転移性卵巣がんおよびマウスの治療反応を研究するための臨床的に関連性の高い移植可能な腫瘍モデル

サマリー

ここでは、卵巣がんの進行、転移、治療反応を研究するための、腹膜内腫瘍モデルおよび滑液内腫瘍モデルを確立するためのステップバイステッププロトコルを示します。さらに、これらのモデルでルシフェラーゼを用いた非侵襲的なin vivo画像診断を用いてマウスの腫瘍進行を監視する方法も説明します。

要約

転移性卵巣がんは、効果的な治療法が欠けている非常に致死性の高い婦人科悪性腫瘍です。卵巣がん患者に対する臨床的翻訳可能な治療アプローチの開発は、卵巣がん転移を促進する要因の理解に依存しています。ほとんどの固形腫瘍は血源性転移を示しますが、卵巣がん細胞は主に腹膜内経路を通じて転移します。この過程では、原発腫瘍から腹膜腔へがん細胞が剥離・脱落し、その後アノイキに抵抗し多細胞集合体を形成する特性を獲得します。これらの細胞集合体は腹膜の中皮内膜に付着し侵入し、転移性病変を形成します。臨床的に関連性の高いin vivoモデルは、細胞因子や腫瘍微小環境が転移過程のさまざまなステップにどのように影響するかを理解し、新しい治療戦略を検証するために不可欠です。卵巣がんの転移および治療反応の研究に広く用いられている移植可能なマウス腫瘍モデルは、腹膜内モデルと滑液内モデルです。本レポートでは、これらのモデルを確立するためのステップバイステップの方法論を説明し、その利点と限界を強調します。さらに、これらのモデルを用いて非侵襲的に腫瘍の進行を監視するために発光イメージングを用いる方法についても説明しています。

概要

卵巣がんの進行を促す要因の理解は大きく進展しているものの、卵巣がんはアメリカ合衆国で2番目に致死率の高い婦人科悪性腫瘍です^。明らかな症状が見られず、信頼できる早期診断マーカーが存在しないため、卵巣がん患者の70%以上が診断時に進行した転移性疾患とな^{っている。}現在の治療法は転移性卵巣がんの治療に効果的でないため、進行期患者の5年生存率は依然として30%未満のままです⁴。治療効果が低い主な原因は、化学抵抗性⁵の出現です。したがって、卵巣がんの転移と化学抵抗性を促す要因を特定することが緊急に求められています。この知識のギャップを解消することは、この疾患を標的とするより効果的な治療戦略を開発するために極めて重要です。これらの目標を達成するためには、卵巣がんの進行の主要なステップを正確に模倣する生体内モデルが必要です。

卵巣がん細胞株や三次元in vitroモデルは、転移や治療反応に影響を与える要因の理解に大きく貢献しましたが、これらのモデルにはいくつかの制限があります ^6,7,8。例えば、これらのモデルは腫瘍微小環境に含まれる異なる非がん細胞を考慮しず、腫瘍^{微小環境6,7,8}内で起こる複雑な相互作用も捉えていません。さらに、in vitro^{モデル6,7,8}を用いて全身的要因とそれらが腫瘍進行および薬物反応に与える影響を研究することは非常に困難です。これらのin vitroモデルの限界は、卵巣がん転移のさまざまなステップ、特に他の細胞種やその微小環境内の要因との複雑な相互作用を正確に模倣するin vivoモデルの必要性を浮き彫りにしています。

遺伝子組み換えマウスモデル(GEMMs)は、^{免疫システムが}完全な自然微小環境で腫瘍が自然発生的に発生するin vivoプラットフォームを提供します。しかし、¹⁰個の生成と維持には時間がかかり、挑戦的でコストもかかります。卵巣がんのほとんどのGEMMは腫瘍の発生に長い潜伏期間があり、生成後でも治療に時間とコストが^{かかります。}移植可能なモデル、例えば異種移植や同種移植モデルは、生物学的関連性と実験の容易さのバランスが良く、GEMM¹¹よりもはるかに低コストで生成されることが多いです。GEMMよりもレイテンシーが低いだけでなく、腫瘍細胞をin vitroで遺伝子改変しやすいため、これらのモデルは異なる遺伝的要因が腫瘍進行にどのように影響するかを研究するのに便利かつ適しています¹⁰。これらの利点により、移植可能な腫瘍モデルは卵巣がんの基礎研究およびトランスレーショナル研究の有用なツールとして浮上しています。

本報告書では、転移性卵巣がんの研究に広く用いられている2つの異なる移植可能なマウス腫瘍モデルの確立プロトコルについて説明します:(1)腹膜内モデル、(2)オルトトピックまたは点綴内モデルです。両モデルとも異種移植片または異種移植片のいずれかとして確立できます。腹膜内モデルでは、がん細胞をマウスの腹膜腔に注入します。卵巣がん細胞を腹膜内空間に導入することは、卵巣がん転移の段階で、原発腫瘍から腹膜腔へ転移性卵巣がん細胞が排出される段階を反映します。ヒトの転移過程と同様に、移植された卵巣がん細胞は敵対的な腹膜微小環境に適応し、腹膜腔を覆う中皮層に付着・侵襲し、網膜、腸間膜、肝臓、横隔膜などの腹膜内臓器や組織に転移性病変を形成する必要があります。腹腔内モデルを作成するために用いられるがん細胞株によっては、転移性腫瘍に腹水を伴うことがあり、これはヒトの末期疾患で観察されます。したがって、腹膜内モデルは卵巣がんの転移およびそれが末^期疾患へ進行する要因を理解するために広く用いられています。これらのモデルは、転移性卵巣がんに対する新しい治療戦略の有効性判断にも有用です¹²。滑液内またはオルトトピックモデルでは、がん細胞が滑液包に移植されます。滑液包はマウスの卵巣を取り囲む膜構造です。このモデルは卵巣腫瘍の初期段階を模倣します。この段階ではがん細胞はまだ卵管と卵巣に限られています。これらの部位からがん細胞は腹膜腔内に排出され、最終的に他の臓器へ転移します。したがって、滑液内モデルは卵巣腫瘍形成の初期段階および腹膜腔を通じた経腔転移に至る事象の両方を研究するのに有用^である。

したがって、腹膜内モデルと滑液内モデルは卵巣がんの転移と治療反応を研究するのに優れたツールですが、模倣する転移過程の特定の段階では異なります。滑液内モデルは転移過程の初期段階から後期段階への卵巣がん進行を模倣できますが、この過程に伴う潜伏期のため、通常は卵巣がん転移の初期段階の研究に用いられます。卵巣がん転移の後期段階に焦点を当てた研究には、腹膜内モデルの方が適しています。さらに、点滴内モデルは腹腔内モデルと比べて技術的にも確立が難しい¹²番です。滑液包内モデルを確立するには、がん細胞を卵巣滑液包に正確に注入できる顕微外科機器を備えた手術室へのアクセスが必要です。がん細胞が腫瘍を形成する能力(「取る率」または「植根率」)も、筋骨内モデルでは腹膜内モデルに比べて通常低いです。さらに、オルトトピック注射や腹腔内注射後に腫瘍を容易に観察できないため、非侵襲的な生物発光画像診断技術が通常用いられ腫瘍の進行を監視します。したがって、腹腔内および滑液内モデルの両方に、腫瘍の非侵襲的画像診断を可能にする追加の機器^{が必要です。}最終的には、実験目標、資源の利用可能性、技術的なスキルセットが各研究のモデル選択を決定します。

本報告書では、ヒト卵巣がん細胞株を用いた腹膜内および滑液内マウス異種移植モデルの段階的プロトコルを説明しています。これらのモデルは、NSG(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)やFoxn1ヌード(B6)などの免疫抑制マウス株に細胞を移植することで確立できます。CG-Foxn1 nu/J)。同じ手法は同種移植(シンジェニック)モデルの生成にも応用可能です。同種移植モデルを構築する際に、マウスの卵巣がん細胞を同じ遺伝的背景を持つ免疫能力のあるマウスに移植します。免疫能力のあるマウスを用いて同種移植片モデルが開発されているため、卵巣腫瘍の微小環境を調節するさまざまな要因、卵巣がん進行における免疫系の役割、免疫療法の有効性を研究するのに有用です。腹膜内および滑液内異種移植マウスモデルの確立に加え、本報告書はこれらのモデルにおける腫瘍進行を非侵襲的に監視するために生物発光イメージングを用いる方法も説明しています。

プロトコル

本プロトコルで記載されたすべての動物処置は、メリーランド大学ボルチモア郡校の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されています(主任研究者 - アチュス・パドマナバン;プロトコル番号 - 1947)。 このプロトコルで使用される材料および機器の完全なリストおよびそれらのカタログ番号は、 材料表に記載されています。

1. マウスへの移植用卵巣がん細胞株の準備

注:本プロトコルで記載されたすべての生体内モデルについては、卵巣がん細胞をマウスへの移植準備が必要です。卵巣がん細胞は、以下に記載された層流組織培養フードで室温で調製されるべきです。指定がない限り:

1. 卵巣がん細胞を37 ^°Cの水被覆_CO2 インキュベーターで、5%_CO2 で維持し、文献で推奨されている標準培地で培養します。腫瘍の非侵襲的なin vivo画像を望む場合は、卵巣がん細胞が移植前にルシフェラーゼを安定的に発現するように設計する必要があります。
2. 細胞が約80%〜85%のコンバーシティに達したら、以下のように無菌状態で収穫します。
   1. 組織培養プレートから培地を吸引します。
   2. カルシウムとマグネシウムを含まない無菌の1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で付着細胞を2回洗浄します。PBS中のカルシウムとマグネシウムの存在はトリプシン活性を妨げ、細胞の接着を促進します。組織培養プレートからPBSを吸引します。
   3. 組織培養プレートに0.05%のトリプシン-EDTAを加えます。使用するトリプシンの量は、組織培養プレートのサイズや扱う細胞株によって異なります。100mmプレート上で増殖するほとんどの細胞株には、0.05%トリプシン-EDTAを1mL使用してください。OVCA420のような強固着性卵巣がん細胞株には、0.25%トリプシン-EDTAを1mL推奨します。
   4. 細胞入りプレートを37 ^°Cの水被覆_CO2 インキュベーターに戻し、組織培養に用として1〜5分間インキュベートします。正確な培養期間は細胞株によって異なります。TYK-NuやHEYA8のように非常に速く剥離する細胞株もあれば、OVCA420のように4〜5分でより長い細胞株もあります。
   5. 細胞が剥離されたら、FBSを含む培地を追加してトリプシンの作用を止めます。トリプシン1mLに対してFBS含有培地6mLを加えます。ピペットを優しく上下に動かして細胞を組織培養皿から外し、単一細胞懸濁液に解離させます。
      注:明視野逆立顕微鏡で観察すると、剥離した細胞は平らで細長いのではなく丸みを帯び、プレートの底にくっつくのではなく自由に浮かびます。
   6. 細胞を円錐形のチューブに集め、400 x g の温度で室温で5分間遠心分離機に入れます。
   7. トリプシンを含む上清液を除去し、細胞ペレットを新鮮なFBS含有細胞培養培地に再懸濁させます。
3. トリパンブルーなどの細胞生存性染料とヘモサイトメーターを使って細胞を数えます。あるいは、自動セルカウンターを使ってセル数をカウントすることもできます。
4. 細胞を無菌1X PBS(pH 7.4)の定型体積で再構成し、単位体積あたりの細胞濃度が目標となるようにします。一般的に使用されるヒト卵巣がん細胞株の推奨注射細胞数は表1、¹³に示されています。
   注:マウスに安全に注入できる最大容量はモデルによって異なります。腹膜内モデルでは、最大推奨容量は500μLです(セクション2.1参照)。点滴内モデルでは、最大推奨容量は5μLです(セクション2.2参照)。
5. 細胞懸濁液は、マウスに注射するまで氷の上に置いておきましょう。できれば細胞を準備後30〜45分以内にマウスに注射してください。

2. マウスにおける移植可能な卵巣がんモデルの確立

1. 卵巣がんの腹膜内モデルの確立
   注:この過程では、ルシフェラーゼを安定的に発現する卵巣がん細胞が成虫の雌マウスの腹腔に注入されます。ルシフェラーゼを安定的に発現する細胞を使用することで、In vivo画像システム(IVIS)を用いた腫瘍進行の縦断的かつ非侵襲的なモニタリングが可能になります。
   1. 第1節で説明した通りにセルを準備してください。1000μLのマイクロピペットで細胞を優しく再懸浮させ、細胞が解離状態を保つようにします。
      注意:塊を外さないと針が詰まってしまいます。
   2. 細胞懸浮液500μLを1mLの注射器に取り込み、21G X 1インチの針を接続します。注射器内に気泡がないか確認してください。
      注:成体のメスマウスに腹腔内注射できる最大容量(25〜30g)は500μLです。したがって、セルを最大500μLの体積内に収めるように、必要なセル数を収容する体積で再懸吊します。一般的に使用されるヒト卵巣がん細胞株の推奨注射細胞数は表1、¹³に示されています。
      注:マウスの体重が20〜25gの場合は、より小さな量(400μL未満)の注入が推奨されます。
   3. 動物をケージから取り出し、粗いものやワイヤーのついた場所に置いて拘束してください。
   4. 図1Aに示すように、利き手でない手で首の付け根のたるんだ皮膚を優しく押さえつけます。
   5. ネズミを優しく持ち上げ、腹部が上を向くように回転させます。 図1Bに示すように指で動物の尾を固定します。
   6. 腹部の中央に想像上の線を引いてみてください。注射部位を特定するために、右下の象限にある正中線と2つの乳首の間に三角形を想像してください。注射部位がこの仮想三角形の中央にあることを確認してください。図 1Bを参照してください。
   7. マウスの頭を少し地面に傾け、後ろの端よりも低くします。この姿勢でマウスを拘束することで、腹部の内容物が頭蓋に移動するのを助けます。これにより、注射時に内臓を貫通するリスクが減ります。
   8. 注射部位を消毒するには滅菌アルコール綿棒を使ってください。
   9. 利き手で注射部位に針を45°以下の角度で挿入します。針の長さの半分以上は0.5インチだけ進めてください。腹腔内での動きは内臓に損傷を与える可能性があるため、針が安定していることを確認してください。
   10. 細胞をゆっくりと一定のペースでマウスの腹腔に注入します。
   11. 針をマウスから同じ挿入角度で引き抜きます。漏れを防ぐために、すぐに消毒済みのゲージを注射部位に置いてください。
   12. 針と注射器は適切な鋭利器に捨ててください。
   13. ネズミをケージに入れる前に、好みの方法で耳にタグを付けてください。イヤータグ付けにより、後で注入されたマウスの特定が可能になります。
2. 卵巣がんの滑液内モデルの確立
   注:滑液内モデルでは、ルシフェラーゼを安定的に発現する卵巣がん細胞を成虫の雌マウスの卵巣滑液包に直接注入します。滑液包は、マウスの卵巣を包む膜状の袋です。卵巣がん細胞における安定したルシフェラーゼ発現により、IVISを用いた腫瘍進行の非侵襲的縦断モニタリングが可能になります。
   1. 1日目 – 滑骨内移植手術のための機器とマウスの準備
      1. 手術に必要な器具はオートクレーブ処理。機器一覧は(図2A)です:
         細かい先端のハサミ、5インチの湾曲型細かい先端鉗子、Mayo-Heger針ホルダー、解剖用宝石用マイクロ鉗子、細かい先端、細かい先端を持つ解剖鉗子器具
      2. マウスに皮下注射で24時間ごとにカルプロフェン(15 mg/kg)を術前鎮痛剤として投与します。
         注意:鎮痛カルプロフェンは手術の1日前から手術後3日間、24時間ごとに皮下投与してください。
   2. 2日目 – マウスの卵巣がん細胞の滑液管内移植
      1. 第1節で説明したように卵巣がん細胞を注射用に準備します。マウス内で安全に点滴内注射できる最大容量は5μLです。したがって、細胞濃度は10⁴ μLの方が望ましいです。これにより、5×10×⁴ 細胞の移植が可能になります。
         注:一般的に使用されるヒト卵巣がん細胞株の推奨注射細胞数は 表1¹³に示されています。
      2. 使用までセルは氷に保管してください。採取後は、できるだけ早く、できれば30〜45分以内に細胞を注入することが推奨されます。
      3. マウスをイソフルランチャンバーに置き、イソフルラン流量4%、酸素流量3.5 L/minで麻酔を誘導します。麻酔状態を確認し、固定されているか、つまみの反発がないか確認してください。
      4. 麻酔されたマウスを滅菌手術用カーテンに移し、その上に37°Cで維持された齧歯類温熱パッドの上に置きます。 迅速に鼻のコーンを装着し、1.5%イソフルランと98.5%酸素で麻酔を維持してください。足のつまみ反射がないことを確認することで、マウスが麻酔されているか確認してください。
      5. 15分ごとに足の指をつまむ反射がないか確認し、手術中ずっとマウスが麻酔状態を保つようにしてください。麻酔中にマウスの呼吸数を監視し、ゆっくりと滑らかにしているか確認してください。呼吸数が変わったら、イソフルランの用量を調整してください。マウスが呼吸困難や息切れを示す場合は、投与量を減らしてください。逆に、マウスが呼吸数が増加する場合は、イソフルランの用量をわずかに増やします。
         注意:マウスを40分以上麻酔状態に置かないように注意してください。これを実現するためには、手術中は効率的かつ迅速に行うことが重要です。
      6. 卵巣がん細胞を滑膜内移植する側をマウスを図 2Bのように上向きに配置します。
      7. マウスの両目に眼軟膏を塗り、乾燥(角膜乾燥)を防ぎます。
      8. もしネズミに毛がある場合は、上向きの側の下半分の毛を剃ります。剃った部分をきちんと掃除し、新しい滅菌パッドにマウスを置いてください。Foxn1のヌード(B6)で作業する場合。cg-foxn1 nu/J)マウスの品種、このステップは飛ばしてください。
      9. 滅菌の外科用ドレープを使い、マウスの体の下半分だけが見えるように覆います。
      10. 手術開始前に石鹸で手をしっかり洗い、新しい無菌手術用手袋を着用してください。手術用手袋をはめた後は、無菌でない部位や物に触れないようにしてください。
      11. 滅菌コットンチップのアプリケーターを使って、内側から外側から時計回りにベタジン液を手術部位に塗布します。次に、滅菌アルコール綿棒で同じ部分を同様の方法で洗浄します。この手順をさらに2回繰り返します。
          注意:手術中は無菌でない物品や部位に触れないでください。非滅菌面に接触した場合は、すぐに手袋を交換してください。点滴注射を行う際には、別の人の助けを強くお勧めします。この人は手術中に無菌でない物品の取り扱いを手伝ってくれます。
      12. アルコールが乾くまで1分待ってください。
      13. 図2Bに示すように、後肢の約1.5cm上、ネズミの肋骨から5mm離れた位置を特定します。この部位の皮膚を曲げた鉗子で持ち上げ、細かい先端のハサミで5mmの垂直切開をします。
          注意:切開を行う前に、マウスが完全に麻酔の影響下にあるか、つまみ反射がないか確認してください。
      14. 片側の皮膚を細かい先端のマイクロフォーセプで固定し、同じ部位の皮下組織に切開を入れます。
      15. この時点で、皮下組織の腹膜層が見えるようになります。細かい先端の湾曲したギザギザ状の鉗子を使って腹膜層を保持し、細かい先端のハサミで約2.5mmの切開を行ってください。
      16. ギザギザ状の鉗子で腹膜切開弁の側面を握り、細かい鉗子で卵巣脂肪パッドの位置を特定します。卵巣は脂肪パッドの下に位置しています。
      17. 切開部から卵巣脂肪パッドと卵巣を少し優しく引き出します。
      18. 解離鉗子を使って脂肪パッドを固定し、卵巣が上向きで動かないようにしてください。
          注意:鉗子で卵巣を押さえないでください。脂肪パッドは滑りやすいので、必ずギザギザの鉗子を使って脂肪パッドを固定してください。
      19. 手伝う人に細胞懸濁液を入れた注射器の準備を頼んでください。0.3mLのインスリン注射器の使用が推奨されています。
      20. 斜面を上向きにして、卵管と卵巣の接合部から卵巣滑液包に優しく針を挿入します。プランジャーを押す前に、必ずベベル全体が滑液包の中に入っていることを確認してください。
          注意:挿入部位の反対側の滑液包を刺さないように注意してください。
      21. プランジャーを優しく押し、注射器の内容物を卵巣滑液包に移します。針を素早く抜いてください。
      22. 卵巣を取り巻く滑液包の腫れは、細胞の接種が成功したことを示します。
      23. 5秒待ってから、卵巣を優しく腹膜腔に戻します。
      24. 6-0吸収性モノフィラメント縫合糸で腹膜を閉じ、1〜2本の簡単な中断手術用縫合を施します。
      25. 皮膚切開部は6-0吸収性モノフィラメント縫合糸で、シンプルなランニング外科用縫合糸で閉じます。切開部から出血がないか確認してください。
      26. 切開部を閉じた後、三重抗生物質軟膏(バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンB)を塗布します。
      27. 痛みの緩和のために、マウスに15 mg/Kgを皮下投与します。
      28. マウスに耳タグを付ける方法を好みます。イヤータグ付けにより、後で注入されたマウスの特定が可能になります。
      29. ネズミを新しいケージに移してください。このケージを半分のケージに置き、少なくとも60分間ヒートパッドで置いてください。この時点で麻酔の効果が完全に切れ、マウスが目を覚まして活動していることを確認してください。
          注:マウスは麻酔下で低体温症になりやすいです。したがって、体温を調節するために外部の熱を与えることが重要です。
      30. 手術後4〜5時間後に、切開部からの出血やその他の不快感の兆候がないかマウスにチェックしてください。
      31. マウスにカルプロフェン15mg/Kgを24時間ごとに皮下投与し、次の3日間にわたり投与してください。
      32. 接種細胞がルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子操作されていれば、第3節で説明したように注射後1日目からの腫瘍負荷をIVISで測定できます。

3. In vivo Imaging System(IVIS)を用いたマウス腫瘍の非侵襲的画像診断

本報告書で述べた移植可能な腫瘍モデルを用いた複数の研究における重要な目的は、腫瘍進行に関する縦断的データの取得です。皮下腫瘍の容積はバーニアキャリパーで推定できますが、腹腔内および滑液腔内モデルで形成された腫瘍にはこの方法が現実的ではありません。この課題を克服し腹腔内腫瘍負荷を特定するために、多くの検査室ではルシフェラーゼを用いた非侵襲的な生物発光画像検査が用いられています。これを可能にするために、移植されたがん細胞はルシフェラーゼを安定的に発現させるように設計され、基質であるD-ルシフェリンの投与時に生物発光を生じさせます。生物発光はIn vivoイメージングシステム(IVIS)を用いて非侵襲的に検出されます。このシグナルを定量化し、腫瘍負荷を追跡し、転移や薬剤治療効果に関する情報を明らかにします。以下では、マウスにおけるルシフェラーゼベースの非侵襲的生物発光画像による腫瘍負荷追跡のプロトコルについて説明します。

1. D-ルシフェリン基質の調製
   1. 無菌条件下で15 mg/mLのD-ルシフェリン溶液を1X PBS(pH 7.4)に調製します。
   2. 0.22μmフィルターを使って溶液を滅菌します。
   3. 使用まではアルミホイルで包んで光から守ってください。
2. 画像取得のためのIVISイメージャーの初期化
   1. IVISイメージャーに接続されたコンピュータで「リビングイメージ」ソフトウェアを開き、ログインしてください。
   2. イメージャーは画像取得のために初期化する必要があります。これは以下の通りに行われます:
      1. ログインすると、 図3Aに示されたようにIVISコントロールパネルのウィンドウが開きます。
      2. ウィンドウの右下にある「初期化」ボタンをクリックしてください(図3A)。システムの初期化には数分かかります。
         注:最初に窓の下部の温度バーが赤く点灯し、イメージングカメラが目標温度の-90°Cに到達中であることを示します(図3B)。
      3. イメージングカメラが目標温度(-90°C)に達すると、温度バーは緑色に変わり、システムの状態は「使用準備完了」と表示されます(図3C)。これでイメージャーはマウスの撮影準備ができました。
         注:露出時間、ビン、絞り値はユーザーの要件に応じて調整可能です。
3. IVIS画像検査のためのマウス準備
   マウス画像診断の前に、D-ルシフェリンを腹腔内注射する必要があります。
   1. ネズミをケージから外し、粗いか有線のついた場所に置いてください。2.1節で説明されている通り、ネズミを優しく首根っこで押さえて適切に拘束します。
   2. マウスを持ち上げて、腹部が上を向くように回転させます。
      注意:マウスが適切に拘束されている場合、4本の脚はすべて外側に伸びてしまいます( 図1B参照)。処置中は尾を指の間に挟んで、さらに抑制を施してください。
   3. 2.1節の腹膜内注射プロトコルに従い、無菌アルコール綿棒で注射部位を洗浄します。
   4. 1mlの結核注射器と30G、1/2インチの針を使って、ストック溶液から適切な量のD-ルシフェリンを腹腔内に注入し、最終用量150 mg/KgのD-ルシフェリンを得ます。
      注:腹膜内注射の手順については、2.1節の「腹膜内注射プロトコル」を参照してください。C57BL/6マウス(合成同種移植モデル用)を使用する場合、IVISを用いた生物発光画像を行う前に毛を除去することが強く推奨されます。黒い毛皮と色素のある皮膚は光を大幅に減衰させ、信号強度を低下させます。
   5. ネズミを優しくケージに戻します。正確な待ち時間と曝露時間は実証的に決定する必要があります。これは次のように決定できます。
      1. D-ルシフェリン注射直後にマウスに麻酔をかけ、セクション3.4に記載された通り2分ごとに20分間画像を撮影します。
         注:この実験を初めて行う際は、D-ルシフェリン投与後のルシフェラーゼシグナルが時間とともにどのように変化するかを調べることが推奨されます。これにより、後続の実験でD-ルシフェリン投与後にマウスを画像化する最適なタイミングが判明します。発光信号は細胞株、マウス異種移植モデル、ルシフェラーゼ発現レベルなど複数の要因によって変動します。
      2. 各インターバルで5秒、10秒、15秒のエクスサウルを取る。
      3. このデータを使って標準的な曲線をプロットします。曲線に基づいて、信号が停滞に達する待ち時間と露光時間を選びつつ、最も強い強度を維持します。
         注:通常、この時間は5〜10分ですが、モデルによっては異なる場合があります。
4. IVISを用いたマウス腫瘍の非侵襲イメージング
   1. 待機期間が終わったら、マウスを4%のイソフルラン濃度と3.5の酸素流量を持つイソフルランチャンバーに入れます。
   2. 足のつまみ反射がないか確認して、ネズミが麻酔されているか確認してください。
   3. マウスをIVISイメージャー内のステージに置き、鼻を鼻のコーン内に滑り込ませて、画像撮影中の麻酔維持を行います。カメラのフォーカス線内に収まるようにし、イメージャーの扉を閉めてください。
      注:イメージャー内のステージには5つのポジションがあります。各体位にはそれぞれの麻酔鼻コーンも備えています。これにより、5匹のマウスを同時に撮影できます。撮影するマウスの数に応じて、コントロールパネルの画面を「D」(広い視野)から「A」(狭い焦点)に調整します。マウスは、撮影中ずっと鼻を麻酔鼻のコーン内に保持していれば、ステージのどこにでも配置できます。マウスはまず背側、次に腹側で順に撮影することが推奨されます。
   4. 露光時間を調整し、コントロールパネルで「取得」をクリックしてください(図3C)。
      注意:コントロールパネルでルミネッセンス、写真、オーバーレイが「オン」になっていることを確認してください。
      画像が撮影されると、ルシフェラーゼ信号を持つマウスの画像が画面に表示されます。
   5. イメージャーを開いてマウスを腹部が上向きに回し、イメージャーの扉を閉じた後に「取得」をクリックします。
      注意:画像検査中は麻酔の維持のために、マウスの鼻が鼻のコーン内にあることを確認してください。
   6. 背側と腹側の両方の画像が取得したら、イメージャーの扉を開けてネズミをケージに戻します。
   7. ネズミが意識を取り戻すまで5〜10分待つ。
5. マウスの腫瘍負荷を測定するためのIVIS画像解析
   1. 画像のカラースケールの調整
      1. 「file」をクリックし、その後「名前を付けて保存」と順に、RAW画像を適切なフォルダに保存してください。
         注:イメージャーは信号強度に応じて自動的に色スケールを調整します。実験期間中に撮影したすべての画像で色のスケールを一定に保つことが望ましいです。また、このソフトウェアを使ってRAW画像を開くことで、後でカラースケールを調整することも可能です。
      2. 手動調整の場合、画面右上にツールパレットの別のウィンドウ(図3D)が表示され、「画像調整」に行き、スケール用の「手動」を選択します。スケール値の最小および最大数を入力し、「Enter」をクリックします(図3E)。
         注意:以前に取得した画像のカラースケールを調整する際は、まず該当するフォルダから保存済みのRAW infoclick.txt画像ファイルを「file」と「open」で開いてください。
         3.5.1.3. この画像はRAW画像とは別に適切なフォルダに保存してください。
   2. マウスの腫瘍負荷の解析
      注:腫瘍負荷の定量的測定では、期間全体にわたって撮影された各マウスの信号強度を測定できます。これらの値をExcelやGraphPadのプリズムに入力して統計解析や腫瘍進行の折れ線グラフを作成できます。
      1. 保存済みの生infoclick.txtファイルをそれぞれのフォルダから開いてください。
      2. 右上に表示されているツールパレットウィンドウのROI(関心地域)セクション(図3F)に行ってください。
      3. 各マウスのROIエリアを手動または「描画」機能を使って自動的に描き、自分に合った形で描いてください。手動で行うには、比較対象のマウスすべての画像で領域を一定に保つ必要があります。
         注:腹腔内接種では、マウスの腹側画像上で胸部と腹部全体のROIを手動で選択するのが最も効果的です。点滴内接種では、信号を伴った背側画像領域のROIを手動で選択するのが最も効果的です。
         注意:自動ROI選択は、画像信号強度の高い領域のみを選択します。
      4. 「ROIを測定する」(図3F)をクリックしてください。これにより、選択した各ROIの総カウントと平均カウントのデータが表示される別のウィンドウが表示されます。
      5. このファイルを後でアクセスできるように、適切なフォルダに保存してください。このデータを使って、MS ExcelまたはGraphPad Prismでグラフをプロットします。

結果

ルシフェラーゼ標識のOVCAR8細胞を用いた免疫抑制状態のFoxn1裸マウスを用いた腹膜内卵巣がんモデルの代表的なデータが図4に示されています。これらの細胞における安定したルシフェラーゼ発現により、III節で説明したIVISイメージャーを用いた非侵襲的生物発光画像による腫瘍進行の縦断モニタリングが可能となりました。Foxn1裸マウスに500万個のOVCAR8-ルシフェラーゼ細胞を腹膜内注射した結果、腹膜腔内に100%の「取る率」で転移性腫瘍が形成されました(図4)。腫瘍は急速に進行し、大きな腫瘍負荷と腹水を引き起こしました(図4A,B)。生体内画像検査では、Foxn1裸マウスの500万個のOVCAR8-ルシフェラーゼ細胞の腹膜内接種後29日以内に高い腫瘍負荷が確認されました(図4C)。マウスにおける腹...

ディスカッション

腫瘍細胞、微小環境、全身因子間の複雑な相互作用を模倣できる能力は、マウスモデルを卵巣がんの進行を研究する優れた資源にしています¹²。卵巣がんの進行と転移を駆動する要因の理解を深めるだけでなく、in vivoマウスモデルは転移性卵巣がんの小分子および治療戦略の前臨床評価にも重要な役割を果たします(^12,15)。これらの利点を踏まえ、転移性卵巣がんを研究するために複数のin vivoマウスモデルが開発されています^12,15。各モデルの利点と限界を理解することは、特定の研究課題に適したモデルを決定する上で極めて重要です。

GEMMは卵巣がん進行を促す要因の理解に大きく貢献しましたが^、開発は困難で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 um シリンジ滅菌フィルター、33mm	フィッシャー・サイエンティフィック	09-720-004
1mlのTBシリンジ	BD	309659
21G、1インチ針	BD	305167
30G、およびfrac12;インチ針	BD	305106
5インチ湾曲型細かいピンセット	フィッシャー・サイエンティフィック	1631
6-0 吸収性モノフィラメント縫合	マクソンTM	6532-11
アルコール綿棒検査(70%イソプロリルアルコール)	ドゥカル・コープ	80003156
ベタジン(1%ヨウ素溶液)	パデュー製品	367618150085
カルプロフェンINJ、50mg/ml	レヴァフェン	RXLEVA50-20INJ
遠心分離機およびnbsp;	エッペンドルフ	5702
D-ルシフェリン	シド・ラボ	MB000102-R70170
宝石職人マイクロ鉗子の解剖、細かい先端	フィッシャー・サイエンティフィック	08-953E
眼軟膏	メドヴェット	11897
細い先端のハサミ	フィッシャー・サイエンティフィック	8940
ヒートパッド	サンビーム	731-500
細かいポイントで鉗子を解離する器具	フィッシャー・サイエンティフィック	S08096
インスリン注射器 3/10ml	BD	328438
イソフラン	フルリソ	フルーリソ250
IVIS	パーキン・エルマー	IVISLMIII
メイヨー ヘーガー ストレートニードルホルダー	フィッシャー・サイエンティフィック	08-966
無菌1X PBS、カルシウムとマグネシウムなし	コーニング	21-040-CV
滅菌コットンチップアプリケーター	マッキーソン	24-106-1S型
無菌ゲージ	ケンダル	3033
無機質パッド/タオル/ドレープ、窓なし	ヘンリー・シャイン	100-9687
トリプル抗生物質軟膏	グローブ	4006-4SL
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	ギブコ	25200-056