キャリブレーションされた差分RNA編集スキャナーを用いた高精度なRNA編集部位の検出

サマリー

このプロトコルは、CADRES(CADRES)という計算ワークフローを用いており、DNA–RNAの共同バリアント呼び出し、信号最適化された再校正、重複認識型統計モデルを統合し、高精度で差分RNA編集部位を特定する計算ワークフローです。

要約

RNA編集の正確な区分は技術的に依然として困難であり、真の転写後変異とゲノム変異やシーケンスアーティファクトを区別しなければならない。この困難は特にAPOBEC酵素によって触媒されるシチジンからウリジンへの編集で顕著であり、DNAとRNAの混合変化により真の編集信号が見えにくくなります。校正差分RNA編集スキャナー(CADRES)は、統合されたDNA–RNA変異体調査と本物の編集署名の標的保存を通じて、これらの制限に対処する構造化された計算フレームワークを提供します。このプロトコルは、データ準備、RNAバリアントの共同呼び出し、信号保持ベースの品質再校正、アーティファクトフィルタリング、実験条件間でのRNA編集の差別評価を含むCADRESのワークフローを提示します。CADRESは、生物学的複製を伴うペアRNA-seqおよび全ゲノムまたは全エクソームシーケンスをサポートします。 ホモポリマー除去やPBLATベースのパラローグスクリーニングを含む多段階フィルタリング戦略により、低周波編集イベントを保持しつつ偽陽性を体系的に減少させます。キャリブレーションとレプリケート対応モデリングを組み合わせることで、CADRESはRNA編集解析の精度と再現性を高め、多様な生物学的文脈における編集動態の検証を可能にします。既存の手法と比較して、CADRESは特にAPOBEC介在のC-to-UイベントにおけるRNA編集検出の精度向上を目的としています。

概要

RNA編集は、RNA転写産物内で部位特異的なヌクレオチド置換を可能にする動的な転写後調節層を構成し、基礎となるDNA配列を変化させません。多生動物では、ADAR酵素を媒介するアデノシンからイノシンへの脱>I脱アミネ化が優勢な形態であり、転写多様化、mRNAの安定性、自然免疫調節、神経機能に寄与します^1,2。シチジンからウリジンへの変換(C>U)(以下、生物学的文脈では「C>U」;「C>T」は配列決定の文脈で)脱アミ化は、APOBECファミリーのメンバーによって触媒され、これらの経路と共に作用し、脂質代謝、ウイルス制限、変異誘発、免疫およびがん生物学における新たな調節役割に関与しているとされています^3,4,5,6,7。最近の研究では、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B(A3B)を含む複数のAPOBEC酵素が生理学的および病理学的文脈でRNA編集を触媒することが示^{されています。}APOBEC3酵素もDNA編集を誘導し、RNA編集とゲノム変異^8,10,11,12の区別を複雑にする重なり変異署名を生み出します。

次世代シーケンシングにより、潜在的なRNA編集部位のトランスクリプトーム全体同定が可能になりましたが、真の編集とゲノムSNVや技術的なノイズを区別することは依然として困難です。A>IおよびC>UイベントはcDNAライブラリ内でA>GおよびC>T置換として現れ、ミスプライミング、ポリメラーゼエラー、マッピングアーティファクト、文脈特異的発現変化によって混同されることがあります。REDIportal¹³のような公共資源は数百万のA>Iサイトをカタログ化していますが、C>Uの注釈は生物学的および分析的制約の両方を反映してまばらなままです。したがって、C>U編集の信頼できる特定、特に条件間の変化は、依然として満たされていない分析的ニーズです。

ここで提示する手法である校正差分RNA編集スキャナー(CADRES)の全体的な目標は、RNA上の差異変異株(DVR)を正確に特定することです。DVR、すなわち、2つ以上の定義^{された条件間}で編集深度が統計的に有意に変化する編集部位です。このプロトコルを作成するにあたり、私たちは二つの持続的な障害に対処しようとしました。まず、正真正銘のRNA編集はDNAでコードされた変異と区別しなければなりません。次に、編集差は生物学的に再現されたRNA-seqデータセット間で統計的に堅牢に定量化する必要があります。CADRESの中心的な革新は、遺伝子品質スコア再校正(BQSR)におけるRNA変異の解析と、共同DNA/RNA変異の呼びかけを統合した点にあります。この「ブースト再キャリブレーション」戦略は、BQSR中に新たに発見されたRNA編集部位を保存し、低周波編集の感度低下をよく防ぐことで、15,16,17。このアプローチは、不完全なRNA編集データベースのみに依存するパイプラインと比べて偽陰性を減らし、特異性を向上させます。

CADRESは、RNA編集解析の異なる側面に対応する手法群の中に位置しています。RNAのみの変異セットからのSNPiR¹⁸およびRVboost¹⁹のフィルターアーティファクト;VaDiR²⁰はDNA–RNA比較を組み込んでいますが、複製構造のモデル化は行っていません。rMATS-DVR²¹はGLMMに基づく鑑別検査を行いますが、RNA-seqのみに依存しています。JACUSA/JACUSA2^22,23は複製認識検出を支援しますが、共同DNA–RNAの照会や再校正戦略は組み込まれていません。CADRESは、再現性に応じた統計モデル、共同DNA/RNAバリアント呼び出し、そしてde novo編集部位向けにリキャリブレーションを統合し、APOBEC活性^10、11、12に関連するC>Uイベントを含む条件依存のRNA編集検出に最適化された単一のワークフローを提供します。

この文脈では、実験システムが以下の基準を満たしている場合、CADRESが適切と考えることができます。まず、同じサンプルからRNAセクシーと全ゲノムまたは全エクソームのシーケンスが可能となり、RNA由来イベントとDNAコードバリアントの厳密な分割が可能です。第二に、生物学的な問題は、酵素誘導、環境ストレス、発生段階、疾患状態などの条件下でのRNA編集の変化に関するものであり、複製体間のアレル特異的深さの統計的モデリングが不可欠です。第三に、研究者はC>U編集検出において特異性の向上を目指しており、APOBEC駆動のDNA変異誘発とRNAイベントの区別が不可欠です。CADRESは、APOBEC活性がRNAとDNAの両方の編集を誘導する系で特に有用であり、誘導性A3Bモデル10,11,12で示されているように、従来のRNA単独手法では交絡SNVや反復配列アーティファクトにより偽陽性率が増加する。

CADRESはいくつかの実用的な利点を提供します。その結合DNA/RNAバリアントコールにより、SNV駆動の偽陽性が減少します。ブースト再キャリブレーションは、リファレンスデータベースに存在しない新しい事象を含む真の編集信号を保持します。rMATS由来のGLMMは、レプリケート間の差分編集解析のための統計的原理に基づくフレームワークを提供します。これらの特徴が組み合わさることで、実験的および疾患の環境における動的RNA編集を研究するための校正済みかつ高精度なプラットフォームが生まれます。前回の研究¹⁴では、CADRESがシリコシミュレーションデータセットと実際の誘導性A3B細胞モデルの両方を用いて確立されたRNA編集検出手法と厳密にベンチマークされました。インサイリコ評価では、CADRESは重複数値で精度スコア0.85–0.95、精度スコア0.92–0.98を一貫して達成しました。CADRES全体のワークフローは 図1に示されています。

プロトコル

このプロトコルは、CADRESフレームワークを用いてC>U RNA編集イベントを特定する純粋に計算バイオインフォマティクスのワークフローを記述しています。すべての手順はLinux環境内でコマンドラインを使って実行されます。公開されているシーケンシングデータセットのみを使用し、ヒトや脊椎動物の被験者は含まれていません。

1. 環境設定とソフトウェアインストール

注:CADRES ワークフローの最低計算要件は以下の通りです:CPU ≥8コア(推奨16コア)、RAM ≥32 GB(全ゲノムデータセットでは推奨64 GB)、ディスク容量≥100 GB。

1. Linuxオペレーティングシステムが利用可能かどうかを確認してください。ターミナルウィンドウを開き、現在のユーザー環境でインストール許可があるか確認してください。
2. もしシステムにまだCondaパッケージマネージャーがなければ、インストールしてください。公式ウェブサイトから最小限のConda配布用のインストーラーをダウンロードできます。画面上の指示に従ってインストールスクリプトを実行します。
3. 次のコマンドを入力してCondaが有効かどうかを確認し、有効なバージョン番号を出力してください。
   $ conda --バージョン
4. CADRESワークフロー用のワーキングディレクトリを作成します。以下を使ってこのディレクトリにアクセスしてください:
   $ CD /path/to/working_directory
5. CADRESのソースコードは以下を実行します。
   $ git clone --branch v1.0.0 https://github.com/junsun-hash/CADRES
6. クローンディレクトリに以下を実行します:
   $ cd cadres(カナダのカドレス)
7. CADRESリポジトリ内のenvironment.ymlファイルを使って専用のConda環境を作成します。次のコマンドを実行し、インストールプロセスが中断されることなく完了します。
   $ conda env create -f environment.yml
8. 次のコマンドを入力して新たに作成された環境を起動します。環境が起動されているかは、ターミナルのプロンプトに名前が表示されているか確認してください。
   $ conda 起動 CADRES
9. 必要なコマンドラインツールが正しくインストールされているか確認してください。以下のコマンドを実行し、エラーメッセージではなくバージョン番号を返すことを確認します:
   $ Python --version
   $ samtools --version
   $ ガトク ―― 助けて
   $ ベッドツール -- バージョン
   $ pblat
   注意:CADRES環境に含まれる正確なツールセットは、environment.ymlファイルの更新によって若干異なる場合があります。ツールが不足している場合は、環境を再作成するか依存関係リストを必要に応じて更新してください。
10. 十分なディスク容量を確保してください。参照ゲノム、アラインメントインデックス、中間BAMファイル用に少なくとも100GBの空きスペースが存在することを確認するには、以下を入力してください:
    $ df -h
11. すべての作業ディレクトリ、出力ディレクトリ、一時ディレクトリで書き込み権限が利用可能か、テストファイルを作成することで確認してください:
    $ 触ってtest_file.txt
12. その後、以下を入力してファイルを削除してください:
    $ RM test_file.txt

2. データ準備

注:本プロトコルで使用された代表的なデータセットは以下の通りです:ドキシサイクリン誘導性A3B–GFPを持つHEK293T細胞;WGSは33×;鎖特異的ペアエンドRNA-seq(2×150 bp、≥60 Mリード/サンプル);n = 1つの疾患ごとに3回の生物学的複製(DMSO対ドキシサイクリン72時間)。詳細データ:SRA PRJNA1211186。chr22のデモンストレーション部分セットはCADRESリポジトリに提供されています。

CADRESは以下の要件を要求します:(i) WGS(≥33×)またはWES(≥33×);(ii) 鎖特異的、対端RNA-seq(サンプルあたり≥6,000万リード);(iii) 2つの実験条件で、それぞれ≥2個の生物学的複製。

1. 参照ゲノムと注釈を準備してください。
   1. Ensemblまたは類似のリポジトリから参照ゲノム(FASTA)およびGTF注釈ファイルをダウンロードしてください。推奨されるリファレンスゲノムはEnsembl GRCh38プライマリアセンブリ:https://ftp.ensembl.org/pub/release-111/fasta/homo_sapiens/dna/ であり、推奨されるGTF注釈はGENCODEリリース45です。
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/。
   2. 参考文献FASTAを索引付け:
      $ Samtools FAIDX FASTA_FILE.fa
      染色体の命名規則(例えば「chr1」と「1」)がすべての参照資料で一貫していることを確認しましょう。
2. シーケンスデータを入手してください。
   1. 深さ≥33×のDNA-seq FASTQファイル(WGSまたはWES)を取得してください。
   2. 2つの生物学的条件および1グループあたり少なくとも2回の生物学的複製で、1サンプルあたり≥6,000万リードを持つ鎖特異的、ペアエンドRNAシークシーク序FASTQファイルを取得します。
3. BWA-MEMを使ってDNAシーケンスリードをアライメントします。
   1. BWA指数を構築する:
      $ BWA指数Homo_sapiens。GRCh38.dna.primary_assembly.fa -p bwaindex -a bwtsw
   2. BAMにアラインして変換する:
      $ bwa mem -R '@RG\tID:ID\tPL:platform\tLB:library\tSM:sample_name' bwaindex wgs_R1.fq.gz wgs_R2.fq.gz |SamTools View -b > wgs.bam
4. STARを使ってRNAシーケンスリードをアラインメントします。
   1. STARゲノムインデックスの作成:
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      ――genomeFastaFiles Homo_sapiens。GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --ゲノムディア STAR_index \
      --sjdbGTFファイルHomo_sapiens。GRCh38.gtf
   2. アラインメントRNAリード
      $ スター \
      --ゲノムディア STAR_index \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFファイルHomo_sapiens。GRCh38.gtf \
      --出SAMタイプBAM未分類\
      --アウトSAMmapqユニーク60 \
      --outFileNamePrefix pass1_
      注:これにより、注釈付き接続と新規接続の両方を含むスプライス接続ファイル(pass1_SJ.out.tab)が生成されます。
   3. 新規接合部を取り入れたSTARゲノムインデックスの再生成:
      $ cat の pass1_SJ.out.tab > SJ_all.tab
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      ――genomeFastaFiles Homo_sapiens。GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --ゲノムディア STAR_index_2pass \
      --sjdbGTFファイルHomo_sapiens。GRCh38.gtf \
      --sjdbFileChrStartEnd SJ_all.tab
   4. 更新されたインデックスを使って2回目のパスアライメントを行います:
      $ スター \
      --ゲノムディア STAR_index_2pass \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFファイルHomo_sapiens。GRCh38.gtf \
      --アウトSAMタイプ BAM ソートドバイ座標 \
      --アウトSAMmapqユニーク60 \
      --outFileNamePrefix output_name
5. 補助参考資料を準備してください。
   1. (おすすめ)dbSNP VCFを取得してください
      NCBI FTPサーバーから人間のGRCh38 dbSNP VCF(例:dbSNP build 150)をダウンロードしてください:
      https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/latest_release/VCF/ ダウンロードしたファイル(例えばdbsnp_150.vcf.gz)をワーキングディレクトリに入れます。
      注:dbSNP中のRNA由来エントリ(molType=「cDNA」)は、真のRNA編集部位を隠すことがあります。以下を用いて除外します:
      $ bcftools view -i 'INFO/molType!="cDNA"' dbsnp.vcf.gz -Oz -o dbsnp_no_cDNA.vcf.gz
   2. (おすすめ)dbSNP VCFをソートします
      VCFを参照ゲノムおよびGATKと互換性のあるものに分類します:
      $ gatk SortVcf \
      -dbsnp_150.vcf.gz \
      -ああdbsnp_150.sorted.vcf.gz \
      --シーケンス辞書Homo_sapiens。GRCh38.dict
   3. (おすすめ)ソート済みdbSNP VCFをインデックス化します
      ソート済みdbSNP VCFのインデックスを作成します:
      $ gatk IndexFeatureFile -I dbsnp_150.sorted.vcf.gz
      注意:対応する参考辞書が必要です。ファイルがHomo_sapiens。GRCh38.dictが欠けています。以下のように生成してください:
      $ gatk CreateSequenceDictionary \
      -Homo_sapiens。GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      ―おHomo_sapiens。GRCh38.dna.primary_assembly.dict
   4. (おすすめ)gnomADジェルムラインVCFを取得する
      GRCh38 gnomADの生殖株株変異部位VCFは以下からダウンロードできます:https://gnomad.broadinstitute.org/downloads パイプラインに適したゲノムVCFを使用してください(例:gnomad.genomes.vX.X.sites.vcf.gz)。
   5. (おすすめ)gnomAD VCFをソートする
      互換性を確保するために、同じ参照辞書を使ってgnomAD VCFをソートしてください:
      $ gatk SortVcf \
      -gnomad.vcf.gz \
      -ああgnomad.sorted.vcf.gz\
      --シーケンス辞書Homo_sapiens。GRCh38.dict
   6. (おすすめ)ソートされたgnomAD VCFをインデックス化します
      ソートされたgnomAD VCFのインデックスを作成します:
      $ gatk IndexFeatureFile -I gnomad.sorted.vcf.gz
      注意:SortVcfを実行する前に、染色体命名(例:「chr1」と「1」)が参照FASTAと一致していることを確認してください。
6. 既知のRNA編集参照を取得します。
   注意:CADRESに適した互換性のあるREDIportal参照ファイル(rediportal.txt)はCADRESリポジトリ内でキュレーションされており、以下から直接ダウンロード可能です:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0。このファイルはステップ3で既知の編集イベントの注釈付けに使用されます。
7. RefGene形式で遺伝子注釈を作成しましょう。RefGeneの注釈(例:UCSCのrefGene.txt.gz)をダウンロードしてください。必要に応じて減圧し、染色体名が参照ゲノムのものと一致するか確認します。
   注:CADRESに適した例はCADRESリポジトリ内で厳選されており、以下から直接ダウンロード可能です:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0

3. CADRES 分析ワークフローの実行

注意:セクション3はLinuxターミナルでCADRES Conda環境を有効にして実行されます。

1. キャリブレーションおよびブースト再キャリブレーション
   注:ステップ1ではBAMファイルの標準化とBoostリキャリブレーションを行います。これはdbSNP、gnomAD、そして本物の編集シグナルを保持するための予備的なRNA編集候補を組み込んだ強化版BQSRです。すべてのRNA BAMファイルをスペースで区切ってリストアップします。出力:再調整されたBAM(接尾辞:_recalibration.bam)およびBoost候補サイト。
   1. ステップ3.1を実行するには:
      $ パイソンpipeline_step1_calibration.py \
      --rna_bams /path/to/rna_sample1.bam /path/to/rna_sample2.bam ... \
      --dna_bam /path/to/wgs_normal.bam \
      --ゲノム /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /path/to/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step1_calibration \
      --接頭辞project_demo
      注:ブースト候補は、予備的なDNA-RNAのMutect2コール(--max-events-in-region-4、PASSフィルターのみ、追加のAF/品質閾値はなし)から構築されます。ホモポリマーと繰り返しのフィルタリングはステップ3.2で扱われます。
2. バリアントコール、汚染推定、フィルタリング
   注:ステップ3.2では、汚染推定(gnomAD経由)と共にDNA-RNAバリアントの共同呼び出しを行い、ホモポリマーの文脈とPBLAT再配列によって候補をフィルタリングします。出力:{接頭辞}.final.vcf。
   1. ステップ3.2を実行するには:
      $ パイソンpipeline_step2_variant_calling.py \
      --rna_bams ./output/step1_calibration/rna_sample1_split_recalibration.bam ... \
      --dna_bam ./output/step1_calibration/DNA_processed_recalibration.bam \
      --ゲノム /path/to/hg38.fa \
      --ノマド /道/gnomad.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step2_variant_calling \
      --接頭辞project_demo
      注:このステップでは、すべてのサンプルにおける高信頼度のRNA-DNA差異を表す、厳密にフィルタリングされた最終的なバリアントコールセット(project_demo.final.vcf)が生成されます。主要パラメータ:Mutect2 --min-miden-base-quality 12, --max-events-in region 4;PBLATのminbasequal 5;すべてパイプラインスクリプトで事前設定されています。
3. 統計的検定と機能注釈
   注:ステップ3.3では、rMATSから応用されたGLMM(ベンジャミニ・ホッホバーグFDR補正)を用いて差別RNA編集を定量し、各部位に遺伝子領域、遺伝子記号、既知の編集状況を注釈付けします。出力:{接頭辞}_Result.txt(P値とFDRを含むDVR)。
   PBLAT再アラインメントフィルターは複数のゲノム遺伝子座にマッピングされる候補を除去し、反復領域での特異性を高めます。内部THREAD_COUNTはpipeline_step2_variant_calling.pyの--スレッドフラグで制御されています。
   1. ステップ3.3を実行するには:
      $ パイソンpipeline_step3_statistical_test.py \
      --group1_rna_bams ./output/step1_calibration/control_rep1.bam ... \
      --group2_rna_bams ./output/step1_calibration/treated_rep1.bam ... \
      --final_vcf ./output/step2_variant_calling/project_demo.final.vcf \
      --ゲノム /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /path/to/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --known_editing /path/to/rediportal.txt \
      --gene_anno /path/to/refGene.txt \
      --output_dir ./output/step3_statistical_test \
      --ラベル コントロール処理済み
      注:主なパラメータ:samtools mpileup -q 30(最小マッピング品質)、-Q 17(最低基準品質);rMATS-GLMM尤度比検定(Δψカットオフ=0.0001)、重複認識多変量正規刑罰(rho = 0.9)の二項ロジットリンク;ベンジャミニ・ホッホバーグFDR訂正;すべてパイプラインスクリプトで事前設定されています
      3つのパイプラインステップすべてが--threadsフラグ(デフォルト:1ステップ4)によるマルチスレッド実行をサポートしています。ステップ2はさらに--contamination_threads(デフォルト:2)も受け入れます。

4. 結果の検査と可視化

1. CADRESのワークフローが完了したら、出力ディレクトリに移動します。主な結果ファイル{prefix}_Result.txtには、RNA上で検出されたすべての差異変異(DVR)が掲載されており、ゲノム座標、対立遺伝子、複製レベル対立遺伝子数、編集分数、グループ間差、関連する統計指標(P値およびFDRなど)が含まれます。遺伝子レベルの注釈(遺伝子記号、領域、鎖、変異型、既知のSNP/編集状態)も含まれています。付随する要約ファイル{prefix}_Result_summary.txtは、各置換タイプのカウントと、それらをSNP DVR、既知のRNA編集DVR、そして新規DVRに分類しています。
2. (任意)ポストアナリシススクリプトを実行して標準的な可視化を生成します。Rセッションを開き、次の通りに入ります:
   Rコンソール:
   出典("Post-analysis.R")
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/ にはPost-analysis.Rというスクリプトが含まれています。
3. ファイル選択ダイアログが表示されます。{prefix}_Result.txtを選んでください。この文字は6体のPNGフィギュアを生成します。
   注意:ファイル選択ダイアログにはデスクトップRセッションが必要です。ヘッドレスサーバーでは、input_file変数を直接編集(Post-analysis.Rの10行目)し、Rscript Post-analysis.Rを実行します。

結果

現実的な実験条件下でCADRESを評価するために、293T細胞で誘導性APOBEC3B(A3B)システムを用いました。A3B-GFPを発現するドキシサイクリン応答性レンチウイルス構成体を293T細胞に導入し、プロマイシンで安定インテグレートを選択しました。ドキシサイクリンを72時間誘導すると、GFP蛍光とA3B mRNAレベルの増加により、強力なA3B-GFP発現が得られました。誘導されたサンプルと非誘導サンプルは、均一なDNAおよびRNA抽出、ライブラリー準備、シーケンスを行い、観察されたRNA-DNAの違いが技術的なノイズではなく真のA3B依存的な編集を反映していることを確認しました。完全な生データセットはSRA登録PRJNA1211186で利用可能で、デモンストレーションおよびテスト目的でCADRES GitHubリポジトリ(https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0)に染色体22セグメント(chr22:28,000–30,000 kb)のサブセットが提供されています。

ディスカッション

ここで紹介するCADRESのワークフローは、特にAPOBEC酵素によるC>U脱アミ化を検出するための、高特異性の差異RNA編集イベントを検出するための、校正済みかつ内部的に一貫した戦略を提供します。プロトコル内のいくつかの段階がその正確さに不可欠です。マッチングされたゲノムおよびトランスクリプトムのシーケンスは、本物のRNA編集と基礎となるDNA多型を区別するために不可欠であり、ブースト再キャリブレーション手順は、基底品質スコア再キャリブレーション時に本物のRNA変異が誤ってペナルティを受けるのを防ぐために重要です。同様に重要なのは、ホモポリマーランやマルチマッピングリードによる偽陽性コールを減らす配列組成およびマッピングフィルター、そして鎖状分離アレル深度測定の利用です。微分編集の信頼できる識別は、rMATS一般化線形混合モデル内での複製構造の適切な定義に依存します。

CADRESはエンドツーエンドのパイプラインとして設計されていますが、実用的な制約に合わせていくつかのコンポーネントを適応させることができます。詳...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BCFtools	Samtoolsプロジェクト	N/A	バージョン1.21。バリアントコールとVCF操作。URL: https://github.com/samtools/bcftools
Bedtools	Quinlan Lab	N/A	バージョン2.31.1。ゲノムの算術操作。URL: https://github.com/arq5x/bedtools2
Biopython	Biopythonプロジェクト	N/A	バージョン1.85。分子生物学用のPythonツール。URL: https://www.biopython.org
BWA-MEM	GitHub (lh3/bwa)	N/A	バージョン0.7.18。DNA-seqアライメント。URL: https://github.com/lh3/bwa
CADRESソースコード	GitHub (junsun-hash/CADRES)	N/A	バージョン1.0.0。CADRESパイプラインスクリプト。URL: https://github.com/junsun-hash/CADRES
CondaまたはMiniconda	Anaconda Inc.	N/A	バージョン23.1。パッケージと環境マネージャー。URL: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCF	NCBI	N/A	ビルド155。一般的な生殖細胞バリアントデータベース。URL: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4	Broad Institute	N/A	バージョン4.3.0.0。ゲノム解析ツールキット。URL: https://github.com/broadinstitute/gatk
Git	Software Freedom Conservancy	N/A	バージョン2.39。バージョン管理システム。URL: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCF	Broad Institute	N/A	バージョン3.1。集団アレイ頻度。URL: https://gnomad.broadinstitute.org
GTFアノテーションファイル	Ensembl	N/A	リリース109。GRCh38の遺伝子アノテーション。URL: https://www.ensembl.org
ヒトリファレンスゲノムGRCh38	Ensembl/UCSC	N/A	リリース109。リファレンスゲノムアセンブリ。URL: https://www.ensembl.orgまたはhttps://hgdownload.soe.ucsc.edu
Linuxワークステーションまたはサーバー	様々な	N/A	Ubuntu 20.04。x86_64アーキテクチャが必要。URL: https://ubuntu.com
pblat	UCSC Genome Browser	N/A	バージョン2.5.1。並列BLAT再アラインメント。URL: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
Picard	Broad Institute	N/A	バージョン2.20.8。NGSデータ操作。URL: https://github.com/broadinstitute/picard
Python	Python Software Foundation	N/A	バージョン3.9.19。プログラミング言語。URL: https://www.python.org
R	R Foundation	N/A	バージョン4.5.2。統計計算。URL: https://www.r-project.org
Rパッケージ: forcats	CRAN	N/A	バージョン1.0.0。ファクター操作。URL: https://cran.r-project.org/package=forcats
Rパッケージ: ggplot2	CRAN	N/A	バージョン4.0.1。データ可視化。URL: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
Rパッケージ: ggrepel	CRAN	N/A	バージョン0.9.5。テキストラベル反発。URL: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
Rパッケージ: lme4	CRAN	N/A	バージョン1.1.35。線形混合効果モデル。URL: https://cran.r-project.org/package=lme4
Rパッケージ: readr	CRAN	N/A	バージョン2.1.5。高速ファイル読み取り。URL: https://cran.r-project.org/package=readr
Rパッケージ: stringr	CRAN	N/A	バージョン1.6.0。文字列操作。URL: https://cran.r-project.org/package=stringr
REDIportalリファレンス	ボローニャ大学	N/A	バージョン2.0。A-to-I RNAエディティングサイトデータベース。URL: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
RefGeneアノテーション	UCSCテーブルブラウザ	N/A	リリース109。遺伝子構造アノテーション。URL: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
Samtools	Samtoolsプロジェクト	N/A	バージョン1.21。BAMファイル操作。URL: https://github.com/samtools/samtools
STARアライナー	GitHub (alexdobin/STAR)	N/A	バージョン2.7.11b。RNA-seqアライメント。URL: https://github.com/alexdobin/STAR