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方法論記事

髄膜リンパ質評価のための統合プロトコル:大胸椎注射、リンパ節画像診断、髄膜郭清、全マウント染色

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DOI：

10.3791/71140

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2026年5月29日

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1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、複数の神経疾患に重要な役割を果たすマウス髄膜リンパ管(MLV)を評価するプロトコルを提示します。このプロトコルの目的は、トレーサー排出の機能的評価と背面MLVネットワークの詳細な形態的特徴付けの両方を可能にする統合的手法を提供することです。

要約

髄膜リンパ管(MLV)は中枢神経系(CNS)の恒常性を制御する重要な調節因子として浮上しており、MLVの機能障害はさまざまな神経障害に関与しているとされています。したがって、MLVの形態と機能の包括的な評価は、中枢神経系の生理学や疾患における役割を理解するために不可欠です。本プロトコルは、蛍光トレーサーのイントラクンナマグナ(i.c.m.)注射、頸椎リンパ節(CLN)のライブ画像診断、髄膜郭清、全マウント染色の4つの主要技術を用いたマウスのMLV評価統合手法を説明しています。まず、30Gの針をポリエチレン(PE)チューブを介して注射器と注入ポンプに接続します。マウスが麻酔された後、頸部の筋肉を鈍く剥離して硬膜を露出させ、注射針を大池(CM)に挿入してトレーサーを脳脊髄液(CSF)に正確に制御して届けます。CLNへのトレーサー排出はリアルタイムで可視化でき、その後の髄膜剥離および全着色により背側MLVの詳細な形態学的解析が可能です。全身の施術は3時間以内に完了し、ICM注射、組織灌流、頭蓋骨の隔離、固定液への置着が含まれます。このプロトコルは頭蓋内薬物送達にも適応でき、分子解析と組み合わせることも可能で、髄膜解離術はRNAやタンパク質抽出に適した新鮮で未固定の組織と互換性があります。

概要

MLVは硬膜洞内に位置し、CSF成分や免疫細胞を中枢神経系からCLNsへ運ぶことができます1,2。MLVの発見は、従来の中枢神経系の「免疫特権」という概念に挑戦し、近年研究のホットスポットとして浮上しています。研究によると、MLVの機能障害はアルツハイマー病、加齢に伴う認知機能低下、脳腫瘍、中枢神経系感染症(4,5,6,7)など、さまざまな疾患と密接に関連しています。この分野の研究が進展するにつれ、統合的で再現可能かつ標準化された実験手法の需要が高まっています。

リンパ管研究の既存のほとんどのプロトコルは末梢リンパ管に焦点を当てています 8,9,10。MLVに関連する研究では、頭蓋骨や脳実質を損傷することなくCSFに直接アクセスできるシンプルなCMカニュレーション手術が記載されました11。画像診断技術と組み合わせることで、この方法はグリパ系の機能や脳脊髄液の動態を効果的に評価できます。しかし、MLVの機能や形態を研究するための詳細な実験プロトコルは十分に文書化されていません。

本プロトコルは機能イメージングと形態解析を統合し、同一動物から排水機能および構造形態データを同時に取得できるようにすることで、使用動物数を減らし、データの比較可能性と一貫性を向上させています。全体として、このプロトコルは様々な疾患モデルにおけるMLVの構造的および機能的変化の研究や、薬理学的または遺伝的介入がMLVに与える効果の評価に利用できます。プロトコルは運用手順、主要な注意点、トラブルシューティングのガイダンスを詳細に説明しています。さらに、本プロトコルで記述されているi.c.m.注射技術は頭蓋内薬物送達に独立して適用でき、髄膜解離術は新しい組織と互換性があり、その後のRNAやタンパク質抽出に適合するため、かなりの柔軟性と拡張性を提供します。

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プロトコル

本プロトコルで記述されたマウス手技は、上海大学の動物ケア利用委員会(IACUC)が承認したプロトコル(承認番号)に準拠して実施されました。ECSHU 2023-099)。

1. 手術器具およびバッファーの準備

注意:PFAは中程度の毒性と発がん性のある物質を扱う際、化学換気フード内で作業し、手袋を着用してリスクを最小限に抑えてください。イソアミルアルコールを含むすべての作業は、着火源から離れた化学煙幕内で手袋とマスクを着用し、曝露リスクを減らす必要があります。

  1. 手術用器具を用意します。例えば、直線ハサミ1組、曲がった細かい鉗子2組、鈍先端鉗子2組、マイクロハサミ1組、そして滑らか(ギザギザでない)先端の直線マイクロ鉗子1組です。
    注意:手術器具は75%エタノールで拭き取り、実験前後ともに乾燥状態を保ってください。
  2. バッファーを用意しろ。
    1. 1倍PBS。
    2. 4%パラホルマルデヒド固定液(4% PFA)。
    3. ブロッキング溶液(3%牛血清アルブミン(BSA)、0.5%トリトンX-100、2%胎児牛血清を含む1xPBS)。
    4. 抗体希釈バッファー(3% BSAと0.5% Triton X-100を含む1x PBS)。
    5. アンチフェードマウントメディウム。
      注:調製された試薬は4°Cで1か月間保存可能です。
  3. 2,2,2-トリブロモエタノール麻酔液(アベルチン、1.25%、50 mL)を準備します。
    1. トリブロモエタノールを2 mLのチューブに0.625 g入れ、1.25 mLのイソアミルアルコールを加え、37°Cのシェイカーで完全に溶かします。
    2. 完全に溶解したトリブロモエタノール-イソアミルアルコール溶液を50 mLの円錐形チューブに移し、1xのPBSを加えて総体積を50 mLにし、十分に混ぜます。
    3. 溶液を生物安全キャビネット内の0.22μmフィルターでろ過します。
  4. オブアルブミン、Alexa Fluor 647 コンジュゲート(OVA-647)溶液(2 mg/mL)を準備します。OVA-647 2 mgを人工脳脊髄液(aCSF)1 mLに溶かします。

2. 注入針の組み立てとマイクロインジェクションポンプへの接続

  1. 鈍い鉗子を使って30Gの針を折り、先端11 (外径0.30mm、内径0.15mm、長さ8mm)を保持します。
  2. 30cmのPE-10チューブ(外径0.64mm、内径0.28mm)を使い、壊れた30G針を30G針を含むマイクロインジェクション針に接続します(図1)。
  3. マイクロインジェクションニードルをチューブと30Gの針を接続した状態で、マイクロインジェクションポンプに取り付けます。

3. ICM注射とライブイメージング

注意:針が脳実質を深く貫通しすぎると、注射液が脳脊髄液区画ではなく脳組織内に届き、結果の精度が損なわれ、マウスの死亡につながる可能性があります。手術中はマウスの継続的な生理学的モニタリングが必要です。麻酔の深さは15分ごとにつまみ反射を用いて評価し、動物が痛みを感じない状態であることを確実にします。低体温症およびそれに伴う生理機能への影響を防ぐために、温熱パッドを使用して体温を37°C±0.5°Cに保つべきです。さらに、呼吸と心拍数は30分ごとに記録し、胸椎の動きを観察し心臓頂点を触診して評価してください。ICM注射中に針が深く刺さりすぎて出血が起きた場合、それは注射失敗を示します。実験を中止し、動物を安楽死させろ。

  1. マウスの体重を測り、腹部内注射で200 mg/kgのアバーチンを投与して麻酔します。
    注意:代替麻酔薬(例:ケタミン/キシラジン)も使用可能です。
  2. つまみ反射が止まり、呼吸がゆっくり安定した状態になったら、頸部に脱毛クリームを塗布してリンパ節の毛を除去します。
  3. 背側の首の部分を剃りましょう。
  4. マウスを立体誘導フレームに置き、頭部を幹に対して120°傾けた状態で加熱パッドに置きます(図2A)。
  5. ポビドンヨウ素と75%エタノールで順次洗浄してください。
  6. エリスロマイシン眼用軟膏を塗布してください。
  7. 首の皮膚に正中線の切開を入れ、筋肉層を鈍く切り離します。
    注意:鈍い鉗子を2対使い、筋肉層を分けて出血を最小限に抑えてください。
  8. 細かい鉗子で筋肉を切り離し、CMの上に覆われる半透明の硬膜が見えるようにします (図2B、 C)。
    注意:筋肉を引き戻すには細かい先端の湾曲鉗子を使い、頸椎粘液の露出を一定に保ちましょう。
  9. 立体顕微鏡の下で鈍い鉗子で針を保持し、硬膜面に対して約1〜2mmの深さで45°の角度で挿入します。針の面取りを硬膜に平行に配置し、完全に硬膜の下に位置させます(図2D)。
    注意:硬膜を刺すには、針で優しい力を加えてください。成功した穿刺は、抵抗の明確な喪失、硬膜下の針先の可視化、そして脳髄液の流出によって示されます。
  10. 滲出した脳脊髄液は吸収紙で乾かしてください。
  11. マイクロインジェクションポンプを1 μL/minで投与するように設定します。CM4 にOVA-647溶液5μL(2 mg/mL)を注入します(図2E)。
  12. 逆流を防ぐために針は2分間そのままにしてください。
  13. 髄膜に生物接着剤を一滴塗ります。
  14. 手術の切開部を閉じろ。
  15. マウスの in vivo 画像検査を行い、CLNの色素濃度を様々な時間点(30分、60分)でモニタリングします。以下の画像パラメータを使用します:露光時間:0.5秒;励起フィルター:640nm;発光フィルター:680 nm。

4. マウスの頭蓋骨の背面部分を分離すること

注意:胸郭解離を開始する前に、足のつまみ反射の欠如と自然呼吸の停止を確認してください。

  1. マウスはアベルチン(600 mg/kg)の過剰投与で安楽死し、20 mL 1x PBSまたは生理食塩水で心臓灌流を行います。
  2. ネズミの首を切り落として頭部を分離する。
  3. 頭蓋骨の中央線に沿って切開して頭皮を開けます。
  4. 2本の湾曲した止血抑制器を使って、優しく後退して両側に頭皮を分離します。その後、湾曲した止血器を眼窩に挿入し、鼻腔および口腔領域から残存する頭皮を慎重に剥がします(図3A–C)。
    注意:この方法は頭皮を迅速かつ完全に分離することを可能にします。
  5. 頭蓋骨はそのままにしておき、下顎を切除します(図3D)。
  6. 頭蓋骨の基部から骨を取り除き、脳の腹側部分を露出させます(図3E)。
  7. 頭頂骨の硬膜に接触しないように、鈍い鉗子で脳を慎重に取り出してください(図3F)。
  8. 背側頭蓋骨を5 mL、4% PFAに完全に浸し、4°Cで24時間固定します(図3G)。
    一時停止ポイント:固定された頭蓋骨は4°Cで1週間以上保管しないでください。検体を4°Cから取り出し、室温に戻してから髄膜解剖を行います。

5. マウス頭蓋骨からの髄膜の剥離

  1. 固定された頭蓋骨を5mL 1x PBSで洗浄し、洗いを3回(各10分)繰り返します。
  2. 頭蓋骨を背面を下にして、10cmの皿に1×PBSを入れます (図4A)。
  3. 細かい鉗子の先端で鼓膜の膨嚢を掴むか押し下げて頭蓋骨から取り除きます(図4B)。
    注意:鼓膜水珠の除去は、頭蓋骨からの分離時の癒着による髄膜裂傷を防ぐための重要なステップです。
  4. 頭蓋骨の腹面に沿って約2mmの距離をハサミで密着して滑らかに整えます(図4C)。
  5. 細かい鉗子を使い、髄膜の副鼻腔合流部(COS)領域から残留白組織を丁寧に除去します(図4D)。
    注:残留組織の不完全な除去は免疫標識における非特異的染色の主な原因です。
  6. 細かいマイクロ鉗子を使って、髄膜の片端を頭蓋縁から優しく持ち上げ、反対側の端を持ち上げます(図4E、F)。
  7. 髄膜のボウル状の縁を掴み、COS領域で頭蓋骨から引き離します(図4G)。
  8. 上顎骨はハサミで切除します(図4H)。
  9. 再び髄膜の碗状の縁を掴み、前頭骨の頭部で髄膜を頭蓋骨から引き離します(図4I)。
  10. 残った髄膜を1mL 1x PBSを含む24ウェルプレートに入れ、染色準備をします。
    注:解剖中に特に上矢状静脈洞と横静脈の接合部で髄膜が破裂した場合、そのサンプルはさらなる分析に適さない場合があります。非特異的な背景染色が多い場合は、PFA固定後に焼光ステップ(例:0.1 Mグリシン溶液で40分12分インキュベート)を加え、背景信号をさらに低減します。

6. ブロッキング、一次抗体および二次抗体染色

  1. 1mLピペットを使って1xPBSを吸引し、髄膜がウェルプレートの底部に密着するようにします。
  2. 24ウェルプレートの中で200μLのブロッキング液で、室温で1時間ブロッキングします。
    注意:均一な露出を確保するために、鉗子を使って脳膜をブロッキング溶液中に優しく完全に広げてください。
  3. ピペットを使ってブロッキング溶液を除去してください。
  4. 全マウント髄膜を希釈した抗LYVE-1抗体200μL(リンパ管特異的マーカー13)を1:200希釈(最終濃度1 μg/mL)で4°Cで一晩インキュベートします。
  5. ピペットを使って抗体溶液を除去してください。
  6. PBSを1回(10分)3回洗います。
  7. 全マウント髄膜を室温で1xPBSに1時間培養します。
    注意:抗体培養中は光から守ってください。
  8. ピペットを使って抗体溶液を除去してください。
  9. PBSを1回(10分)3回洗います。

7. 取り付けとイメージング

  1. スライドの中心に100μLのPBS1倍ピペットを置きます。
  2. 全額のメンジスを液滴内に浮かせて広げます(図5A)。
  3. 組織がスライドに平らに付着できるように1倍のPBSを吸引します(図5B)。
  4. 全マウントメニンジに20μLのマウントメディウムを塗布します。
  5. 組織の上にカバースリップを敷きます(図5C)。
  6. スライドは室温で自然乾燥させ、4°Cで保存します。
    ポーズポイント:スライドは最大1か月間4°Cで保存可能です。スライドを4°Cから取り出し、室温に戻します。スライド表面の結露は吸収性の紙で除去します。
  7. 20倍対物レンズを使ってMLV画像を取得しましょう。チャンネルをFLグリーンに設定し、発光波長は518nm、露光時間は100msにします。

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結果

OVA-647のi.c.m.注射後、小動物の in vivo 画像検査により、頸部領域に両側に分布する明確な楕円形の蛍光信号が確認されました(図6A)。成功した注射では、注射後のCLNにトレーサーが明確に見え、蛍光強度は約60分でピークに達しました(図6B)。さらに、孤立した表層および深部の頸部リンパ節でも蛍光信号が観察されました(図6C)。蛍光信号強度の半定量解析により、CLNにおけるOVA-647の蓄積評価が可能です。これに対し、針の誤置(例:CMに入り込まずに脳実質に侵入した)による注射失敗では、頸部領域で検出可能な蛍光信号が検出されませんでした(図6D)。そのようなサンプルはさらなる分析から除外すべきです。

MLVは解剖学的にCOS、横鼻腔(TS)、上矢...

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ディスカッション

このプロトコルは、I.C.m.注射、CLNの in vivo 画像診断、髄膜解離、全マウント染色を統合することで、MLVの機能と形態を評価する包括的な方法を提供します。この統合アプローチの従来の手法に比べて大きな利点は、同一動物内でリンパ管排出機能と血管形態を同時に評価できることであり、別々のコホートを不要にして実験のばらつきを減らし、データの比較性を向上させることです。さらに、切片を必要とする従来の免疫染色法と比べて、全マウント染色はリンパネットワークの三次元構造を保存し、血管面積、直径、分岐パターンをより正確に定量化できます。

このプロトコルの成功は、いくつかの重要なステップに依存しています。重要なステップの一つが正確なICM注入であり、これは適切なトレーサーをCSF内に送達するために不可欠です。髄膜は薄く透明からやや白っぽい膜組織を形成し、脳実質15の上に覆われています。リンパ管に加え、血管が密集しているため、ICM注射が複雑になり出血のリスク...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2023YFC2306500)、中国国家自然科学基金(82502108)、中国博士後科学基金(2024M760542)からの資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

参考文献

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