収縮活動の in vitro 薬理学的評価のための単離ウサギ十二指腸平滑筋の標準化調製

サマリー

ここでは、収縮活動のリアルタイムデータ記録を行う水平定温平滑筋実験システムを用いて、単離されたウサギ十二指腸平滑筋のin vitro 薬理学的評価のための調製を標準化するプロトコルを提示します。

要約

消化管平滑筋の協調収縮活動は、正常な消化、吸収、輸送機能を維持する生理学的基盤を形成しており、その機能障害は運動障害と密接に関連しています。単離臓器灌流技術は、神経、内分泌、血行動態などの複雑な 生体内 干渉を除去し、薬理学的研究の古典的なモデルとなっています。この目的のために、本研究はウサギ分離十二指腸平滑筋の標準化調製のための段階的プロトコルを詳述します。手順のワークフローは、溶液の準備、ウサギの安楽死、迅速な組織切除のための正確な腹部中間開腹術、平滑筋ストリップの吊り下げ、リアルタイムの張力記録用トランスデューサーの校正といった重要なステップを強調しています。この技術的プラットフォームに基づき、火香正奇経口液体(HXZQ-OL)が自然収縮およびアセチルコリン/塩化バリウム誘発性破傷風収縮に与える効果を評価し、方法をさらに検証しました。結論として、本プロトコルは堅牢で再現性の高い方法論的枠組みを生み出し、消化管運動性を標的とした治療薬の薬理学的評価のための 広く応用可能なin vitro スクリーニングプラットフォームを提供します。

概要

消化管平滑筋の協調収縮活動は、正常な消化機能、吸収機能、^{輸送機能を維持する}生理学的基盤となります。その機能障害は、過敏性腸症候群²、機能性消化不良³、術後消化器運動障害4など、さまざまな一般的な臨床疾患と密接^{に関連しています。}平滑筋活動を調節する分子的・薬理学的メカニズムの解明は、新規のプロキネティックまたは抗痙痙療法の開発に不可欠です。この研究分野では、孤立臓器灌流技術が古典的なモデルとして機能します。神経、内分泌、血行動態などの複雑な生体内干渉を排除することで、薬剤や活性物質が平滑筋緊張に与える影響を直接かつ正確に評価することを可能にする実用的価値を提供します^5,6。

in vitro組織の調製およびデータ記録のための安定かつ信頼性の高いプロトコルを確立することは、再現性が高く高品質な結果を得るために不可欠です。既存のin vitro腸筋実験手法は、実験動物の標準化された管理、組織採取のための綿密な外科技術、灌流システムの一貫した環境制御、標準化された分析と組み合わせた自動データ取得など、いくつかの分野でさらなる最適化と標準化が必要です。例えば、灌流液の温度やpHレベル、組織採取時の機械的損傷、組織のプリロード設定などは、組織の生存率に大きな影響を与え、実験誤差を引き起こす可能性があります。これらの要因は結果の信頼性を損ない、^{異なる研究間の}比較を妨げています^7,8。

したがって、本研究はウサギから分離された十二指腸平滑筋標本を製備し、リアルタイムの緊張記録を行うための標準化されたプロトコルを確立・詳細化することを目指しています。このプロトコルは、実験動物倫理と福祉、無菌開腹術、精密な腸セグメント分離から、環境制御の達成、標準化された張力プリロード設定、統合された水平定温灌流システムおよび多チャネル生理学的信号取得システムを用いた高精度データ取得に至るまで、全プロセスを体系的に記述しています。この標準化された技術的プラットフォームに基づき、累積投与法を用いて、中国薬典(2025年^版)の品質基準を満たす火香正気液体(HXZQ-OL)が、孤立十二指腸平滑筋における自発収縮およびアセチルコリン・バリウム塩化物による破傷風収縮に対する効果を定量的に評価しました。火香正気経口液体(HXZQ-OL)は、古典的な火香正気伝統中国医学の経口用剤であり、中国で消化器疾患に一般的に使用されており、孤立した腸平滑筋への直接的な効果を評価する根拠となっています。本研究は、HXZQ-OLの消化管平滑筋調節効果を明らかにする直接的な実験的薬理学的証拠を提供するだけでなく、実験プロトコルは消化管平滑筋の薬理学的スクリーニングおよび in vitro 組織研究のための標準化され再現性の高い方法論モデルとしても機能します。

プロトコル

この研究では、健康な成体のニュージーランドホワイトラウサギ(体重2.0〜2.5kg)を用いました。すべての動物実験手順は、実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインに従って実施され、成都中医薬大学の実験動物倫理委員会(承認番号:[2026070])によって承認されました。動物の苦しみを最小限に抑え、使用される動物の数を減らすためにあらゆる努力がなされました。ワークフロー図は 図1に示されています。

1. 溶液調製

注意:タイロデ溶液、アセチルコリン(ACh)、塩化バリウム、アトロピン、ベラパミルを含むすべての作動溶液は、実験直前に新鮮に準備しなければなりません。

1. 137 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、1.0 mM MgCl₂、12 mM NaHCO₃、5.6 mM D-グルコースを溶解して1Lのタイロデ溶液を準備します。使用前に、95%のO₂/5%CO₂の混合物で15〜30分間飽和させ、pHを7.3〜7.4に調整します(材料表参照)。
2. 1 mM AChのストック溶液を準備します。20μLを20mLのタイロデ溶液に加えます。十分に混合して1μMのACh溶液を得る。
3. 1 Mの塩化バリウム(BaCl₂)ストック溶液を準備します。20μLを20mLのタイロデ溶液に加えます。十分に混ぜて1 mM BaCl₂溶液を得る。
   注意:BaCl₂は非常に有毒で刺激性が高いです。取り扱い時には、排気フード内で個人用保護具を着用し、規則に従って廃棄液を処分してください。
4. 10 mMの硫酸アトロピンストック溶液を準備します。20μLを20mLのタイロデ溶液に加えます。十分に混ぜて10μMのアトロピン硫酸塩溶液を得ます。
5. 1 mMのベラパミル塩酸塩塩基溶液を準備します。2μLを取り、20mLのタイロデ溶液に加えます。十分に混ぜて0.1 μMのベラパミル塩酸塩溶液を得ます。
   注:調製された溶液の濃度は、先行研究^6、10、11 を参照して決定し、予備実験でさらに最適化して最適な実験条件を確保しました。

2. in vitro ウサギの十二指腸平滑筋標本の調製

1. ウサギの安楽死
   1. ウサギをウサギ拘束装置に固定してください(図2A、Bおよび図3A)。ウサギの耳静脈からナトリウムペントバルビタール(120 mg/kg)を過剰投与して安楽死を行います(図2Cおよび図3B)。
      注意:完全な死亡は以下の基準によって確認されなければなりません:瞳孔開大、瞳孔光反射の欠如、呼吸および心拍の停止、足底反射の喪失。
2. 手術部位の準備と消毒
   1. ウサギを手術台の仰向け状態に固定してください (図2D および 図3C)。外科用ハサミ (図2E) または電動シェーバーを使い、指定された手術部位の皮膚を露出させるために腹部の毛をすべて徹底的に除去します (図3D)。
   2. スポンジピンセット(図2E)を使い、ヨウ素に浸した綿球(図2F,G)を握ります。計画された手術切開の中心から、内側から同心円状に抗菌液を塗布します(図3E)。
      注意:消毒部位は切開の縁を超えて広がり、手術視野の皮膚全体を完全に覆うようにしてください。消毒後は、消毒液が皮膚表面で自然に乾くまで少なくとも3分間待ちます。
   3. 消毒された腹部に無菌のドレープ(図2H)を敷き、手術部位を露出させます(図3F)。
3. 腹部切開の位置と切開
   1. メス(刃#23 )(図2E)を使い、胴骨突起の下から恥骨結合の上へ腹部の正中線に沿って8cm縦切開を行います。
   2. 皮膚と皮下組織を層ごとに剥離します。白線に沿って、腹直筋の前鞘、筋繊維、腹膜を層ごとに剥離して腹腔に入ります(図3G)。
   3. 注意:手術中は腹部臓器を損傷させないようにしつつ、手術部位や腹部臓器への血液汚染を防ぐために止血を必ず行ってください。
4. 十二指腸分離
   1. 切開部に沿って腹腔を開けます(図3H)。湿った生理食塩水ガーゼ(図2I)で肝葉を優しく引き戻し、胃と十二指腸を完全に露出させます(図3I)。
   2. 幽門から2〜3cm離れた十二指腸の初期区画(球根または上下降部)を組織採取部位として選びます。
   3. 注意:機械的損傷を最小限に抑えるため、可能な限り対象の腸セグメントへの直接的な牽引やクランプは避けてください。代わりに、鈍器の鉗子で隣接する腸間膜を優しく掴むか、生理食塩水で湿らせた綿棒で組織を繊細に操作し位置を調整します。
   4. 無菌眼科ハサミ(図2E)を用いて、十二指腸管の1〜2cm(図2J)のセグメントを迅速かつ正確に切除します(図3J,K)。
   5. 直ちに切除した腸区画を培養皿(図2K)に移し、4°Cで事前に冷却されたタイロデ溶液を混合ガス(95% O₂ / 5% CO₂)で連続的に灌流させます。
5. 腸節のトリミング、洗浄、一時保管
   1. 眼用鉗子 (図2E)を用いて、腸壁に付着する腸間膜および周囲の脂肪組織を優しく剥離します。
   2. 冷たいタイロデ溶液を注入した注射器(鈍針 付き)(図2L)を使い、浣腸溶液を優しく腸腔内に注入します。腸の内部をゆっくり2〜3回洗浄して内容物を完全にクリアにします。
   3. 洗浄した腸区画を新鮮な酸素を含んだ冷たいタイロデの溶液に一時保存し、次の実験まで保管します。

3. 水平定温平滑筋実験システムの起動と溶液注入

1. タイロードの溶液をDSQG-1水平恒温平滑筋実験システムの予熱皿に加えます(図4B;材料表参照)。
2. システムの電源を入れ、操作パネルに触れて浴槽温度を37°Cに設定し、予熱を開始します(図4C)。
3. 注入ボタンを押すと、システムが自動的に20mLのタイロード溶液を浴槽に注入します。
4. 排水ボタンを押して、液体を完全に廃棄物収集容器に排出します。
5. すすぎボタンを押すと、システムは自動的に液体を抜き、その後液体を補充する作業を完了します。
6. 停止ボタンを押すと、進行中のすべての注入、排出、洗浄プロセスを即座に終了します。
7. インフレーションボタンを押すと、混合ガス(95% O₂ / 5% CO₂)を浴槽に継続的に注入します。ガス流量をスケール5に調整し、その後の実験組織の酸素供給を確保してください。
   注意:スケール5はガス流量100 mL/minを示します。過剰に高いガス流量は溶液の乱流を引き起こし、張力記録の安定性に影響を及ぼす可能性があります。

4. 多チャンネル生理記録・処理システムをソフトウェア操作と接続する

1. 水平定温平滑筋実験システムのトランスデューサーのデータケーブルを、マルチチャンネル生理記録処理システムのチャンネル1に接続します(図4D)。
2. マルチチャンネル生理記録処理システムの外部電源をオンにしてコンピューターを起動します。デスクトップの 「RM6240XC マルチチャンネル生理学的記録処理システム 」アイコンをダブルクリックすると、実験ソフトウェアシステム( 材料表参照)を起動できます。
3. メニューバーで「実験|」を選択してください。 消化 |対応する実験モジュールに負荷をかける腸平滑筋の生理的特徴 。
4. 以下のパラメータを設定してください:チャンネルモードをテンションに、サンプリング周波数を400Hzに、感度を1.5gに、時定数を直流に、フィルター周波数を30 Hzに設定してください。
5. ソフトウェアインターフェース右上の スタート ボタンをクリックすると、リアルタイムの信号取得と表示を開始します。 録画 ボタンをクリックすると、同時にオシロスコープを表示し、取得した信号をリアルタイムでハードドライブに保存できます。
6. メニューバーで「実験|」を選択してください。 ラピッドゼロング でテンション信号を基準レベルに調整します。
   注意:信号が基準線から2つ以上の垂直座標単位からずれている場合は、ドライバーを使ってテンショントランスデューサーのゼロ点を手動で調整してください。
7. メニューバーで「実験|」を選択してください。 リアルタイムデータ表示方法 |浮遊板。表示されるダイアログボックスで 「通常のリアルタイム測定-高速」を選択し、浮動ウィンドウに腸筋のリアルタイム張力データを表示します。

5. 十二指腸筋ストリップの懸浮およびテンションプレロード設定

1. 組織フックの前後間隔を調整し、水平スクリューノブを十二指腸筋帯の長さに合わせて回転させ、その長さに合わせます。
2. 腸の区画を自然な円筒形のまま維持し、視線を腸内腔の円形断面開口部に合わせます。
3. 眼用鉗子を使い、腸の開口部を優しく引き戻して開通を維持します。
4. 組織フックの先端を優しく腸腔内に差し込みます。
5. 腸縁から2〜3mmの距離で、組織フックの先端を使って上部単層腸壁を内側から外側に貫通します。
   注意:組織フックは筋肉層に貫通し、確実な固定を確保し、表面的な装着だけを防いで、プリロードをかけた際にフックによる機械的な切断や腸壁の裂傷を防ぎます。
6. 腸壁の反対側は最初の側と同じです。平行な対応点を特定した後、その点の単層腸壁のみを貫通します(図3L)。
7. 水平スクリューノブを再度回転させてフックの間隔を調整し、十二指腸筋帯が自然にリラックスした状態を保ちます。
8. 1次元の微調整器を調整して徐々にテンションをかけ、十二指腸筋帯の平均張力が0.8 ± 0.1 gで安定するまで続けます(図4A)。
   注意:腸全体を目視で点検し、腸がまっすぐで円筒形であり、ねじれや回転、渦巻きのひだがないか確認してください。もしそうでなければ、すぐにテンションを下げて片方の取り付けポイントを再調整してください。
9. 実験開始前に、十二指腸筋ストリップを灌流室で60分間平衡させます。この平衡期間中は、自発収縮リズムが安定するまで15〜20分ごとに新しいバッファーに交換します。
   注:60分の平衡期間は、分離された腸区画が少なくとも15分間連続して安定した自発収縮活動を示した場合にのみ完了とみなされました。安定化の客観的基準は定量的に次のように定義されました:(1) < ±5%のベースライン安静張力ドリフト、(2) 連続した5分間の平均収縮振幅の分散< ±10%、(3) 1サイクル/分< ±頻度変動。
10. 十二指腸筋ストリップの自発収縮活動曲線を、後続実験の基準データとして記録してください。

6. 実験的データ取得

1. 進行中の実験については、メニューバーで 「ツール|」を選択してください。分割ビュー は、キャプチャされた波形データに対してリアルタイムの統計解析を行うことができます。
2. 保存されたデータファイルについては、ツールバーの 「開く 」ボタンをクリックし、.lsd拡張子の保存データファイルを選択し、過去の実験記録を読み込みます。
3. ツールバーの 「測定 」アイコンをクリックし、「 リージョン モード」を選択してください。マウスカーソルを波形領域に移動させ、左クリックを長押しして任意の2点を選択すると、システムがそのセグメント内の平均張力値を示すデータパネルを表示します。
4. ツールバーの 「測定 」アイコンをクリックし、「 ピリオド モード」を選択してください。左クリックで、波形に沿って連続した5つの異なる波峰(ピークポイント)をクリックします。マウスを右クリックすると、データパネルが収縮周波数(bpm単位)を計算し表示します (補足図S1参照)。

結果

この実験プロトコルは、分離されたウサギ十二指腸筋ストリップの標準化調製方法と、分離臓器灌流システムを用いてその動的緊張および周波数変化をリアルタイムで記録するプロセスを説明しています。このプロトコルに従い、HXZQ-OLは累積投与により20 mLのタイロデ溶液浴に順次添加され、最終体積は10、20、30、40、50 μL/mLの濃度に達しました。中国薬典(2025年版)の基準を参照すると、これらの濃度はそれぞれ粗薬スライスに6.6、13.2、19.8、26.4、33.0 mg/mLに相当します。テストした最高HXZQ-OL濃度(33.0 mg/mL)では、タイロデ溶液のpH(7.37 ± 0.08)および浸透圧(297 ± 4 mOsm/L)は対照タイロデ溶液(pH 7.38 ± 0.05;浸透圧 295 ± 3 mOsm/L;n = 3つの独立した製剤と同等でした。P > 0.05、学生の t検定)です。これらの結果は、濃度依存的な収縮張力の低下が非特異的なpHや浸透圧の変化に起因しないことを示している(図5A–C)。...

ディスカッション

単離された臓器灌流および緊張記録技術は、平滑筋生理学および薬理学を研究する古典的な手法です。彼らの発見は、消化管運動障害、血管疾患、子宮機能障害の病態生理メカニズムを解明する上で重要な意味を持ちます(12,13,14,15)。標準化されたウサギの体外十二指腸モデルを用いて、本研究はHXZQ-OLが腸平滑筋の集中依存性弛緩を誘発することが示されました。HXZQ-OLはアセチルコリンおよびバリウム塩化物による収縮を抑制するため、この結果はコリン作動性およびカルシウム依存性収縮応答の抑制と一致します16,17,18。しか...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5-10 µL Pipette	大隆実験器材有限公司	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	四川順牛ガラス器材有限公司	B-043804
100 mL Volumetric flask	四川順牛ガラス器材有限公司	B-043807
100-1000 µL Pipette	大隆実験器材有限公司	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	四川順牛ガラス器材有限公司	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	大隆実験器材有限公司	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	上海精密器材有限公司	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	成都器材厂	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	太極集団有限公司	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	成都器材厂	RM6240XC
New Zealand White rabbits	邳州東方育種有限公司（許可証番号：SCXK[蘇]2022-0004）	どちらの性別でも（体重2.0–2.5 kg）
pH meter	上海レイチ	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A