人間および齧歯類の孤立膵島を画像ベースで自動定量化するウェブプラットフォーム

サマリー

このプロトコルは、深層学習支援画像解析と視覚品質管理を用いて、単離されたヒトおよび齧歯類膵島の標準化されたサンプリング、染色、画像取得、およびウェブベースの自動定量化を記述します。

要約

本出版物の目的は、画像中の孤立膵島を自動定量化するためのウェブベースのプラットフォームである IsletNetの標準化された使用のための書面およびライブ映像のステップバイステッププロトコルを提供することです。対象はサンプリングや画像取得から画像アップロード、視覚的検証、自動レポート生成に至るまでです。このプラットフォームは、臨床および実験的な膵島分離ワークフローを支援するため、単離膵島の二次元顕微鏡画像の標準化かつ自動化された評価のために開発されました。ディープラーニングに基づく画像セグメンテーションは、画像解析のために輪郭を抽出する島や外分泌組織を特定するために用いられます。計算アルゴリズムはその後、アイレット数、体積、純度を定量化します。ビジュアル品質管理ツールは、ユーザーが無効画像を受け入れ、手動で修正、または除外できるため、自動画像解析の専門家による検証をサポートします。Clinical Islet Isolationモジュールは純度分数バッチ分析をサポートし、自動PDFレポートと画像および表形式のデータファイルを作成し、記録管理や分析に用いられます。Simple Comparisonモジュールは、自動推定値と、対応するサンプル画像とともに提出された局所的に取得された参照結果を比較し、局所的に標準化された画像が自動解析に適しているかどうかを評価します。また、必要に応じてローカル生成の標準化画像を用いた再学習の推奨も示しています。齧歯類および人間のアイレット分離からの代表的なデータ、特に挑戦的な例は、適切な訓練後の自動解析性能の向上を示しています。

概要

糖尿病患者への膵島の単離移植は、外部インスリン投与の必要性を減らすか排除します^。死体や生体ドナーからのアイレット分離の過程は、収量や品質のばらつきに反映される生物学的および手続き的な異質性に左右されます。総膵島体積は、線量決定および移植適性に関する臨床的意思決定における主要な入力となります^。アイレットサイズヒストグラムとアイレット指数数は、サイズ関連の効果の違いを考慮しています^。3.したがって、現在ベータ細胞含有量の代理マーカーとして機能する総体積に加えて、個々のアイレットにも注目が払われています。孤立した人間の島は齧歯類小島よりも密度が低く、外分泌組織から十分に分離されていないことが多いです。そのため、染色されていないと見分けが難しいです。ジチゾンを用いた迅速かつ単純な亜鉛染色法が採用され、亜鉛強化インスリン顆粒から強い赤色光を反射させる^4.組織の不透明度を考慮すると、表面から反射した光のみを収集するため、光源とカメラを備えたシンプルな立体顕微鏡または逆立顕微鏡機器の使用が可能です。

デジタル^{画像解析ツール}5^{、6、7、8、9、10、11、12}を用いて実験室間変動を減らす多くの試みがなされてきましたが、これらの手法にはいくつかの限界があります。これらの方法では、アイレットや外分泌組織の分割は、主観的な誤差5,6,7,8,9,10を生じやすい手動閾値測定に依存するか、完全自動分割アプローチ^11,12を用いることのいずれかです。さらに、ローカルソフトウェアのインストールはしばしば5,6,7,8,9,10,11が必要で、特定のハードウェア^10,11に限定されることもあり、一般的なアクセス性や標準化が制限されます。

本論文の全体的な目的は、ウェブベースのディープラーニングプラットフォームを用いて画像中の孤立膵島の自動定量化のための標準化されたワークフローを提供することです。 IsletNet は、アイレット画像解析の利用可能性と信頼性の両方に関連する制限に対応しています。この記事では、アイレットグラフトのサンプリング、適切な顕微鏡画像の作成、 そしてIsletNet ツールの適切な使用に関する推奨ガイドラインを紹介します。このプロトコルは、自動生成結果の人間の監督という概念を導入し、見込みユーザーおよび既存のユーザー向けにワークフローを提示します(図1)。Simple Comparisonツールは、見込みユーザーが IsletNet の結果をローカルで取得された参照方法と直接比較できるようにします(図1A)。局所生成の標準化画像はセンター間で大きく異なるため、 IsletNet は信頼性の高い解析を得る前に再学習が必要になる場合があります(図1B)。このプロセスを円滑に進めるために、標準化された染色および画像取得に関する推奨が提供されています。既存のユーザー向けには、臨床膵島隔離ツールが人間の膵島分離ワークフローをサポートするよう設計されています(図1C)。ダウンロード可能なレポートと IsletNet によって生成された追加の表や可視化は表 1に記載され、主要な計算パラメータは 表2にまとめられています。

図1:プラットフォームの見込みユーザーおよび既存ユーザー向けのワークフロー。 (A) Simple Comparisonモジュールを用いたローカル検証ワークフロー。(B) 再学習には局所的に標準化された画像を表すセットが必要です。(C) 臨床アイレット隔離モジュールを用いたルーチン使用ワークフロー。画像アップロード、分析、視覚品質管理(vQC)、レポート生成のための主要なワークフローステップがまとめられています。スケールバーは適用できません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:プラットフォームが生成するダウンロード可能な結果ファイル。 Clinical Islet IsolationおよびSimple Comparisonツールによって生成されたダウンロード可能な出力ファイルの一覧で、ファイル形式および出力カテゴリごとにグループ化されています。この表には、レポートファイル、分割画像出力、可視化ファイル、アイレットカウント、体積、純度、ヒストグラム解析用のスプレッドシートエクスポートが含まれています。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:ダウンロード可能なレポートおよびスプレッドシート出力に含まれる主要パラメータ。 Clinical Islet IsolationおよびSimple Comparisonツールによって生成されたダウンロード可能なXLSXおよびCSVファイルに含まれるメタデータ、ユーザー定義の設定、定量分析パラメータの詳細なリスト。パラメータにはセッションメタデータ、画像取得設定、画像および個々のアイレットの定量指標が含まれます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

プロトコル

動物処置はチェコ共和国保健省(承認番号49/2023)により、欧州共同体理事会指令86/609/EECに基づき承認されました。ヒトアイレットの分離および使用手順は州薬物管理研究所によって承認されました(承認番号:sukls111286/2023)。ラットおよびヒトアイレットの標準化された顕微鏡画像をSimple ComparisonおよびClinical Islet Isolationツールを用いて解析し、自動解析と手動カウントを比較しました。標準(短い)換算表¹³ は、手動および自動のアイレット換算の両方に使用されました。

1. 人間の監督

1. 予備選挙結果の初期図(図2)
   1. アイレット数、体積、純度の自動生成数値と、対応する自動注釈(例:輪郭やセグメント)のグラフィカルな可視化がバッチ結果ウィンドウに表示されるのを待ちます。
   2. 左側の情報パネル(図2A)で現在のサンプル画像の要約結果をご覧ください。
   3. 右の表に複製値(図2B)とバッチ平均(図2C)を表示してください。
   4. 画像プレビュー(図2D、E)をリンク(図2F)からご覧いただけます。画像プレビューを右クリックし、必要に応じてポップアップメニューから1枚の画像をダウンロードしてください。
   5. ナビゲーション矢印(図2G)を使ってサンプル画像を閲覧するか、表から直接選択できます。
   6. 現在の画像プレビュー(図2D)をクリックして検査ウィンドウを開き、自動生成の輪郭線の品質を評価し結果を検証してください。
2. ビジュアル品質管理
   1. 画像の周りを動かし、(図3A)ズームインまたはズームアウトして輪郭の誤差がないか確認します。
   2. 等高線(カウントされた島のみが持つ)、元の画像、追加の可視化ビューを切り替えます。
      注:利用可能なビューはウィンドウ右側の凡例欄(図3B)に記載されており、キーボードショートカットや上部ナビゲーションバーのリンクからアクセスできます(図3C; 表3)。
   3. 輪郭が許容範囲であれば、下矢印キーを押して次の画像に進みます(表3参照)。
   4. 可能な限り輪郭の誤りを手動で修正してください。検出されなかった、部分的に検出された、または偽の島が残る場合は、その画像を無効と分類し、解析から除外します。
      注意:除外された画像はバッチ結果ウィンドウ(図2J)およびダウンロード済みすべてのファイルにマークされています。
3. 修正可能な誤り:分離されていない隣接小島
   1. 必要に応じて隣接する島を手動で分離してください。
   2. アイレットの外側を左クリックすると分離線が開始されます(図3D)。
   3. 隣接する島間の分離線を誘導するために中間左クリックを追加します(図3E)。
   4. アイレットの外側を右クリックすると分離線が完成します(図3F)。
   5. 分離線を提出して結果を更新します(図3G)。
      注意:必要に応じて、追加された分離線の可視化をオンまたはオフに切り替えてください(図3H)。
4. 修正可能な誤り:偽島
   1. 分離ツールを使って、偽の島を島のサイズの閾値より小さい複数の物体に分割します。
   2. あらかじめ定められた最小アイレットサイズの閾値(通常50μm)を設定して、小さなアイレット断片のカウントを避けてください。必要に応じて、地域の検査室の慣行に応じて閾値を調整してください。
   3. 線上の任意の点を右クリックし、ポップアップメニューから手動で追加された分離線を1本またはすべて削除する適切なオプションを選択します(図3I)。
5. 修正不可能な誤り:欠損、部分的に断片、または偽の島
   1. 分割ビューを切り替えて、島が検出されたかどうかを確認してください。
   2. バッチ平均計算から、検出されていない、部分的に検出された、または複数の偽アイレットを含む無効画像は除外します(図3J)。
6. 修正不可能なエラー:誤分類されたオブジェクト
   1. 外分泌組織、背景のアーティファクト、または気泡が誤ってアイレットとして分類されている場合は、画像を評価から除外してください(図3J)。

図2。バッチ結果ウィンドウ。 (A) 現在のサンプル結果の概要。(B) 再現サンプル画像の結果。(C) 受け入れられた画像のみのバッチ平均値。(D、 E、 F)リンク付きのグラフィック結果プレビュー。(G)ナビゲーションの矢印のサンプル。(H、 I、 J)画像を修正、受け入れ、除外しました。(K) IsletNet トップナビゲーションバー。(L、 M)バッチ結果ウィンドウのヘッダーとフッター。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。vQCおよび手動輪郭修正のための検査ウィンドウ。 (A) 画像ズーム表示。(B)伝説とナビゲーションのヒント。(C) 検査ウィンドウの上部ナビゲーションバー。(D–G)隣接する島の手動分離ラインの建設および提出。(H) 手動分離線の表示または隠し用トグル。(I) 手動分離ラインの除去。(J) 統計から画像を除外するためにトグル。このインターフェースビューではスケールバーは表示されません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表3:検査ウィンドウで利用可能な表示モード、キーボードショートカット、ナビゲーションコントロール。 vQC中に利用可能な画像可視化モード、キーボードショートカット、ナビゲーション機能の概要と、セグメンテーションの手動レビューが検査ウィンドウに表示されます。この表には、Clinical Islet IsolationおよびSimple Comparisonツールで使用される輪郭オーバーレイ、セグメンテーション表示、ヒストグラム可視化、画像ナビゲーションコントロールが含まれています。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

2. プラットフォームのナビゲーション

1. 視聴バージョンと技術情報
   1. 現在のソフトウェアバージョンと、上部ナビゲーションバー(図2K)に表示される最新のトレーニング日を確認してください。
   2. ホームセクションを開くと、技術的な説明と関連する参照情報にアクセスできます。
2. ローカル画像の予備評価
   1. ステップ1.2.4および1.5.2で説明された誤差基準に基づき、ローカル生成の標準化画像がプラットフォームによって正しく解析可能か、または局所標準化画像に対して再学習が必要かどうかを判断します(図1A および 1B)。

3. 局所画像を用いた単純な比較と外部学習

4. サンプリング

注意:島はサイズや形状によって急速にかつ異なる堆積物を形成するため、サンプリング結果に偏りが生じます。

注意:すべてのアイレット取り扱い手順は、適切な個人用防護具を着用したまま、層流フード内で行ってください。

1. アイレット懸濁液には50 mLまたは250 mLのチューブを使用してください。
2. 観測されたペレット体積と純度に基づいて、現地の標準作業手順を用いて必要なサンプリング割合を決定します。
3. サンプル採取直前にチューブを優しく5回逆さまにして、アイレットサスペンションを十分に混ぜます。
4. 外分泌組織による詰まりを防ぎ、アイレット損傷を最小限に抑えるため、大口径ピペットの先端ですぐにサンプルを採取してください。

5. アイレット画像取得の最適化

1. ディシゾン製
   注:島と外分泌組織の間に十分なコントラストを確保するためには、一貫したジチゾン染色が必要です。以下に、よく使われる2つの調製方法について説明します。
   注意:ジチゾンは生殖毒素の可能性がある。ジメチルスルホキシド(DMSO)は有毒で皮膚浸透性があります。水酸化ナトリウムは非常に腐食性が高く、重度の化学火傷を引き起こすことがあります。すべての化学物質は適切な個人用保護具を着用し、皮膚接触を避け、廃棄物は機関の有害廃棄物手順に従って処分してください。
   1. DMSO¹³での再停止
      1. ジチゾンパウダー50mgの重さです。
      2. ジチゾンを5mLのDMSOに溶かします。
      3. 溶液を37°Cでキュベーキュベートし、溶解が完了するまで5分ごとに1分間激しく渦巻く。
      4. ストック溶液1mLを2%胎児用牛血清を含むハンクスバランス塩溶液20mLで希釈して作動溶液を準備します。
      5. 溶液を0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。
      6. チューブをアルミホイルで包んで、溶液を光から守ります。
         注意:作業中の溶液は約12時間以内に使用してください。
   2. アルカリアルコール溶液中の再懸濁(参考文献8の代替)
      1. ジチゾンパウダー50mgの重さです。
         注意:希望があれば事前にアリクォートを用意してください。
      2. ジチゾンに70%エタノール800μLを加えます。
      3. 1 Mの水酸化ナトリウム溶液を400 μL加え、完全に溶解するまで徹底的に渦を巻きます。
      4. 溶液をリン酸緩衝塩水で希釈し、0.2 mg/mLのヒトアルブミンを含む最終体積20 mLにします。
      5. 溶液を0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。
      6. チューブをアルミホイルで包んで、溶液を光から守ります。
         注意:作業中の溶液は約12時間以内に使用してください。
2. アイレット染色
   1. 35mm皿の中央に25μLのジチゾン作業液を加えます。
   2. アルブミンを含むハンクのバランスソルト溶液、完全培養培地、または移植培地に懸濁したアイスレット50μLを加えます。
      注:実際のサンプル体積は純度分率ペレットによって20〜50μLの範囲で、最終ジチゾン濃度は0.85 mg/mLから1.37 mg/mLです。
   3. 最初のストップでゆっくりと溶液を混ぜながら、浮液を3回ピペットで出し入れし、泡ができないようにします。
   4. サンプルを20°C〜25°Cで1〜2分間培養し、顕微鏡で着色を観察しながら、アイレットが鮮やかな赤色に見えるまで観察します。一部の調製には染色が不十分な島が含まれることがあり、 IsletNet も同様の訓練を受けています。
   5. 10 mLのシリンジで、0.2 mg/mLアルブミンを補足した4 mLのリン酸塩塩水を素早く染色したサンプルに注入し、気泡や飛び散りを避けます。
   6. すぐに皿を力強く円を描くように回し、溶液を混ぜ、アイレットを中心に動かしてから落ち着きます。
      オプション1:周囲に4mLのPBS/アルブミンを慎重に加え、ジチゾンのアイレットはそのままにします。次に、皿を円を描くように優しく回して溶液を混ぜ、アイレットを中心に保ちます。ディチゾンが皿内に散布するのを待って。
      オプション2(立体顕微鏡用):アイレットを希釈する代わりに、希釈の代わりにピペットの先端や針を使ってジチゾン・アイレット滴を薄い層に広げて反射を減らします。
   7. 顕微鏡で試料を検査し、置き換わったアイレットをピペットの先端で周囲の溶液を優しく回してカメラフィールドに戻します。
   8. 細胞毒性や膵島体積の変化を最小限に抑えるために、直ちに画像取得を開始してください。
3. 画像取得
   注意:低倍率対物レンズと安定した光源を備えたステレオ顕微鏡または逆立顕微鏡を使用してください。部屋の照明など追加の光源からアンテナを遮断しましょう。
   1. 光源をつけて、ハロゲンバルブを5分間温めてください。
   2. まぶしさや露出不足を避けるために、標準化された光強度を設定しましょう。正確な射程は使用されるイメージング機器によって異なります。
      注意:最適な光強度は倍率やサンプルの純度によって異なる場合があります。
   3. すべてのアイレットがカメラの視野内に留まるように、対物レンズとズーム設定を選択してください。
   4. バッチ内のすべての試料で同じ倍率を維持し、できればすべての純度バッチで同じ倍率を維持してください。
   5. 必要に応じて、ノーマライズしたホワイトスライドを使ってホワイトバランスをキャリブレーションしてください。アイレット準備の特有の特性のために画質が満足できない場合は、RGB値やガンマ線設定を調整してください。
   6. 露出時間を調整し、必要に応じてカラーヒストグラムを使って照明強度やゲインを調整し、オーバー露光を防ぎます。
      注:豊富な外分泌組織を含むサンプルは、非島組織からの反射光のため、異なるカメラや照明設定が必要になることがあります。再現性を確保するために、これらのパラメータは将来の参照のために別の設定ファイルとして保存してください。
   7. 画像をキャプチャし、JPG、PNG、TIFF、BMPなどの対応フォーマットで保存してください。
      注意:将来の再解析(例:iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg)を容易にするために、ファイル名に日付、純度比率、倍率またはピクセルサイズ、希釈数を含めてください。
   8. 試料イメージングに使われる同じ倍率とズーム設定でステージマイクロメーターの画像を取得します。

6. 臨床アイレット隔離ツール

注:主要なワークフローステップは 図1Cにまとめられています。サンプルが利用可能になり次第、純度分数バッチで画像を解析します。

結果

純粋なラット島

最初の実験では、4回の独立した撮影セッションで、合計249個の精製ラット島を含む12サンプルを表す36枚の画像を取得しました。画像は、ハロゲンと発光ダイオード(LED)光源を組み合わせた3つの標準化された照明条件下で、立体顕微鏡を用いて画像を作成し、異なるカメラ設定を組み合わせました。 IsletNet のトレーニング専門家によって、3枚の代表画像に対してグラウンドトゥルース(GT)セグメンテーションが手動で生成されました。

公開されているSimple Comparisonツールで画像を解析したところ、自動生成された輪郭はいずれも視覚的品質管理を通過しませんでした(vQC、図5F)。その後、プラットフォームは代表的な局所画像を用いて再学習され、再学習された実験バージョンで生成されたすべての輪郭線はvQCを通過しました(図5C)。

再訓練後の3つの画像条件で自動アイレット体積推定の比率は一貫しており、照明条件A、B、Cの中央値はそれぞれ1.03、0.98、0.94でした(図5A)。これらの結果は、元のトレーニングモデルと比較して大幅な改善を示しました(図5B)。

ピクセル単位でGTセグメンテーションと比較した結果、再学習後の自動生成と手動生成の輪郭が密接に一致していることが示されました(図5D)、代表的な画像における正確な輪郭配置に対応しています(図5C)。対照的に、元のトレーニングモデルでは偽陰性ピクセルの割合(図5G)と輪郭の誤配置(図5F)が増加し、対応する島のサイズヒストグラムではより小さな島カテゴリにシフトしました(図5E 5H)。

図5。3つのイメージングセットアップとラットアイレット準備を用いたプラットフォーム再訓練の評価。 (A) 3つの画像設定を用いた再訓練後の IsletNet と手動アイレット相当量(IEQ)推定値の比較。(B) IsletNet と手作業によるIEQ推定値の比較(元の公開トレーニングモデル)。(C、F)モデルの再学習後と再学習前のvQCツールを用いた代表的な輪郭配置。白い矢じりは正しい輪郭位置を示し、マゼンタの矢じりは正しい輪郭配置を示します。(D、G)再学習後のグラウンドトゥルースと元のトレーニングモデルとのピクセル単位比較。真陽性、偽陽性、偽陰性、真陰性領域は凡例で示されています。(E、H)再訓練後の代表的な島のサイズヒストグラムと、それぞれ元の訓練モデルでのものを、手動カウントと比較して示す。イメージングセットアップ1=LED照明;イメージングセットアップ2=ハロゲン照明;イメージングセットアップ3=LEDダークフィールド照明。スケールバー=100μm。ボックスプロットはTukeyの慣例に従って表示されます。ウィスカーは第1および第3四分位数から1.5 ×の四分位範囲内のデータ点まで広がっています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

臨床ヒトアイレット製剤

2回目の実験では、3組の純度・分数ペアを用いた単一のヒトアイレット分離手順を表す17枚の画像が、公開されているプラットフォーム版を用いて解析されました。1つのサンプルが失われた。vQC後、中純度および低純度の画分を示す画像はすべて、偽のアイレット検出(データ未表示)により除外されました。その後、プラットフォームは代表的なローカル画像を用いて再学習されました。

再訓練後、3本の手動分離ラインを追加した後、すべての画像はvQCを通過しました。バッチ別と手動計数の比較では、アイレット総数および体積推定において全体的に≤5%の過小評価が示されました。2,000倍から4,000倍の希釈されたサンプルには、純度比に応じて80から4のアイレットが含まれていました。個々の純度分数の最終調製に対する相対的な寄与は 図6Aに示されています。高純度分率1VC2は、中純度分率2SC1に比べて主に小さなアイレットを寄与しました。プラットフォームによって自動的に生成される全体のアイレットサイズヒストグラムは 図6Bに示されています。

図6。ヒトアイレット分離サンプルの定量化と解析。 (A) IsletNet および手作業による純度分数によるアイレットカウントおよびアイレット等価体積推定。(B) バッチ平均値を用いて IsletNet によって生成された最終アイレットサイズのヒストグラム。(C) IsletNet の比較と、17枚の個別画像におけるカウントと体積の手動推定。(D) サンプル3NC1からの代表的な画像の詳細で、再学習済みの IsletNetによって生成された元の画像と輪郭配置を示す。(E) IsletNet のセグメンテーションと、手動カウントするエキスパートと IsletNetトレーニングエキスパート(GT1対GT2)によって生成されたグラウンドトゥルースとのピクセル単位比較。真陽性、偽陽性、偽陰性、真陰性領域は凡例で示されています。(F) IsletNet と手動結果を比較した同一画像の代表的なアイレットサイズヒストグラム。マゼンタ色の矢じりは等高線と島のサイズのカテゴリーシフトを示しています。スケールバー=100μm。ボックスプロットはTukeyの慣例に従って表示されます。ウィスカーは第1および第3四分位数から1.5 ×の四分位範囲内のデータ点まで広がっています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

その後、すべての個別画像に対して自動および手動推定を比較しました(図6C)。自動推定と手動推定の中央値比は、島数が1.00、島体積が0.93で、いくつかの外れ値が観察されました。代表的な低純度サンプル(3NC1)では、プラットフォームは手動計数と同じ数のアイレット(5個)を特定しましたが、アイレット体積は29%少なかったと推定されました。これらのデータポイントは 図6Cの矢印で示されています。

この代表的な画像から、外分泌組織に部分的に閉じ込められた最大の島は図 6Dに示されており、元の画像と自動生成の輪郭オーバーレイも含まれています。ピクセル単位の比較は、2人の専門家が独立に生成したGTセグメンテーションとの比較図 6Eに示されています。対応するアイレットサイズのヒストグラムは、手動と自動分割の間でサイズ分布の変化を示しました(図6F)。

自動分析の運用パフォーマンス

Simple ComparisonおよびClinical Islet Isolationツールの運用性能は、平均ダウンロード速度50 Mbpsおよびアップロード速度30 Mbpsの標準インターネット条件下で評価されました。5つの画像バッチに分けて、それぞれ12枚の画像を用いて、0.5MBのJPEGファイルから20MBのTIFFファイルまでの画像サイズを用いて分析しました。完全なZIP結果パッケージのダウンロード期間が測定されました。

分析の可視化時間とダウンロード時間は、両ツールの画像サイズに比べて徐々に増加しました(表4)。臨床アイレット分離ツールは、同等の画像セットに対してシンプル比較ツールよりも処理時間が長くなりました。これらの結果は、画像解像度、ファイル形式、解析スループットがルーチン操作中にどのように関連しているかを示しています。

表4:臨床膵島分離および単純比較ツールの解析可視化時間とダウンロード時間。 異なるファイルサイズとフォーマットの画像バッチを用いた結果の可視化とファイルダウンロードに必要な処理時間の比較。測定値は12枚の画像を含むバッチを用いて取得され、バッチ提出から結果の可視化またはダウンロード完了までの経過時間として報告されます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで示すプロトコルは、 IsletNetの将来のユーザーおよび既存のユーザー向けの実用的なワークフローを説明しており、プラットフォームの2つの重要な特徴であるエキスパートvQCとニューラルネットワーク再学習に重点を置いています。代表的な結果は、正確な自動定量化が画像セグメンテーションの性能だけでなく、ユーザーが結果を受け入れる前に輪郭配置や画像適合性を批判的に評価する能力にも依存していることを示しています。さらに、ピクセル間比較(Pixel-to-Pixel Comparison)とマイセグネーション(My Segmentations)という2つの高度なツールが選ばれた検証結果を生成するために使用されました。しかし、これらのツールは主にニューラルネットワークのトレーニングサポートを目的としており、プロトコルのワークフローには含まれていません。

IsletNetは、ラボ間で標準化されたアイレット画像解析のための協働的かつ広くアクセス可能な参照ツールとして開発されました。ニューラルネットワークは、分離されたヒトおよびラットの島^14、15、16の元の二次元顕微鏡画像の手動注釈付きGT分割を用いて訓練・検証されました。ジチゾン染色された製剤の別個モデルと、染色されていないラットアイレットの追加研究モデルが作成され、要望に応じてアクセス可能となりました。プラットフォームのバージョンとトレーニング日程はユーザーインターフェースに表示されます。IsletNetはアイレットと外分泌組織を自動的にセグメント化し、ユーザー定義のピクセルサイズと最小アイレットサイズの閾値を用いてアイレットの数、体積、純度を計算します。島のサイズの閾値の選択は、種ではなく画像の質や分析目的(手動カウントと小島の研究の並べ比較)に依存します。従来の顕微鏡の解像度を考慮すると、意味のある最小アイレットサイズは50μm(7,8,9,12)ですが、適切な機器¹⁰で得られる画像では最大10μmまで縮小可能です。アイレット体積推定は、標準的な球面変換表¹³および代替変換表7^、18、19(フィッティング楕円近似^5,6、等高線ベースのSpinacle and Sphiracleモデル¹⁷)を用いて生成されます。得られた値はアイレット当量およびナノリットで報告され、純度は組織面積または推定組織体積のいずれかから計算されます。プロトコルの重要なステップは、自動セグメンテーションに適した標準化された顕微鏡画像の取得です。IsletNetは、ステレオ顕微鏡や逆立顕微鏡で取得した画像を用いて訓練され、複数の相補金属酸化物半導体カメラや照明システムを装備しました。低倍率対物レンズ(1–2×)は、サンプル全体を視野内に保ちつつ、小さな島の検出に適合するピクセルサイズを維持できるため有利です。安定した照明、安定したホワイトバランス、そして画像のオーバー露出回避は、信頼性の高い輪郭生成に不可欠です。代表的な結果は、代表的な局所画像を用いた再学習が、異種な画像条件間でセグメンテーション性能を大幅に向上させることを示しています。実用的な指針として、Isletと外分泌組織の境界が経験豊富な観察者に明確に識別できる場合、画像は一般的にIsletNetの訓練に適しています。クラスターや重なり合う島を含む画像は可能な限り避けるべきです。

また、このプロトコルは自動画像解析に関連するいくつかの制限やトラブルシューティングの考慮点も強調しています。 IsletNet は完全手動カウントに比べてスループット、客観性、再現性を大幅に向上させますが、画像品質に敏感なままです。誤った輪郭配置(偽アイレット検出や隣接アイレットの分離遅延)は時折発生し、下流の定量に影響を及ぼすことがあります。自動結果を受け入れる前に、定期的なvQCは必須です。 IsletNet への即時現地適用は、不適切な画像を画像パラメータの調整で再取得できるため有利です。自動輪郭の手動補正は、検査ウィンドウ内で可能ですが、欠落アイレットや複数の偽アイレットがある場合は例外です。さらに、自動分離アルゴリズムは等高線形状やアイレットサイズ分布統計に基づいているため、個々の専門家の初期解釈とは異なる場合がありますが、解析的には許容範囲を保っています。

IsletNetの信頼性は主に種だけでなく、局所画像品質と訓練データセットの整合性によって決まります。現在の訓練セットには純度の異なるヒト島や高純度のラット島が含まれていますが、画像特性が訓練データと一貫していれば、プラットフォームは他の種にも拡張される可能性があります。例えば、培養によって精製された豚の島は、訓練データセットに埋め込まれた人間の島に似ていることがあります。一方、弱いジチゾン染色を持つ広範囲に培養されたアイレットは訓練中に示されず、追加の訓練が必要となる場合があります。したがって、Simple Comparisonツールは新規ユーザーや新しいイメージング構成に対する重要な検証ステップをサポートします。ここで示した結果は、埋め込みアイレットの専門家の解釈の違いがGT生成や下流体積推定にどのように影響するかを強調しています。将来の多中心研究で広範な専門家の合意が欠如していることに対処するため、合意に基づく画像注釈を促進するためにIsletSwipeアプリケーション²⁰が開発されました。

従来の手動顕微鏡下でのカウントと比べて、 IsletNet は大幅に高いスループット、恒久的なデジタル記録、標準化された定量的出力を提供しつつ、オペレーターによる変動性を低減します。手作業によるカウントは、境界性のケースでも組織同定の信頼性を高める可能性がありますが、主観的なサイズ推定、低スケーラビリティ、広範な人員訓練要件に制約があります。ウェブベースのサービスとして、 IsletNet は集中的かつ匿名性のある分析によって、研究室間の比較を可能にします。解析速度はローカルインターネット帯域幅、画像ファイルサイズ、画像の複雑さに依存します。大きなTIFFファイルは画質を向上させる可能性がありますが、圧縮されたJPEG画像と比べてアップロードとダウンロードに時間がかかります。

総じて、ここで示された結果は、局所画像取得が再現可能で訓練セットと整合的であれば、信頼性の高い自動定量化が達成できることを示しています。ユーザーは、局所的な画像診断条件に大きな変化が生じた場合には再トレーニングを検討するよう、日常にvQCを取り入れることが推奨されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	無菌でない
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	染色前のアイレット懸濁液の分配用
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GCグレードまたは細胞培養グレード
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	粉末
Ethanol, 70%	地元のサプライヤー	N/A	(v/v) in H2O; DTZ調製用
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	熱処理済み、適格
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	フェノールレッドの有無（アッセイに基づいて指定）
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	高濃度溶液（200 g/L）
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS、3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	標準画像取得ソフトウェア
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	1.25xおよび2xのレンズ
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED光源; デュアルグースネックガイド
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	ハロゲン光源（14.5 V、90 W）; 手動強度制御; デュアルグースネックガイド
Laboratory essentials	Various	N/A	ピペット、チューブ、針、注射器、実験室用タイマー、標準的なPPE
MicroCam software	Bresser	N/A	標準画像取得ソフトウェア
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS、3.1 MPカメラ
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	0.22 µmの孔径、PES膜
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS、5 MP、高ダイナミックレンジカメラ
QuickPHOTO	Promicra	N/A	標準画像取得ソフトウェア
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	地元のサプライヤー	N/A	DTZ調製中のpH調整と溶解用
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mmの長さ; 校正用の50 µmの区分け
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	1xアポクロマートレンズ