ラット肝および骨格筋におけるグリコーゲン定量のためのアントロン比色法

サマリー

本プロトコルは、ラットの肝臓および骨格筋におけるグリコーゲンを異なる代謝状態で定量するアントロン比色法を記述しています。

要約

グリコーゲンは肝筋と骨格筋における主要な細胞内グルコース予備であり、炭水化物代謝において基本的な役割を果たします。肝グリコーゲンは全身性のグリセミック恒常性維持に不可欠であり、一方で骨格筋グリコーゲンは身体活動や運動パフォーマンスを支えます。したがって、グリコーゲン代謝が動的に調節されたり病理的に変化したりする研究において、組織グリコーゲンの正確な定量化は極めて重要です。ここでは、ラット肝筋および骨格筋におけるグリコーゲン含有量を定量するための信頼性が高く感度の高いアントロン比色法を説明します。プロトコルは、アルカリ性消化、脱タンパク質化、グリコーゲン沈殿、アルコール洗浄、アントロン試薬を用いた色現像などの連続したステップで構成されています。この方法の適用性は、3つの生理学的に関連した状態、すなわち 自由 給餌、夜間断食、短期再給餌のラットで示されています。これらの実験パラダイムは、グリコーゲンの貯蔵、枯渇、再合成に関連する重要な代謝状態を捉えています。主要酵素であるグリコーゲン合成酵素およびグリコーゲンホスホリラーゼの直交ウェスタンブロット解析は、観察された代謝変化のメカニズム的支持を提供します。この手法の適用可能性は、急性ストレス誘発性グリコーゲン分解をモデル化するためにエピネフリン処理された動物でも示されています。この手法は、広いダイナミックレンジと十分な感度を提供し、著しく異なる生理状態間で組織グリコーゲンを定量化します。これは、生体内でのグリコーゲン代謝を調査するための信頼性の高いツールを提供し、in vitro細胞培養モデルにも応用可能です。

概要

グリコーゲンは非常に分岐した多糖類で、哺乳類の骨格筋や肝臓、そして脳、腎臓、心臓、^{脂肪組織など}他の臓器にもやや関与しています。摂食中、余剰グルコースは重合またはデノボ脂肪生成を経てグリコーゲンまたは脂質として蓄えられます。しかし、断食中や身体的運動中にはグリコーゲンが酵素分解され、エネルギー需要を満たすために一定かつ迅速なグルコース供給が保証されます。このグリコーゲンの緩衝能力は、生理的な速食再給餌サイクル中の血糖恒常性を維持するために^{不可欠です。}

グリコーゲン合成は、哺乳類の2種類のアイソフォームであるGYS1とGYS2に存在するグリコーゲンシンターゼ(GYS)によって触媒されます。GYS1は主に骨格筋で発現し、GYS2は肝臓のアイソフォームです。GYSの触媒活性は、断食条件下でSer641を含む複数の部位でのリン酸化によって抑制されますが、摂食条件下での脱リン酸化によって活性が刺激されます。グリコーゲン分解はグリコーゲンホスホリラーゼによって触媒されます。肝臓のアイソフォームはPYGL、筋肉のアイソフォームはPYGMです。GYSとは異なり、断食中のSer15でのリン酸化時に触媒活性が刺激され、摂食後の脱リン酸化で抑制^{されます。}

グリコーゲン代謝の適切な調節は多くの生物学的プロセスの基本であり、グリコーゲン代謝の調節不全は多くの疾患の原因要因として特定されています。具体的には、肝グリコーゲン代謝の異常は、グリコーゲン貯留疾患^4、2型糖尿病^5、代謝機能障害関連の脂肪性^肝疾患6,7、低血糖に対する逆調節反応の障害など、さまざまな代謝障害と関連^{しています。}さらに、脳グリコーゲンは長期記憶形成に不可欠^{であり、骨}格筋グリコーゲンは持久力の重要な調節因子^です。したがって、グリコーゲン代謝が動的に調節または病理的に変化する研究において、組織グリコーゲンの正確な定量化は極めて重要であり、疾患メカニズムの調査やグリコーゲン調節介入の評価を可能にします。

アンソロン法^11,12、アミログルコシダーゼ法¹³、フェノール硫酸法¹⁴、非侵襲型核磁気共鳴分光法(MRS)法¹⁵など、いくつかのグリコーゲン定量法が報告されており、それぞれに利点と制限があります。ここでは、ラット肝および骨格筋におけるグリコーゲンを定量するためのアントロン比色法の詳細なプロトコルを説明します(図1)。このプロトコルには、アルカリ性消化、脱タンパク質化、グリコーゲン沈殿、アルコール洗浄、アントロン試薬を用いた色現像の連続的な工程が含まれます。この方法はシンプルで経済的、そして最小限の専門的な計測機器で済みます。感度と再現性を示すために、検出限界(LOD)、定量限界(LOQ)、およびアッセイ内およびアッセイ間変動係数(CV%)を一連のグリコーゲン標準を用いて計算しました。その適用可能性を示すため、肝および骨格筋のグリコーゲンレベルを、任意の給餌、16時間の夜間断食、短期再給餌の3つの生理学的に関連した条件下で評価しました。さらに、この方法はエピネフリン処理動物を用いて急性ストレス誘発性グリコーゲン分解をモデル化することが実証されました。グリコーゲン代謝に関与する主要酵素の直交ウエスタンブロット解析を行って、観察された代謝変化を裏付けました。

図1:グリコーゲン定量ワークフローの概要。 肝および骨格筋におけるグリコーゲン定量の実験ワークフローの概説的表現。この手法には、組織採取、アルカリ性消化、タンパク質沈殿、グリコーゲン単離、アントロンベースの比色検出が含まれます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

すべての動物プロトコルは南京医科大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC; #1905019)によって承認されました。

1. 試薬の調製

1. 本研究で使用されるすべての試薬については 、材料表 をご参照ください。
2. 実験開始前にすべての溶液を準備してください。
3. 必要に応じて溶液の体積を調整します。
4. 1 M 水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を準備します
   1. 重さは40gのNaOHペレットです。
   2. NaOHペレットを800mLの蒸留水に加えます。
   3. ガラス棒で溶液を攪拌し、容器の底部に未溶解粒子が残らなくなるまで続けます。
   4. 溶液を1リットルのボリュームフラスコに移します。
   5. 蒸留水で正確に1リットルまで容量を上げます。
   6. 溶液は室温(RT;18°C–23°C)で密閉された瓶に保存します。
      注意:NaOHは腐食性があります。安全ゴーグル、手袋、白衣を着用してください。市販のNaOHペレットは100%純度がなく、水分を吸収します。ペレットを長時間空気にさらすことは避けてください。
5. 20%塩化リチウム(LiCl)のストック溶液を準備します
   1. 無水LiCl粉末20gの重さ。
   2. LiClパウダーを80mLの蒸留水に加えます。
   3. 溶液を混ぜて容器の底部に未溶解粒子が残らなくなるまで続けます。
   4. 溶液を100mLの容積フラスコに移します。
   5. 蒸留水で正確に100mLまで詰めます。
   6. 溶液はRTで密閉したボトルに保存してください。
      注意:LiClは皮膚、目、呼吸器を刺激することがあります。安全ゴーグル、手袋、白衣を着用してください。LiClは非常に吸湿性が高いです。水分の吸収を防ぐために空気への曝露を最小限に抑えましょう。
6. アントロン反応溶液を準備する
   1. 1リットルのビーカーに28mLの蒸留水を入れます。
   2. 水に72mLの高純度(98%)硫酸(H₂SO₄)を加えます。
   3. 混合物を冷やしてRTに移します。
   4. 溶液に50mgのアントロンを加えます。
   5. アントロンが溶けるまでかき混ぜます。
   6. 溶液に3gのチオウレアを加えます。
   7. チオウレアが溶けるまでかき混ぜます。
   8. 溶液を琥珀色またはホイルで包んだガラス瓶に移します。
   9. 溶液は冷蔵庫(2°C〜8°C)で最大1週間保存します。
      注意:硫酸は非常に腐食性が高く、重度の化学火傷を引き起こし、水と激しく反応します。白衣、耐化学手袋、フェイスシールドを着用してください。すべての工程は認定された化学換気フードで行ってください。希釈は強い熱を生み出します。必ず水に酸を加えてください。
7. 95%エタノールに0.1%LiClを含んで準備します
   1. ガラス瓶に絶対エタノール95mLを加えます。
   2. 蒸留水4.5mLを加えます。
   3. 20%LiClのストック溶液を0.5mL加えます。
   4. よく混ぜてください。
8. 0.1%LiClを含む80%メタノールを準備します
   1. ガラス瓶に絶対メタノール80mLを加えます。
   2. 蒸留水19.5mLを加えます。
   3. 20%LiClのストック溶液を0.5mL加えます。
   4. よく混ぜてください。
9. 100%(w/v)トリクロロ酢酸(TCA)溶液を準備します
   1. 100gのTCAパウダーの重さです。
   2. TCAパウダーを80mLの蒸留水に加えます。
   3. 溶けるまでかき混ぜます。
   4. 溶液を100mLの容積フラスコに移します。
   5. 蒸留水で正確に100mLまで詰めます。
   6. 溶液はRTで密閉したガラス瓶に入れて保存してください。
10. 飽和安息香酸溶液を準備します
    1. 250 mLのガラスビーカーに100 mLの蒸留水に0.5gの安息香酸結晶を加えます。
    2. 混合物をホットプレートで90°Cまで加熱し、連続的に磁気攪拌を行います。
    3. 容器の底部に未溶解粒子が残らないまで加熱を続けます。
    4. 溶液をRTに冷却させます。
    5. 目に見える粒子のない透明な上澄液を吸引します。
    6. 溶液はRTで密閉されたガラス瓶に保存してください。
11. グルコース基準を準備する
    1. 50 mgのグルコース粉末を50 mLの飽和安息香酸溶液に溶かし、1 mg/mLのストック溶液を準備します。
    2. 以下のように飽和ベンゾオ酸を連続希釈して1.5 mLマイクロ遠心分離機管内にグルコース標準物質(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL)を合成します。
       1. チューブ1に1 mg/mLのストック溶液500 μLを加えて1 mg/mL標準液を準備します。
       2. チューブ2に250μLのストック溶液と250μLの飽和安息香酸を加え、0.5 mg/mL標準液を準備します。
       3. チューブ3にチューブ2溶液200 μLと飽和安息香酸300 μLを加え、0.2 mg/mL標準を準備します。
       4. チューブ4にチューブ3溶液250 μLと飽和安息香酸250 μLを加え、0.1 mg/mL標準を準備します。
       5. チューブ5にチューブ4溶液250 μLと飽和安息香酸250 μLを加え、0.05 mg/mLの標準を準備します。
       6. チューブ6にチューブ5溶液200 μLと飽和ベンゾ酸300 μLを加え、0.02 mg/mLの標準を準備します。
       7. チューブ7にチューブ6溶液250 μLと飽和ベンゾ酸250 μLを加え、0.01 mg/mLの標準を準備します。
       8. 500μLの飽和安息香酸を別のチューブに加え、ブランク(0 mg/mL)を準備します。
    3. 各チューブとボルテックスにキャップを短くして10秒間、しっかり混ぜます。

2. 動物治療

1. 一般畜産
   1. オスのスプラグ–ドーリーラット(230〜270g)を、特定の病原体のない状態(VAF/Plus健康状態、チャールズリバー研究所)の動物施設で飼育し、仙台ウイルス、マイコプラズマ・プルモニス、ラットパルボウイルスなどの一般的な齧歯類病原体が検出されていない状態です。
   2. 標準的なチャウダイエットを提供し、水を自由に利用できるようにしましょう。
   3. 動物は12時間の明暗サイクル(08:00に照明、20:00に消灯)に保ちます。
   4. RT温度は22°C〜23°Cに維持してください。
   5. 相対湿度は30%〜70%に保ちます。
2. 一晩断食
   1. ネズミは通常のケージに移します。
   2. 食べ物を取り除き、水を無料で提供しましょう。
   3. 翌朝16時30分から8時30分まで16時間断食を続けてください。
3. 再給餌
   1. 夜間絶食ラットには定期的に200gのチャウフードを与えてください。
   2. 動物は2時間自由 に 餌を与えられます。
4. エピネフリンチャレンジ
   1. 塩酸エピネフリン溶液を準備します。
      1. 校正済みの分析天秤を使って5mgのエピネフリン塩酸塩粉末を計量します。
      2. 粉末を15 mLの遠心分離機チューブに移し、10 mLの生理食塩水を加えます。
      3. チューブにキャップをして10回逆さんで0.5 mg/mLのストック溶液を準備します。
   2. 空腹時でないラットにエピネフリン塩酸塩溶液を1 mL/kg体重(0.5 mg/kg^体重)で腹腔内に注射します3。
      1. 腹部内容物が頭蓋骨に移動するのを待つために、頭を下げた姿勢で保持してください。
      2. 腹部右下の象限に25ゲージの針を45度の角度で刺します。
      3. 注射前に血液や腸内内容物がないか確認するために吸引してください。
   3. 対照動物に腹膜内で1 mL/kgの生理食塩水を注射します。
   4. 尾の静脈の血液サンプルを採取してください。
      1. ネズミを押さえて尾を露出させてください。
      2. 血流を促進するために、尾を10秒間圧迫・温めてください。
      3. 無菌の25ゲージ針で、先端から3cm離れた側尾静脈を刺します。
      4. 最初の一滴の血は、組織液の汚染を防ぐために清潔なガーゼで捨ててください。
      5. 血糖値を測定するために2滴目の血液を採取してください。
   5. 血糖値を15分ごとに60分間測定してください。
      1. メーカーの指示に従って血糖計を校正してください。
      2. 血糖計の精度を毎月コントロールソリューションで検証してください。
      3. テストストリップは湿気の露出を防ぐために元の容器に保管してください。
      4. 容器から取り出した直後にテストストリップを使用してください。
      5. テストストリップをグルコメーターに挿入すると、メーターが自動的に作動します。
      6. 毛細血管作用で血液サンプルがストリップ内に入ります。
      7. 表示された血糖値を記録してください。

3. 組織収穫

1. 安楽死と準備
   1. イソフルラン過剰投与による動物の安楽死。動物を誘導チャンバーに入れ、5%イソフルランを100%酸素で2L/分投与し、少なくとも3分間曝露します。
   2. 呼吸停止を確認して死亡を確認しましょう。
   3. 角膜反射とつま先のつまみ反射の喪失を確認してください。
      1. 滅菌された綿先端のアプリケーターで角膜に優しく触れ、まばたき反応がないか確認してください。
      2. 後ろ足のつま先の間のウェブを鈍い鉗子でしっかりと押さえ、運動反応がないことを確認します。
   4. ラットの腹面を上にして解剖トレイに置きます。
   5. スプレーボトルで腹部の皮膚を75%エタノールで濡らします。
      注意:死後虚血によるグリコーゲン分解を減らすため、安楽死と組織保存の間隔を最小限にしてください。
2. 肝臓解離
   1. 剣突起から約1cmの後方に小さな切開を入れます。
   2. 切開を胸骨の方へ伸ばしてください。
   3. 皮膚を下の筋肉から切り離してください。
   4. 両側横開腹術を行い、剣突の後方約1cmに横切開を行い、左右の肋下縁に向かって外側に伸ばして腹腔を完全に露出させます。
   5. 肝臓を特定しろ。
   6. 右正中葉を切除します(図2A)。
   7. 組織の重さを1分以内に測ってください。
   8. 組織をポリプロピレン製のプラスチック容器に入れます。
   9. 組織をドライアイスでスナップ冷凍します。
3. 骨格筋剥離
   1. 腓腹筋を代表標本として用い^{てください。なぜ}なら、後肢の代謝および収縮特性を反映した速筋線維と遅筋線維が混在しているからです。
   2. ネズミをうつ伏せにします。
   3. 後肢の後方側に、膝窩から踵骨結節まで縦方向の皮膚切開を行います。
   4. 皮膚を剥がせ。
   5. 大腿二頭筋と半腱筋を特定し、反射してください。
      1. 大腿二頭筋は、後腿の上半分を覆う大きく横方向に配置された筋肉と特定します。
      2. セミテンディノスは、太ももの後方に沿って内側を走り、膝付近に付着する細いストラップ状の筋肉と特定します。
   6. 腓腹筋を露出させてください。
   7. 細かい外科用ハサミで、踵骨の遠位付着部のアキレス腱を切断します。
   8. ヒレイ筋を分離してください。
   9. 大腿骨の内側および外側上顆に付着する腓腹筋の近位付着を解放します。
   10. 腓腹筋全体を切除します(図2B)。
   11. 組織の重さを1分以内に測ってください。
   12. 組織をポリプロピレン製のプラスチック容器に入れます。
   13. 組織をドライアイスでスナップ冷凍します。

図2:肝筋および骨格筋の組織剥離手技。 (A) 腹腔露出と肝組織採取のための順次ステップ(皮膚切開、切開延長、皮膚と下部筋肉の分離、横開腹手術を含む)。(B) 腓腹筋を分離するための連続的な手順(縦方向の切開、上層筋肉の反射、解剖学的構造の特定、筋肉の切除を含む)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. グリコーゲン比色測定法

1. 1日目:アルカリ性消化
   1. 50 mLの遠心分離機チューブに0.4gの組織を加えます。迅速な処理と組織分解の最小化を最小限に抑えるため、±0.1gの許容範囲が許可されています。
   2. チューブに10mLの1Mナオナオ酸溶液を加えます。
   3. 組織を無菌の刃やハサミで粉砕し、組織片が約1〜2mmの大きさになるまで切ります。
   4. チューブを95°C±5°Cの水浴に入れます。
   5. 30分間孵化させます。
   6. インキュベーション中は2,500rpmで10秒ごとに10秒間、サンプルを渦巻かせます。
   7. 水浴からチューブを取り出してください。
   8. サンプルを冷やしてRTにします。
2. タンパク質アッセイのための溶解液の調製
   1. 1mLのアルカリ溶離液を、校正済みのP1000ピペターを用いてマイクロ遠心分離機管に移します。
   2. 遠心分離機で8,000 × gで10分間。
   3. 上清液を採取してください。
   4. 上澄液はBCAタンパク質アッセイのために予約してください。
3. TCA介在の脱タンパク質化
   1. アルカリ溶離液3 mLを15 mL遠心分離機チューブに移します。
   2. 100%(w/v)のTCA溶液を1mL加えます。
   3. 蒸留水を6mL加えて、合計容量を10mLにします。
   4. 2,500rpmで混合気を10秒間ボルテックスします。
   5. チューブを氷(0°C〜4°C)に置きます。
   6. タンパク質を沈殿させるために1時間培養します。
4. 脱タンパク質上清液の収集
   1. 混合物1mLをマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   2. 遠心分離機は8,000 gで10分間RTで10分間×。
   3. 上澄液は取っておきましょう。
5. グリコーゲン沈殿
   1. 上澄液0.4mLを新しいマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   2. 0.1%LiClを含む95%エタノールを0.8mL加えます。
   3. 混合物を徹底的に渦巻かせてください。
   4. RTで16時間孵化します。
6. 2日目:グリコーゲンペレット化
   1. サンプルを1,000 × gで15分間RTで遠心分離し、硬く半透明の白色グリコーゲンペレットを得ます(図3A および 図3B)。
   2. 上清液は捨てる。
7. 最初のグリコーゲン洗浄
   1. ペレットに80%メタノール(LiCl含有0.1%)を1.5mL加えます。
   2. 2,500rpmで10秒間サンプルを渦巻かせます。
8. 洗浄後の遠心分離
   1. 離心分離機で1,000 × gで5分間RTで加熱します。
   2. 上清液は捨てる。
9. 第二グリコーゲンウォッシュ
   1. 洗濯の手順を一度繰り返します。
   2. 残留液体は細かい先端のP200ピペットで慎重に吸引し、グリコーゲンペレットが乱されないようにしてください。
10. グリコーゲン溶解
    1. ペレットに蒸留水を0.8mL加えます。
    2. 2,500rpmでワーテックスを続け、目に見える粒子のない透明で均質な溶液が得られるまで続きます。
11. 標準試験と試料の準備
    1. グルコース標準、ブランク、未知サンプル用の1.5mLマイクロ遠心分離チューブを三重に準備します。
       注意:各チューブに試薬を表 1に従って添加してください。
    2. 指定されたチューブに各標準血糖値を50μL加えます。
    3. 空のチューブに蒸留水50μLを加えます。
    4. 未知のサンプルチューブごとに50μLグリコーゲンサンプルを加えます。
    5. 各チューブに200μLのアントロン反応液を加えます。
12. アントロンの色現像と吸収測定
    1. すべてのチューブを徹底的に渦巻き。
    2. チューブを95°C±5°Cの水浴に入れます。
    3. 15分間孵化します。
    4. チューブを取り外してRTまで冷やしてください。
    5. 各チューブから96ウェルプレートに200μLを移します。
    6. マイクロプレートリーダー(エンドポイントモード、25°C)を用いて620 nmでの吸収を測定し、自動経路長補正を1 cmまで行います。
    7. 標準曲線は線形回帰によって決定される係数(R²)≥0.995で、許容範囲とみなされるべきです。
    8. 三重測定のうちCV%が>20%の個別標準またはサンプルレプリケートは信頼性が低いとみなされ、再実施されるべきです。

図3:異なる栄養状態下でのグリコーゲン単離と定量。 (A) 肝臓サンプルから沈殿したグリコーゲンペレットの代表画像で、食事、空腹、再摂取条件下で採取。(B) 骨格筋サンプルから沈殿したグリコーゲンペレットの代表画像で、食事、空腹、再摂取条件下で提供。(C) 620 nmでの吸収とグルコース濃度の線形関係を示すグルコース標準から生成された標準曲線。(D) 食事、空腹、推薦条件下の血糖値。(E) 食事、空腹時、およびref条件下での肝グリコーゲン含有量。(F) 摂食、空腹、再発信条件下の骨格筋グリコーゲン含有量。データはSEM平均±(グループあたりn =6)として提示されています。統計解析は、ベンジャミニ・ホッホバーグ法で補正された多重比較を用いた通常の一方向分散解析(ANOVA)を用いて行われました。**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001、注:重要ではありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

試薬	0 mg/mL	0.01 mg/mL	0.02 mg/mL	0.05 mg/mL	0.1 mg/mL	0.2 mg/mL	0.5 mg/mL	1 mg/mL	ブランク	未知のサンプル
グルコース標準溶液	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
蒸留水(H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
グリコーゲンサンプル	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
アントロン反応溶液	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

表1:グリコーゲン比色アッセイの反応設定。 アントロン比色測定法で使用されるグルコース標準、空白および未知グリコーゲンサンプルの反応セットアップ。培養および吸収測定の前に、定義された量のグルコース標準物質、蒸留水、またはグリコーゲンサンプルをアントロン反応溶液と組み合わせました。

5. 組織グリコーゲン含有量の計算

注意:測定されたグリコーゲンは組織の湿重または総タンパク質量のいずれかに正規化してください。

1. 標準曲線と濃度の決定
   1. 8本のグルコース標準チューブからの吸収度測定を使いましょう。
   2. 吸収度の測定値から空白値を差し引いてから、グルコース濃度とプロットします。
   3. Excelの通常の最小二乗回帰法を用いて線形回帰曲線をフィッティングします(図3C)。
   4. 各未知グリコーゲンサンプル(C_不明)におけるグルコース濃度を、ステップ5.1.3で得られた回帰方程式を用いてブランク減算吸収を線形標準曲線に補間して計算します。
2. 組織湿重への正規化
   1. グリコーゲン含有量は次の式で計算します:
      
   2. 未知_のCを、ステップ5.1.4で決定された未知グリコーゲンサンプル中のグルコース濃度(mg/mL)と定義します。
   3. 0.8をステップ4.10.1の溶解グリコーゲンサンプル(mL)の体積と定義します。
   4. 0.9をグルコース値をグリコーゲン値に変換する係数として定義します。
   5. 2.5を、ステップ4.5のグリコーゲン沈殿時に導入される希釈因子として定義します。
   6. 10を希釈因子として定義し、ステップ4.3.3で調製された合計10 mL混合物から分析された1 mLのアリコートを考慮します。
   7. 10/3を、ステップ4.1.2で調製された総10 mLアルカリ消化液から使用された3 mLのアリコートを考慮した希釈因子として定義します。
3. 総タンパク質質量への正規化
   1. グリコーゲン含有量は次の式で計算します:
      
   2. 未知_のCを、ステップ5.1.4で決定された未知グリコーゲンサンプル中のグルコース濃度(mg/mL)と定義します。
   3. 0.8をステップ4.10.1の溶解グリコーゲンサンプル(mL)の体積と定義します。
   4. 0.9をグルコース値をグリコーゲン値に変換する係数として定義します。
   5. 2.5を、ステップ4.5のグリコーゲン沈殿時に導入される希釈因子として定義します。
   6. 10を希釈因子として定義し、ステップ4.3.3で調製された合計10 mL混合物から分析された1 mLのアリコートを考慮します。
   7. 1/3を、ステップ4.3.1でアルカリ消化から使用された3 mLのアリコートを考慮した補正係数として定義します。
   8. タンパク質濃度を、ステップ4.2.4のBCAアッセイで決定したアルカリ性消化中の総タンパク質濃度(mg/mL)と定義します。

6. グリコーゲン代謝を触媒する主要酵素のウェスタンブロット

1. 一般的な考察事項
   1. 標準的なウェスタンブロット手順については、前述のプロトコルを参照してください^17,18。
2. タンパク質抽出
   1. スナップ冷凍組織75mgの重量です。迅速な処理と組織の解凍を最小限に抑えるため±25mgの許容範囲が認められています。
   2. 氷で冷えたRIPA溶解バッファー1mL(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.5% デオキシコレートナトリウム、0.1% SDS、および1 mM EDTA)を加え、プロテアーゼおよびリン酸化酵素阻害剤を補足します。
   3. ハンドヘルドのローターステーターホモジナイザーを使って組織を均質化します。
3. 溶解液の製造
   1. ホモジネートは氷上で30分間培養します。
   2. インキュベーション中は2,500rpmで10秒ごとに10秒間、サンプルを渦巻かせます。
   3. 固定角度ローターを用いて10,000 × gで4°Cで5分間遠心分離。
4. タンパク質定量
   1. 上清液を総タンパク質分解液として採取します。
   2. タンパク質濃度を測定するためにBCAアッセイを実施します。
   3. RIPA溶解バッファーで希釈した0、0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/mLのBSA標準を準備します。
   4. 96ウェルマイクロプレートでは、各標準または未知のサンプルを20μLずつ個別のウェルに装填します。
   5. 各ウェルに200μLのBCA作動試薬(試薬A50部と試薬B1部を混ぜて作製)を加えます。
   6. 反応プレートを37°Cで30分間培養します。
   7. RT(18°C–23°C)まで冷却後、マイクロプレートリーダー(エンドポイントモード、25°C)で562 nmの吸収を測定し、自動経路長補正を1 cmまで行います。
5. SDS-ページ
   1. 15μgのタンパク質とSDS-PAGローディングバッファを混えます。
   2. サンプルを95°Cで5分間加熱します。
   3. サンプルを氷で冷やしてください。
   4. サンプルを10%SDS-PAGEゲルにロードします。
   5. ランニングバッファー(25 mM Tris、192 mM グリシン、0.1% SDS)でタンパク質を分離します。
   6. ブロモフェノールブルー染料の前面がゲルの底に達するまで、一定の100Vでゲルを動かします。
6. タンパク質の移動とブロッキング
   1. タンパク質をニトロセルロースまたはPVDF膜に移します。
   2. ニトロセルロース膜の場合、トランスファーバッファー(25 mM Tris、192 mMグリシン、20%メタノール、pH 8.3)で膜を10分間平衡させます。
   3. PVDF膜の場合、100%メタノールに30秒浸けて活性化し、その後トランスファーバッファーで10分間平衡させます。
   4. トランスファーサンドイッチを次の順番で組み立てます:スポンジ、フィルターペーパー、ジェル、メンブレン、フィルターペーパー、スポンジ。
   5. 4°Cで200 mAの定流で90分間タンパク質輸送を行います。
   6. TBST(20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.1% Tween-20)で3%(含水)を準備します。
   7. 膜をRTで1時間、絶えず揺らしながら塞ぎます。
      注意:リン酸化タンパク質を検出する際は無脂肪ミルクの代わりにBSAを使用してください。
7. 一次抗体培養
   1. 一次抗体溶液を1:1,000の希釈でブロッキングバッファーに準備します。
   2. 膜を一次抗体と共に4°Cで一晩、絶え間なく揺らしながら培養します。
8. 洗浄
   1. 膜はTBSTで洗ってください。
   2. 洗濯を3回、それぞれ10分ずつ繰り返します。
9. 二次抗体培養
   1. HRP結合二次抗体をブロッキングバッファーで1:10,000の希釈で製製します。
   2. 膜をRTで1時間、絶えず揺らしながらキュベートします。
10. 洗浄
    1. 膜はTBSTで洗ってください。
    2. 洗濯を3回、それぞれ10分ずつ繰り返します。
11. 化学発光検出
    1. ルミノール/増強剤と安定過酸化物溶液を等量混合して化学発光基板を準備します。
    2. 基質を0.1 mL/cm、^膜 表面積2の容量で塗布し、軌道シェーカー(100 rpm)でRTで2分間キュベークします。
    3. 化学発光イメージャーを使って信号をキャプチャします。
    4. 露光時間は10秒から300秒の範囲でテストし、各ブロットごとに線形検出範囲内の露出を選択します。
    5. 信号の線形性は、機器内蔵のソフトウェアを使ってピクセル飽和がないことを確認することで確認できます。
12. 画像解析
    1. ImageJソフトウェア(バージョン1.51、NIH)を使ってバンド強度を解析してください。
    2. 画像を8ビットグレースケールに変換し、半径50ピクセルのローリングボール背景減算を適用します。
    3. 各帯を同一寸法の長方形の関心領域で定義し、隣接する空白領域から局所背景を差し引いて生の積分密度値を得ます。
13. 総タンパク質染色
    1. 膜を0.1%インディアインク溶液にTBSTでRTで1時間、絶えず揺らしながら培養します。
    2. 膜をTBSTで3回、それぞれ10分ずつ洗ってください。
    3. 複数の染色バンドを負荷制御として定量化し、免疫ブロッティング信号を正規化します。
       注意:ハウスキーピング遺伝子(HKGs)の代わりに全タンパク質染色を使用してください。HKGの発現は実験条件によって異なる場合があります¹⁹。

7. 手法の感度と再現性

1. グリコーゲン標準物質の調製
   1. 1 MのNaOHに20 mg/mLのグリコーゲンストック溶液を準備します。
   2. 以下のように1 M NaOHで段階的に希釈し、15 mL遠心分離機チューブ内で一連のグリコーゲン標準物質(0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.2、0.5、1 mg/mL)を準備します。
      1. チューブ1(1 mg/mL)は、500 μLのグリコーゲンストック溶液と1 M NaOHの9.5 mLを混ぜて準備します。
      2. チューブ2(0.5 mg/mL)は、250 μLのグリコーゲンストック溶液と1 M NaOHの9.75 mLを混ぜて準備します。
      3. チューブ3(0.2 mg/mL)を、100 μLのグリコーゲンストック溶液と1 M NaOHの9.9 mLを混ぜて準備します。
      4. チューブ4(0.1 mg/mL)は、50 μLのグリコーゲンストック溶液と1 M NaOHの9.95 mLを混ぜて準備します。
      5. チューブ5(0.05 mg/mL)は、25 μLのグリコーゲンストック溶液と1 M NaOHの9.975 mLを混合して準備します。
      6. チューブ6(0.02 mg/mL)は、10 μLのグリコーゲンストック溶液と1 M NaOHの9.99 mLを混合して調製します。
      7. チューブ7(0.01 mg/mL)をチューブ1溶液100 μLと1 M NaOHの9.9 mLを混合して準備します。
      8. チューブ8(0.005 mg/mL)を、チューブ1溶液50 μLと1 M NaOHの9.95 mLを混合して準備します。
      9. 15 mLの遠心分離機チューブに10 mLの1 M NaOHを加えて、ブランク(0 mg/mL)を準備します。
   3. 各チューブとボルテックスを2,500rpmで10秒間キャップして混ぜます。
2. アントロン比色測定法
   1. グリコーゲンを抽出し、ステップ4.1.4–4.12.6に従ってアントロン比色アッセイを実施します。
   2. 620nmで吸収度の記録(A₆₂₀)。
3. グリコーゲン濃度の計算
   1. 標準血糖曲線を作成し、ステップ5.1で指定された各標準サンプル(C_標準)におけるグルコース濃度を計算します。
   2. 以下の式を用いて各標準管内のグリコーゲン濃度を計算します:
      
   3. C_標準を 、各標準サンプルで測定されるグルコース濃度(mg/mL)と定義します。
   4. 0.8をグリコーゲンサンプルの体積(mL)と定義します。
   5. 0.9をグルコース値からグリコーゲン値に変換する係数として定義します。
   6. 2.5を希釈係数として定義してください。
   7. 10を希釈因子として定義し、ステップ4.3.3で調製された合計10 mL混合物から分析された1 mLのアリコートを考慮します。
   8. 1/3を、ステップ4.3.1でアルカリ消化から使用された3 mLのアリコートを考慮した補正係数として定義します。
   9. この手順を1日のうちにさらに3回繰り返し、合計4回のランになります。
   10. 4日間で4回のランを繰り返し、合計16ランになります。
4. LODとLOQの計算
   1. y軸の16の吸収度すべてを、x軸の各グリコーゲン標準濃度に対してプロットします。
   2. 線形回帰曲線とR²を計算します。^R2 が≥0.995の線形回帰は許容されます。
   3. LODとLOQは以下の式で計算します。
      
      
   4. σを応答の標準誤差(y切片)として定義します。
   5. Sを線形回帰曲線の傾きと定義します。
5. アッセイ内およびアッセイ間CV%の計算
   1. 各グリコーゲン標準について、1日目の4回の実行から計算された値のアッセイ内CV%を以下の式を用いて算出します。
      
   2. s₁ を、Day 1の4回のランの値の標準偏差と定義します。
   3. を1日目の4回のランの平均値と定義します。
   4. この計算を2日目、3日目、4日目に繰り返し、CV₂、CV₃、CV₄を取得します。
   5. 次の式を用いて最終的なアッセイ内CV%を計算します。
      
   6. 次の式を用いてアッセイ間CV%を計算します。
      
   7. s_inter をCV₁、_{CV 2}、_{CV 3}、CV₄の標準偏差として定義します。
   8. をCV₁、_{CV 2}、_{CV 3}、CV₄の平均値と定義します。

結果

異なる栄養状態下での肝および骨格筋グリコーゲンレベル

夜間の断食は、 任意給餌ラットの血糖値(平均誤差±平均[SEM]の標準誤差)を7.9 ± 0.4 mMから5.4 ± 0.3 mMに有意に低下させました。再給餌2時間後、血糖値は8.3±0.1 mMに回復しました(図3D)。これらの変化に一致して、肝グリコーゲンレベル(SEM±平均)は、摂食条件下で3.85 mg/g±45.05で、夜間断食後に0.13 mg/g±0.63に大幅に減少し、再給餌2時間後には0.73 mg/g±13.29に上昇しました(図3E)。同様の傾向は腓腹筋骨格筋でも観察されました。給餌時のグリコーゲン含有量は0.38 mg/g±2.33で、空腹時に0.22 mg/g組織±1.08に減少し、再給餌後は0.42 mg/g組織で3.05±増加しました(図3F)。グリコーゲン定量に用いら...

ディスカッション

本記事では、動物組織におけるグリコーゲンを定量するための改良アントロン比色法について説明します。従来の組織収穫、アルカリ性消化、グリコーゲン沈殿、アルコール洗浄、アントロン系着色といった連続的な工程に加え、背景干渉を減らすために脱タンパク質化ステップも組み込みました(図1)。この方法を適用して、肝臓および腓腹筋のグリコーゲン含有量の変化を特定の生理学的条件下で評価し、グリコーゲン代謝における生理学的に重要な変化を検出する能力を示しました。グリコーゲンシンターゼやグリコーゲンホスホリラーゼなど、グリコーゲン代謝に関与する主要な酵素の直交ウェスタンブロット解析は、グリコーゲンレベルの変化をさらに支持し、この手法の適用可能性を確認しました。

この方法で測定された組織グリコーゲン含有量は、文献で報告された範囲内にあります。自由に摂食条件下では、肝臓のグリコーゲンレベルは通常33〜80 mg/gの湿重、骨格筋の湿重1〜8 mg/gの範囲ですが、空腹...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心管	LABGIC	BS-15-M	サンプル処理と反応セットアップに使用
15 mLマイクロ遠心管	LABGIC	BS-150-M-S	ライセート処理と沈殿ステップに使用
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	ウェスタンブロットにおける膜洗浄バッファー
37 oCインキュベーター	上海京紅インストゥルメント	HWS-150	BCAアッセイプレートのインキュベーション
50 mL遠心管	LABGIC	CT-112-50A	組織消化と抽出に使用
96ウェルプレート	LABGIC	BS-MP-96W-CL	プレートベースの吸光度測定
分析バランス	常州興雲	FA2204N	化学粉末の重量測定
アンスロン	上海アビディン生化学技術	A108571	グリコーゲン比色検出試薬
Anti-GYS1抗体	Proteintech	10566-1-AP	グリコーゲン合成酵素1の検出
Anti-GYS2抗体	Proteintech	22371-1-AP	グリコーゲン合成酵素2の検出
Anti-phospho-GYS1/2（Ser641）抗体	Cell Signaling Technology	47043S	リン酸化GYSの検出
Anti-phospho-PYGL（Ser15）抗体	Abcam	ab227043	リン酸化グリコーゲンホスホリラーゼの検出
Anti-PYGL抗体	Proteintech	15851-1-AP	肝グリコーゲンホスホリラーゼの検出
Anti-PYGM抗体	Novus Biologicals	NBP2-16689	筋グリコーゲンホスホリラーゼの検出
BCAアッセイキット	Beyotime	P0012	タンパク質定量
安息香酸	上海アビディン生化学技術	B116255	標準物質の飽和溶液の調製
鈍いフォーセット	上海金忠	J42010	つま先のピンチング、組織解剖
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	ウェスタンブロットにおけるブロッキング剤
ケミルミネセンスイメージャ	Tanon	Tanon 5200 Multi	ウェスタンブロット信号の検出
ケミルミネセンス基質（ECL）	Beyotime	P0018S	ウェスタンブロットにおけるシグナル開発
蒸留水	Beyotime	ST872	試薬調製用の溶媒
エピネフリン塩酸塩	Sigma-Aldrich	E4642	in vivo におけるグリコーゲン分解の誘導
エタノール	マックリン	E809065	グリコーゲン沈殿と洗浄
細い外科用はさみ	上海金忠	JA2601	組織解剖
Fresco 17遠心機	Thermo Fisher Scientific	75002402	サンプル遠心分離
グルコメーター	i-SENS	CareSens N	血糖測定
グルコメーター	i-SENS	CareSens N	尾静脈血糖レベル測定
グルコメーターストリップ	i-SENS	CareSens Nストリップ	尾静脈血糖レベル測定
グルコース	マックリン	G6172	標準曲の調製
グリコーゲンストック	Beyotime	D0812	一連のグリコーゲン標準物質の調製
ウサギ抗ラットIgG二次抗体	Thermo Fisher Scientific	31462	一次抗体の検出
ハンドヘルドホモジェナイザー	GreenPrima	PB100	組織ホモジナイゼーション
インド墨	Sigma-Aldrich	198285	正常化のための総タンパク質染色
イソフルラン	RWD生命科学	R510-22-10	動物安楽死
実験用加熱ブロック	常州国旺	GWJ300-1	アッセイ中のサンプル加熱
リチウム塩化物	マックリン	767397	グリコーゲン沈殿の促進
メタノール	上海アビディン生化学技術	M116115	グリコーゲン洗浄ステップ
マイクロプレートリーダー	BioTek	ELx800	620 nmでの吸光度の測定
ニトロセルロース膜	Millipore	HATF04700	タンパク質転写膜
オービタルシェーカー	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	ケミルミネセンス基質のインキュベーション
P1000ピペト	Thermo Fisher Scientific	4641100N	溶液の移送
P200ピペト	Thermo Fisher Scientific	4641080N	残留液の除去
ホスファターゼ阻害剤（PhosSTOP）	Roche	4906845001	タンパク質のリン酸化の保存
プラスチック容器（組織保存用）	Thermo Fisher Scientific	6A0008	収穫した組織の保存
プロテアーゼ阻害剤カクテル	MCE	HY-K0011	タンパク質分解の防止
RIPA溶解バッファー	Beyotime	P0013B	タンパク質抽出
SDS-PAGEゲルキット	Beyotime	P0012A	タンパク質分離
SDS-PAGEローディングバッファー（6X）	Beyotime	P0015F	SDS-PAGEゲルウェルにロードする前にタンパク質サンプルと混合
SDS-PAGEランニングバッファー（5x）	Beyotime	P0014D	SDS-PAGE電気泳動
小動物麻酔機	RWD生命科学	R500	動物安楽死
水酸化ナトリウム	マックリン	S817977	組織消化とグリコーゲン抽出
スプラーグ・ドゥリーラット	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	実験動物モデル
スプレーボトル	Beyotime	TB6310	動物の毛皮に75％エタノールをかける湿潤および消毒
標準飼料	江蘇薛通、株式会社	XTI01ZJ-009	げっ歯類の飼育用飼料
外科用はさみ	上海金忠