の受容性に影響を与える可能性があるため、発情状態の判定は現在の実験パラダイムに特有です。しかし、これは説明された方法の必須要素ではありません。

3. 社会的相互作用の記録

  1. 録音アリーナの準備をしろ。
    1. アリーナの床に白紙ベースの寝具を約1.25cmの均一な深さで加えます。
    2. 寝具がすべての角を均等に覆うようにしましょう。
    3. すべてのマイクが整列し、障害物がなく、アリーナに向けて設置されていることを確認してください。
    4. 実験録画の前に、定規と高コントラストの物体をアリーナの中央に置き、カメラのピントを確認し空間のスケーリングを確立します。
    5. 行動記録を始める前にキャリブレーションオブジェクトを取り外してください。
      注:白い紙ベースの寝床は、濃い毛の動物にコントラストを提供し、追跡を容易にします。もしより明るい毛の動物を使う場合は、黒い紙ベースの寝床が追跡に役立ちます。記録時間が延長される場合は、アリーナに食べ物と水を加えてください。定規に南北・東西方向の方向を示すマーカーを追加することで、8本のマイクの識別が容易になります。
  2. 事前のシステム録画を行う。
    1. 行動記録の直前に、赤外線ライトを点けて15秒の背景雑音を記録します。
    2. 赤外線ライトを消しマイクインジケーターランプを点灯させた状態で、マイクの位置定位テストを15秒録画します。
    3. すべての事前挙動記録は、後でシステム性能の検証のために保存してください。
      注:これらの録音はマイクの機能や基準ノイズレベルを確認するために使用されます。録音に使用されるスクリプトは関連するコードリポジトリで利用可能です。
  3. グループの社会的行動を記録しましょう。
    1. データ収集前に動物との接触を最小限に抑えるため、すべての記録設定を事前に準備してください。
    2. メスのネズミをアリーナに入れます。
    3. オスのネズミをアリーナに入れます。
      注意:同性の複数の動物を録画する場合は、両方の動物を同時に配置してください。
    4. 筐体を閉じて録画を始めてください。
    5. グループの社会的行動を10分間連続で記録します。
      注意:録画時間は調整可能です。
    6. 前処理前に、映像や音声ファイルが読みやすく破損していないか必ず確認してください。
    7. 録音の最後に、1匹を除くすべての動物を排除してください。
  4. 個々の動物を記録する。
    1. 残ったマウスをアリーナに10分間一人で記録します。
    2. 残りのマウスそれぞれを個別に録音を繰り返します。
    3. 個別の記録が終わったらすぐに各マウスの重さを測ってください。
      注:個別の記録は、複数動物の追跡訓練と検証に使用されます。各録音セッション前にリグ内の温度を記録してください。温度は音の伝播に影響します。映像や音声ファイルが破損または不完全の場合は録画セッションを繰り返してください。

4. ビデオ前処理

  1. ビデオファイルを準備してください。
    1. すべてのビデオ録画が実験に関連する単一のディレクトリに保存されていることを確認してください。
  2. トラッキングのために映像の強度を調整してください。
    1. 必要に応じて、すべての映像フレームに均一な明るさ調整を行い、各ピクセルに一定の値(brightness_adjustment x 255)を加えます。brightness_adjustmentは照明条件によって通常0.1から0.6の範囲のスカラーです。
    2. 必要に応じて、定義された入力範囲(例:[0.2, 0.8])で強度リマッピング(例:MATLABのimadjustment関数)を用いてグローバルコントラスト調整を行い、最大20%のピクセル強度を黒に、最大80%のピクセル強度を白にマッピングし、中間値を線形にスケールします。この工程は、明るい色の識別マークと背景との分離を深めるために行われます。
    3. クリップピクセル強度をビデオビット深度の有効な範囲(8ビットビデオでは0から255まで)に調整します。
      注意:一貫性を確保するために、録画内のすべてのフレームおよび各録音間で同一の前処理パラメータを適用する必要があります。これらの調整は任意であり、録画条件によって異なります。ここで示した代表的なデータには明るさやコントラストの調整は適用されていません。調整が必要な場合は、処理済みの最初のフレームをプレビューし、動物とアリーナ間のコントラストが十分かどうかを確認してから、動画全体を処理する必要があります。
  3. プリプロダクション動画をエクスポートしてください。
    1. 前処理済みのビデオファイルを元の録画と同じフレームレートと時間の整合で保存します。
    2. 参照と検証のために元のビデオファイルを保持してください。
      注:ビデオ前処理に使用されるスクリプトおよび適用される特定のパラメータ値は、関連するコードリポジトリで利用可能です。

5. 多動物追跡

  1. 追跡ソフトとデータを準備してください。
    1. 複数動物追跡ソフトウェアと必要な依存関係をすべてインストールしてください。この研究ではMOuseTRaker(MoTR;表1)出力のフォーマットが、音源の位置特定計算に使われる別のパイプラインソフトウェアMuse(表1)と互換性があるためです。
      注:Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 やDeepLabCut23などの他の自動追跡ソフトウェアも、動物の位置、進行方向、鼻の位置を生成すれば動物の追跡に利用できます。
    2. 単一動物の録画と複数動物の録画を明確に区別するように、前処理済みのビデオファイルを整理してください。
    3. すべての動画ファイルがフレームレートと空間解像度が一貫しているか確認してください。
      注:ソフトウェアのインストール手順および依存関係要件は関連するコードリポジトリに記載されています。
  2. 単一動物モデルを訓練します。
    1. 各実験対象に対応する単一動物の記録を選びます。
    2. 各動物の単一動物記録から抽出した特徴を用いて、それぞれの動物ごとに別々の同一性分類器を訓練します。グループ記録中、これらの動物ごとの分類器出力はフレーム間の軌跡情報と組み合わせられ、動物の同一性が維持されます。
    3. 研修が無事に完了したことを確認してから進めてください。
      注:単一動物記録は、複数動物セッションにおけるアイデンティティ特異トラッキングの初期化に使用されます。
  3. 複数動物の録音を録音してください。
    1. 訓練済みの追跡モデルを多動物の社会的相互作用記録に適用します。
    2. 各被験者の動物の位置、向き、体型をフレームごとに推定します。
    3. 追跡出力は下流分析用に保存してください。

6. 音響セグメンテーション

  1. 音声データを準備しろ。
    1. 各マイクチャンネルからのすべての音声録音が存在し、アクセス可能であることを確認しましょう。
  2. 発声を検出する。
    1. 各録音に対して音響セグメンテーションソフトウェアAx(表1)を実行し、USVを検出します。
    2. Axが考慮する入力ファイルで定義された時間-周波数パラメータを設定します。マイクロフォンのサンプリング周波数は250kHzに設定されていました。
      注:非一様高速フーリエ変換には64、128、256の3つのウィンドウサイズが考慮されました。5テーパー付きマルチテーパーの時間帯域幅積3を適用し、有意性閾値0.05を適用しました。最小サンプル持続時間は0で、低周波カットオフは30kHz、高周波カットオフは110kHzでした。畳み込みサイズは1001 Hz×0.001秒をカバーするように設定されました。調和に関連する信号を統合するために旗も含まれていました。具体的な詳細はNeunuebelらを参照してください。
    3. これらの時間・頻度特徴に基づいて候補USVを抽出します。
    4. 各録音ごとに分割出力をスプレッドシートとして保存してください。
      注意:ソフトウェアのインストール手順、スクリプト、パラメータ設定は関連するコードリポジトリ7に提供されています。
  3. セグメンテーション出力をコンパイルします。
    1. 発声開始時刻、オフセット時刻、周波数境界を含む検出された発声イベントの統合リストを作成します。
    2. 統合された発声ファイルを保存し、下流の局所化解析に備えてください。

7. 音源の位置特定

  1. 入力をローカライゼーションのために準備してください。
    1. 各録音ごとに音響セグメンテーション出力と多動物追跡結果が利用可能であることを確認しましょう。
    2. ローカライズ入力を整理し、音声データ、トラッキングデータ、アリーナジオメトリ情報がローカライズソフトウェアにアクセスできるようにします。
      注:入力ファイルの整理、必要なディレクトリ構造の定義、アリーナジオメトリ情報の収集に使われるスクリプトは、関連するコードリポジトリに提供されています。
  2. 音源の位置を推定してください。
    1. 検出された各発声に音源ローカライゼーションアルゴリズムMUSE(表1)を適用します。
    2. マイクアレイ録音を用いて、アリーナ内の各発声の空間的な起源を推定します。
    3. 各ボーカルに対して、ジャックナイフリサンプリングを用いて音源の位置を推定し、このローカライゼーション手順を8回繰り返します。毎回1本のマイクを省略し、残りの7本のマイクに基づいて推定します。これにより、発声ごとに8つの推定値が得られます。
      注意:マイク間の到達時間の違いは、音源の位置推定に非常に重要です。ジャックナイフ再サンプリングは、ローカライゼーションの信頼性を評価し、個々のマイクロフォンチャンネルに対する感度を低減するために用いられます。音源の位置を推定するためのスクリプトは、関連するコードリポジトリ7に提供されています。
  3. 音源と位置確率分布を計算します。
    1. 各発声について共分散行列24を計算し、これと平均ジャックナイフポイントの推定値を用いてアリーナ全体の確率密度を計算します。
  4. 局在を動物の位置と統合する。
    1. 各発声時のすべての動物の頭部または鼻の位置を追跡して抽出します。
    2. 各鳴き声について、各動物の鼻の位置で位置特定確率密度を評価します。
    3. 各発声について、確率値に基づいて各動物の割り当て信頼度指標を計算します。割り当て信頼度指標は、各動物の鼻の密度値をすべての動物の密度値の合計で割ったものとして計算されます。この指標をマウス確率指数(MPI)15と呼びます。
  5. 発声を割り当てる。
    1. 単一のマウスの割り当て信頼度指標が0.95を超える場合、その信号は7,15に割り当てられます。
    2. 割り当て基準を満たさない発声は未割り当てとラベル付けしてください。
    3. ローカライゼーションや割り当ての出力は、下流の検証や解析のために保存してください。
      注:割り当て閾値、信頼基準、コードは関連する分析スクリプトで提供されています。

8. 結果の検証

  1. 複数動物の追跡を検証する。
    1. 各録音ごとに最終的なトラッキング出力を読み込みます。
    2. 動物の位置や体の形状を対応する映像フレームにオーバーレイで追跡しました。
    3. トラッキング結果を目視で確認し、マウスの正確な位置とフレーム間での一貫したアイデンティティ割り当てを確認します。
      注意:トラッキング結果には、各動画フレームの各マウスに頭部方向を示す色分けされた省略号が重ねられています。楕円サイズと本体の向きは、それぞれマウスのサイズと向きに一致するべきです。録音中、各マウスごとに楕円色は一貫しているべきです。
    4. 追跡ミスを特定し、修正しましょう。
      補正済みの追跡出力は下流解析用に保存してください。
      注意:一般的なトラッキングエラーは、近い社会的交流やアリーナ境界付近で発生します。ヘッドテールのフリップ、アイデンティティスイッチ、エリプスジャンプやドリフトの全てのケースを修正してください。
      注:出力の追跡や誤りの修正を行うプログラムはコードリポジトリに提供されています。
  2. 発声抽出の検証。
    1. 各録音ごとに音響セグメンテーション出力を読み込みます。
    2. 生の音声データから代表的な時間帯のスペクトログラムを生成する。
    3. オーバーレイは個々の発声時間や周波数範囲を含む発声イベントをスペクトログラムに検出しました。
    4. 検出された事象とスペクトログラムで観察された発声との対応を視覚的に確認します。
    5. 系統的な誤差が観察された場合は、抽出および局在化の手順を再実行する前に分割パラメータを調整するか、分割誤差(発声時間や周波数範囲の誤認識)がある場合は手動で調整してください。
  3. 発声割り当ての検証。
    1. 音源のローカライズと割り当て出力を読み込み。
    2. 各鳴き声ごとに、局所推定、空間確率分布、動物の位置を映像フレームに重ねて表示します。
    3. 局在確率密度が割り当てられた動物の頭部付近に集中し、他の動物から明確に分離されていることを確認します。
    4. 割り当て基準に満たない発声が未割り当てとラベル付けされているか確認してください。
      注:割り当て出力のチェックには、すべての期待される出力が生成されていること、各発声の確率マップが発声を割り当てたマウスの周囲およびアリーナ境界内にあることを確認することが含まれます。
    5. 検証済みの課題結果は後続解析用に保存してください。
      注:割り当ての信頼度閾値および検証基準は、関連する分析スクリプトで定義されています。

9. データ解析

  1. 音源の位置を視覚化してください。
    1. 単一または複数動物の録音セッションでは、発声が検出された映像フレームを選択します。
    2. 選ばれたビデオフレームのスキーマ化された表現を生成します。
    3. MUSE出力から、すべてのマイクの位置、個々の音源ポイント推定、推定音源位置、空間確率分布、マウス位置、推定ボーカライザーの識別子、スケールバーをプロットして空間回路図を作成します。
    4. 各マイクチャンネルで記録された対応する発声のスペクトログラムを生成します。
      注:これらの可視化は、個人およびグループの文脈におけるローカライゼーションの性能を質的に評価するのに役立ちます。
  2. 定位誤差と精度を定量化してください。
    1. 推定音源の位置と記録された動物の位置との距離を計算し、位置特定誤差を定量化します。これらの計算には単一のマウス録音を使用してください。エミッターは1つだけで、発生源も既知です。
    2. 割り当ての精度を評価するために、音源推定値と対応する動物の位置を、鳴く動物を中心とした基準枠に変換します。
    3. 中心の動物位置に対する音源推定の空間的分布を可視化します。
  3. 発声を視覚化するためのスペクトログラムを生成する。
    1. ボーカライザーの識別、発声の開始・オフセット時間、高低周波の境界を含むボーカル抽出出力を用いて、関心のある発声帯を特定します。
    2. 各試合で、最初の発声が始まる前から最後の発声のオフセット以降までの時間帯を選びます。
    3. 選択した時間帯のオーディオチャンネルファイルから電圧トレースを抽出します。
    4. 抽出した電圧トレースを時間領域から周波数領域に変換してスペクトログラムを生成する。
    5. スペクトログラム上に割り当てられた発声と割り当てられていない発声に対応する時間点を異なる色でマークします。
    6. 社会的交流の際には、異なる個人が発声する発声の発声を識別し、発声者の識別をアイデンティティ固有の色で示したスペクトログラムを作成します。
  4. 個々の声の量を定量化しましょう。
    1. 音源ローカライゼーションコードの出力を用いて、各発声に識別ラベルを割り当て、非局在化、局在化されていないが割り当てられていない、個別の動物識別を数値的にエンコードします。
    2. 各動物が発する鳴き声の数を合計してください。
    3. 個体間および性別間での発声数を比較してください。
  5. 声の特徴を分析しましょう。
    1. 各発声ごとに周波数の輪郭を抽出します。
    2. 最大周波数、最小周波数、平均周波数、帯域幅、発声時間などの音声パラメータを定量化します。
    3. 性別の声のパラメーターを比較してください。
    4. データの分布特性に基づいて適切な統計解析を実施してください。
      注意:測定変数のパラメトリック特性に合致する統計手法を選択してください。ここでは被験者数が少なすぎて統計的比較は難しい。

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結果

本記事で示された結果は、2日間にわたって行われた記録に基づくもので、もともとWarrenら15に掲載されたプロトコルの成果を示すことを目的としています。これらのデータは統計的推論や一般化された結論を支持するものではありません。

USVの救出と配属
USVは、個人およびグループの社会的交流セッション中にマイク・アレイ定位システムを用いて記録されました。各社会的交流セッションでは、男性2名と女性2名が記録されました。合計で2日間にわたり記録が行われ、記録された動物の識別は 表2に示されています。社会的セッションでは2,783体のUSVが抽出され、そのうち2,773匹(99.6%)が局所化され、1,636匹が個別マウスに割り当てられました(58.8%)。残りの1,137個の局所信号は割り当て基準を満たさず、未割り当てとラベル付けされました。単独セッションでは512匹のUSVが抽出され、そのうち508匹...

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ディスカッション

群れの相互作用におけるUSVを個々の動物に確実に帰属させることは、マウスの発声コミュニケーション研究における大きな技術的制約でした。マウスは社会的コミュニケーションの研究に広く使われていますが、特定の個体に発声を割り当てられないため、自然主義的な社会的環境における発声行動の定量的分析は限られています。したがって、社会的相互作用中の動物特異的な発声追跡を可能にする手法は、自由に交流するマウスの発声を研究するために不可欠です。

本記事では、個々の動物を追跡し、USVを抽出し、自由に交流する社会セッション中に特定のマウスに声信号を割り当てるための体系的かつ検証済みの枠組みを提供するプロトコルを提示します。ビデオベースのトラッキングと発声抽出、位置特定、割り当てを組み合わせることで、行動データや音響データの正確な時間的整合性を可能にします。得られたデータセットは、発声タイミング、音響構造、動物特有の発声出力の定量的分析を支援しつつ、パイプラインの各段階での検証と品質管理を強調しています。

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

動物のケアに協力してくださったデラウェア大学生命科学研究施設のスタッフ、実験機器の建設支援をいただいたジム・ファーマー氏とジェイミー・クイゼンベリー氏、コンピューティングクラスターの維持管理に協力してくださったデラウェア大学ハイパフォーマンスコンピューティンググループに感謝いたします。データ収集のご協力をくださったアンドレ・イーチョン・マ氏に感謝いたします。この研究はNIHの助成金番号R01MH122752とT32GM142603によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alpha-Dri BeddingShepherd Specialty PapersALPHA-dri音源定位システムに必要
アルミニウム押し出し8020録音アリーナに合わせてカスタムビルド音源定位システムに必要
BNC-2110National Instruments777643-01音源定位システムに必要
透明アクリルパネルHome DepotMC-24音源定位システムに必要
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014音源定位システムに必要
コンピュータHewlett–PackardZ620音源定位システムに必要
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-C音源定位システムに必要
IRライトGANZIR-LT30音源定位システムに必要
NI PXIe-1073National Instruments781161-01音源定位システムに必要
NI PXIe-6356National Instruments781053-01音源定位システムに必要
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol 2523721音源定位システムに必要
ケージの壁用ナイロンメッシュMcMaster-Carr9318T25音源定位システムに必要
電源コードNational Instruments763000-01音源定位システムに必要
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02音源定位システムに必要
SonexフォームPinta AcousticVLW-35音源定位システムに必要

参考文献

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