微細藻類オイルは高脂肪食事誘導マウスモデルにおける肝脂代謝の改善

サマリー

代謝機能障害に関連する固点性肝疾患の高脂肪食誘発マウスモデルを用いて、本研究はドコサヘキサエン酸(DHA)を豊富に含む微細藻類オイルの補給効果を評価し、この介入が肝脂質プロファイルを改善し、腸内細菌叢の組成変化と関連していることを示しました。

要約

代謝的には、機能障害性脂肪性肝疾患は腸内細菌叢の乱れや肝脂バランスの乱れに関連する一般的な代謝障害です。本研究では、DHAを豊富に含む微小藻類油の補給効果を評価するために、高脂肪食事誘発マウスモデルが確立されました。マウス(n=4匹)は8週間高脂肪食を与えられ、毎日微細藻類油、プロバイオティクス、またはDHA豊富な微細藻類オイルとプロバイオティクスの組み合わせを経口投与しました。代謝パラメータ、腸内細菌叢の構成(16S rRNAシーケンス)、微生物の機能経路、肝代謝プロファイルを評価した。結果は、DHAを豊富に含む微小藻類油が脂質恒常性を改善し、血清LDL-cおよび肝トリグリセリド値の低下、高密度リポタンパク質(HDL-c)の増加と関連していることを示し、肝障害および酸化ストレスの緩和と関連していることを示しました。マイクロバイオーム解析により、腸内微生物組成に選択的な変化が見られ、 ラクトバチルス や ビフィドバクテリア の濃縮や、 クロストリジウム や ルミノコッカスなどの高脂肪食関連分類群の減少が見られました。機能プロファイリングにより、L-メチオニンサルベージサイクルやフェニルエチルアミン分解を含む微生物代謝経路の変化が示されました。統合マイクロバイオーム–メタボローム解析により、脂肪酸代謝、胆汁酸の回転、アミノ酸経路に関与する微生物分類群と肝臓代謝物との関連がさらに明らかにされました。これらの発見は、DHAを豊富に含む微小藻類オイルの補充が、このモデルにおいて肝脂質代謝および腸内細菌叢の構成の改善と関連していることを示しており、直接的な因果メカニズムを示唆するものではありません。

概要

代謝機能障害関連の脂肪性肝疾患(MASLD)は、世界人口の約32.4%に影響を及ぼす非常に一般的な世界的疾患です^。MASLDは肝臓の過剰な脂肪を特徴とし、これがさまざまな健康問題に寄与します。人間の消化管には、細菌、ウイルス、真菌、寄^生虫など、高度でバランスの取れた微生物群集が含まれています。この微生物群集と肝臓の相互作用により、プロバイオティクスはこの^{重要な結合を}調節することでMASLDの予防および治療に有望な方法と見なされています。新たな研究では、プロバイオティクスが腸内マイクロバイオームを調節し炎症を抑えることでMASLDに良い影響を与える可能性があることが示されています。特に、プロバイオティクスの投与は腸内細菌叢のバランスを回復し、肝炎症を軽減することが示されました^。さらに、特に胆汁酸代謝を促進する可能性のあるプロバイオティクスは、肝脂肪肝を緩和し、MASLD ^5,6に苦しむ人々の全体的な代謝健康を支えることが示されています。さらに、MASLD患者は腸内環境に有意な変化を示すという強い証拠が示されており、これはディス^{バイオシス(}不均衡)として^{知られています。}重要な発見の一つはアルファ多様性の減少であり、これは微生物種の総数と多様性が減少することを意味します。さらに、MASLD患者の腸内細菌叢はしばしばFirmicutes門9,10,11の優性を特徴としています。MASLDの人々は一般的に、飽和脂肪の摂取量が多く、必須微量栄養素の摂取が少ないという不適切な食事を摂っています(^12,13)。都市部でよく観察されるこれらの不健康な食習慣は、農村部に住む人々と比べてフィルミキュートスとバクテロイデテスの比率が高いことと相関しています¹⁴。さらに、高脂肪食はより深刻な腸のバランス崩壊に直接関与していることが示唆されています。具体的には、動物モデルの研究と進行肝疾患患者(MASLD)の研究の両方で、高脂肪摂取が腸内ウイルスの変異と関連していることが示されました。これらの変化には溶解ファージ活性の増加が含まれ、最終的に既存の腸内細菌叢異常を悪化させました^15,16。

魚油に一般的に含まれるオメガ3多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、脂質代謝を促進し腸内細菌叢の調節に役立つ可能性があります。微小藻類オイルは、有望で持続可能なオメガ3PUFAの供給源として浮上しています。具体的には、純粋なドコサヘキサエン酸(DHA)を高濃度含むシ ゾキトリウム 微藻油は有望な商業供給源です。このグループの先行研究では、高脂肪食(HFD)誘発肥満マウスモデルにおいて、微細藻類油の減量促進効果は魚油や減量薬オルリスタットと同等であることが報告されています。重要なのは、微藻油が魚油やオルリスタット¹⁷よりも早くこれらの減量効果を示したことです。以前の研究では、微小藻油が市販の魚油やオルリスタットと比べて腸内細菌叢に明確かつ有益な効果を及ぼすことも示されました。微細藻類油は細菌全体の多様性を著しく変化させませんでしたが、有益な短鎖脂肪酸(SCFA)産生細菌の増加と、肥満に関連する デスルフォビブリオ属を含む病原性分類群の減少と関連していました。さらに、微小藻油は腸内細菌叢の代謝能力を驚くほど回復させ、アミノ酸、SCFA、胆汁酸代謝に関連する経路を強化し、リポ多糖(LPS)の生合成を決定的に低下させました。これらの調節は脂質代謝の改善と大腸粘膜関門の強化に寄与している可能性が高く、微細藻類油が肥満緩和に優れた栄養補助剤であったことを示唆しています¹⁷。

腸内細菌叢の不全とMASLDの発症との関連が進展しているものの、微生物組成、微生物代謝機能、肝脂質代謝の特異的な関係は完全には解明されていません。特に、微生物叢の変化と疾患進行との因果関係は依然として不明であり、DHAを豊富に含む微小藻類オイルのような食事療法が腸内微生物群集や宿主代謝プロファイルの協調的な変化と関連しているかどうかは体系的に調査されていません。DHAを豊富に含む微小藻類油は、魚由来のサプリメントに匹敵するDHA豊富な微細藻類油の含有量を持ち、持続可能かつ効率的なオメガ3脂肪酸の供給源です。過去の研究では、DHAを豊富に含む微小藻類オイルの補給が肝脂肪症や代謝パラメータを改善する可能性が示唆されています^18,19。しかし、MASLDの文脈における腸内細菌叢の構成および微生物代謝機能との関連は依然として明確ではありません。

したがって、本研究では高脂肪食事誘導マウスモデルを用いて、DHAを豊富に含む微小藻類オイルの補給が代謝パラメータ、腸内微生物叢の構成、肝臓代謝プロファイルに与える影響を評価しました。DHAを豊富に含む微小藻類オイルの補給は、肝脂質代謝の改善と、腸内細菌叢の構成および微生物代謝経路の変化を同時に変化させることと関連していると仮説が立てられました。

プロトコル

このプロトコルで使用されるすべての動物、食事、試薬、キット、計測器、ソフトウェア、サービス提供者の詳細は 材料表に記載されています。すべての動物実験は国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと利用に関するガイドラインに従って実施され、山東省立病院の実験動物委員会から承認を受けました(倫理承認番号2022–007、2022年1月24日承認)。

注意:動物の血液、糞便サンプル、組織は、潜在的に生物的危険物質として取り扱うべきです。生きた動物、生物サンプル、鋭利器、有機溶剤、化学アッセイ試薬を扱うすべての手順は、機関のバイオセーフティ、動物ケア、化学物質安全規則に従って実施されるべきです。動物の死骸、組織、血液汚染物質、糞便サンプルは指定されたバイオハザード廃棄物容器に収集され、施設内の動物施設またはバイオセーフティオフィスを通じて処分されるべきです。針、ガベージ針、毛細血管管、その他の鋭利品は、使用後すぐに認可された鋭利器容器に捨ててください。メタノール、アセトニトリル、蟻酸を含む有機溶媒廃棄物は、ラベル付きの化学廃棄物容器に収集され、機関の有害化学廃棄物プログラムを通じて処分されるべきです。生化学的および酸化ストレスアッセイによる廃棄物は、製造者の安全データシートおよび機関の化学物質安全規則に従って収集・処分されるべきです。

実験動物

生後6週間のオスのC57BL/6Jマウス(n=4匹)は、特定の病原体なし(SPF)条件下で、22±2°C、相対湿度50–60%の12時間の明暗サイクルで維持されました。動物は自由に食べ物と水を得ることができ、ケージにつき最大5匹のネズミが飼われていました。対照マウスには、炭水化物70%、タンパク質20%、脂肪10%(kcal)からなる標準的なチャウダイエットが与えられました。MASLDマウスモデルを確立するために、マウスに8週間にわたり炭水化物20%、タンパク質20%、脂肪60%(kcal)を含む高脂肪食を与えました。すべての食事は4°Cで保存され、週に2回補充されました。マウスは乱数生成器を用いて実験群にランダムに割り当てられ、サンプル数(n=4)は、類似の高脂肪食事誘導マウスモデルを用いた研究と予備実験に基づいて決定されました。すべての治療は概日リズムの変動を最小限に抑えるため、毎日同じ時間に実施されました。

微細藻油は山東省農業科学院によって約99%の純度で抽出・精製されました。微細藻類油は光から保護され、−30°Cで保存されました。投与前に油は乳化剤で準備され、均一になるように十分に混ざり合いました。具体的には、DHAを豊富に含む微小藻油を、0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウムに乳化し、0.5%トゥイーン-80を生理食塩水に含みました。微細藻類油と乳化器は1:9(v/v)の比率で混合され、ガベージ直前に2分間渦を巻き起こして均一な懸濁液を得ました。微細藻類油処理群のマウスは、1日1回、無菌給餌針を用いて10 μL/g体重で経口漏水法を投与しました。ガベージ量は体重に応じて毎日調整され、用量の一貫性を確保しました。対照群のマウスも同じ条件下で同等量の無菌生理食塩水を受け取りました。使用された生理食塩水は0.9%塩化ナトリウム注射でした。

プロバイオティクス治療は、 Lactobacillus plantarum (DY-1)、 Lactobacillus acidophilus (KDB-03)、 Lactobacillus casei (KDB-LC)、および Bacillus coagulans (GIM 1.645)を含む複合製剤で構成されていました。4株は1:1:1:1の等しい生存細胞比で混合されました。各株は最終製剤に2.5 × 10⁷ CFU/mLを供給し、総細菌濃度は1 × 10⁸ CFU/mLとなりました。このプロバイオティクス混合物は山東農科学院によって合成されており、市販されていません。プロバイオティクス治療は、 Lactobacillus plantarum DY-1、 Lactobacillus acidophilus KDB-03、 Lactobacillus casei KDB-LC、 Bacillus coagulans GIM 1.645を含む複合プロバイオティクス発酵ブロスで構成されていました。製剤の細菌濃度は1 × 10⁸ CFU/mLでした。プロバイオティクス発酵ブロスは使用前に4°Cで保存されました。プロバイオティクス処理群のマウスは、実験期間中、1日1回、体重体重あたり0.01 mLの経口ガベージ投与でプロバイオティクス製剤を投与しました。

個々の株は適切な条件下で培養され、中期ログ成長段階(OD₆₀₀ ≈ 0.6)で収穫され、示された比率で結合されました。細菌培養を遠心分離して上清液を除去し、ペレットは無菌リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)に再懸浮させられました。新たに調製された細菌懸濁液は、投与前に氷で保管され、生存可能性を保ちました。投与前に最終的な細菌濃度を1 × 10⁸ CFU/mLに調整しました。プロバイオティクス群のマウスは、実験期間中、体重体重0.01mLの用量を経口ガベージで1日1回投与しました。プロバイオティクス投与前に抗生物質の前処理は行われていませんでした。実験バイアスを減らすため、該当する場合は盲検研究者によるアウトカム評価が行われました。MASLDは血液生化学的分析によって確認されました。

血液分析

実験期間終了時には、マウスは一晩(12時間)断食させ、水を自由に利用してから血糖測定と末期採血を行いました。マウスは麻酔用ヴェポライザーを使ってイソフルランで深く麻酔され、足筋反射の喪失が確認されました。末期血液サンプルは眼窩後出血で採取されました。採血後、マウスは深麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させられ、呼吸と心拍の停止により死亡が確認されました。血液は室温で凝固させ、その後3,000× g で10分間遠心分離して血清を得ました。血清サンプルは分割され、−80°Cで保存され、分析後に保管されました。血清グルコース、総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-c)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-c)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)は、製造元の指示に従い自動生化学分析装置を用いて測定されました。これらのパラメータは、標準試薬キットを分析システムに統合した酵素比色アッセイを用いて定量化しました。すべての生化学的パラメータは血清体積に正規化され、製造元が指定した単位で表現されました。

酸化ストレスアッセイ

酸化ストレスバイオマーカーは、マロンジアルデヒド、スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼなどのキットを用いて測定されました。検査は製造元の指示に従って行われました。簡単に言えば、肝組織は氷冷バッファーで均質化され、遠心分離して分析用の上清液を得ました。マロンジアルデヒド(MDA)レベルはチオバルビツル酸反応性物質(TBARS)アッセイを用いて測定されました。超酸化物ディスミュターゼ(SOD)活性は、超酸化物媒介反応を阻害する能力で測定されました。また、過酸化水素の分解速度を監視することでカタラーゼ(CAT)活性を定量化しました。測定はマイクロプレートリーダーを用いて行われ、値は標準曲線やキットに付属した式を用いて算出されました。酸化ストレスマーカーは肝組織の重量に正規化され、製造元の仕様に従って表現されました。

16S rRNAシーケンスおよびマイクロバイオーム解析

実験期間終了時に個別マウスから直接糞便サンプルを無菌条件下で採取し、すぐに液体窒素で凍結し、DNA抽出まで−80°Cで保存しました。微生物DNAは製造元のプロトコルに従い、市販キットで抽出されました。細菌の16S rRNA遺伝子のV3–V4領域はプライマー341F/806Rを用いて増幅されました。PCR増幅は、テンプレートDNA、2×PCRマスターミックス、各プライマー0.2μMを含む25μL反応系で行われました。増幅プログラムは、95°Cで3分間の初期変性、その後95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで45秒の25サイクル、最後に72°Cで10分間の延長を行っていました。Ampliconライブラリは、商用シーケンシングサービスプロバイダーによってIllumina MiSeqプラットフォーム上でペアエンドの2×250 bp戦略で構築・シーケンスされました。シーケンス前にライブラリの品質が評価され、メーカー推奨のクラスター密度でプールライブラリが読み込まれました。ベースが曖昧で、長さが不十分で、平均品質スコアがQ20未満の低品質リードは、下流解析前に除去されました。

生のシーケンスリードはQIIME 2バージョン2019.4²⁰を用いて処理されました。簡単に言えば、ペアエンドリードはDADA2を用いてデ多重化、品質フィルタリング、ノイズ除去、マージ、キメラフィルタリングを行い、特に指定がない限りデフォルトパラメータで処理されました。非単一アンプリコン配列変異体(ASV)は後流解析のために保持されました。分類学的割り当ては、QIIME2²¹で実装されたGreengenesデータベースバージョン13_8を使用して行われました。特にGreengenesデータベースを使用する場合、16S rRNA遺伝子配列解析の本質的な解像度制限を考慮すると、分類学的注釈は属レベルでのみ解釈されていました。種レベルの分類は信頼性が低いとみなされ、したがって下流の分析、統計的比較、生物学的解釈には使用されませんでした。すべての微生物の特徴は、可視化および解析前に属レベルに収束されていました。

アルファ多様性指標(Chao1、観察種、シャノン、シンプソン、フェイスのPD、ピエルーの偶数度)が用いられました。グループ間のアルファ多様性の統計的比較は、適切な非パラメータ検定(例:Kruskal–Wallis検定)を用いて行われました。ジャカード距離とブレイ・カーティス不相似性がベータ多様性指標として用いられました。主座標解析(PCoA)プロット、非計量多次元スケーリング(NMDS)、線形判別解析効果サイズ(LEfSe)を用いてマイクロバイオーム群落の変化を示し、LDAスコアの閾値は2.0でした。ベータ多様性における統計的有意性を評価するために、置換多変量分散解析(PERMANOVA)を用いました。データ可視化および統計解析はGenesCloudプラットフォーム(https://www.genescloud.cn)を用いて実施されました。

微生物の機能プロファイルは、ショットガンメタゲノムやトランスクリプトミックシーケンスによる直接測定ではなく、16S rRNAシーケンシングデータから推定されました。正規化経路または官能基存在比表に基づき、予測された機能単位はKEGG、MetaCyc、COGなどの一般的なデータベースにマッピングされました。KEGG経路の存在比は階層的機能カテゴリごとに要約され、下流比較にはレベル2経路分類が用いられました。各経路カテゴリの平均存在比はRソフトウェアを用いて算出されました。

肝臓サンプルの非標的メタボロミクス解析

死亡確認直後に肝組織を迅速に切除し、すぐに液体窒素で凍結し、分析前に−80°Cで保存されました。約50mgの凍結肝組織を氷のように冷たいメタノール水(4:1、v/v)で均質化し、内部標準物質を補いました。組織と抽出溶媒の比率は1:10(w/v)でした。サンプルは1分間渦巻き、氷上で10分間超音波処理、さらに−20°Cで30分間培養されてタンパク質沈殿を改善しました。ホモジネートは徹底的に混合され、氷上で超音波処理を受け、12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離されました。 上澄液は慎重に採取され、穏やかな窒素流下で蒸発され、50%メタノールで再構成されて後続分析が行われました。

品質管理(QC)サンプルは各サンプルから等量のサンプルをプールして生成され、分析安定性と再現性を評価するためにラン中に断続的に分析されました。非標的メタボロミクス解析は、商業サービス提供者が運用する超高性能液体クロマトグラフィーシステムと高分解能質量分析法を組み合わせて実施されました。代謝物は逆相C18カラム上で、0.1%の蟻酸を含む水と0.1%のアセトニトリルからなる二元溶媒系を用いて分離されました。注入容量は2μLで、カラム温度は40°C、流量は0.30 mL/minに設定されていました。広範な代謝物分離を達成するために勾配洗脱プログラムが用いられました。質量分析検出は、m/z範囲70〜1,000で正および負の電気噴霧イオン化モードの両方で行われ、広範な代謝物カバレッジを実現しました。イオンスプレー電圧は正モードで3.5 kV、負モードで−2.5 kVに設定されていました。毛細血管温度は320°Cに維持され、データは全スキャンMSモードで取得され、代謝物注釈のためのデータ依存MS/MS取得が行われました。生データは専用のメタボロミクスソフトウェア(MassLynx v4.1)を用いて特徴検出、アラインメント、正規化処理を行いました。代謝物の同定は、ヒトメタボロームデータベース(HMDB)や京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)(v2023)などの公開データベースと比較し、正確な質量、保持時間、MS/MS断片化パターンに基づいて実施されました。

多変量および経路解析

処理されたメタボロミクスデータは、主成分解析(PCA)や偏最小二乗判別解析(PLS-DA)を含む多変量統計解析を受け、実験群間の代謝差異を可視化しました。差異代謝物は、予測(VIP)スコアにおける変数重要度(>1.0)と統計的有意性(p < 0.05)の組み合わせに基づいて同定されました。同定された代謝物は、KEGG経路濃縮解析を用いて代謝経路にマッピングされ、DHA豊富な微小藻類油の補給に関連する生物学的プロセスを明らかにしました。

統計解析

データはSEM±平均として提示され、一方移動分散解析(ANOVA)を用いて解析し、その後Tukeyの多重比較検定を用いました。統計的有意性はp < 0.05と定義されました。肝代謝物の濃縮解析はR(バージョン4.4.1)を用いて実施されました。微生物属と肝臓代謝物のペアワイズ関連をスピアマンランク相関を用いて解析しました。|ρ| と の有意な相関(偽発見率、FDR < 0.05)のみが存在します。統合ネットワーク解析には≥0.6が含まれました。マイクロバイオームおよびメタボロミクスのデータ処理は、上記の通りに行われ、GenesCloudプラットフォームの利用や品質管理手順も含まれていました。

結果

DHAを豊富に含む微小藻類オイルは、HFD誘発性MASLDマウスにおける脂質代謝、肝障害、肝酸化ストレスを改善します

栄養補助食品がグルコースおよび脂質恒常性に与える影響を評価するために、生化学的パラメータを5つのグループで評価しました:通常の食事(RC)、高脂肪食(HFD)、DHA豊富な微小藻類オイル補助、プロバイオティクス補助、およびDHA豊富な微小藻類オイル+プロバイオティクス補充マウスの複合群。本研究の主な目的がDHAを豊富に含む微小藻類油の効果を評価することであったため、DHAを豊富に処理した微小藻類オイル処理群が主な介入群とみなされ、プロバイオティクスおよび併用治療群はプロバイオティクス単独および補完効果の可能性を評価する比較介入として含まれました。 図1Aに示されているように、HFD摂食はMASLDの代謝特性を成功裏に誘発し、RC群と比較して空腹時血糖値が有意に上昇していることが示されており(p < 0.00...

ディスカッション

近年、MASLDに関連するマイクロバイオームの変化を調査するいくつかの研究が行われています。しかし、これらの研究の多くは、健康な個人とMASLD患者の比較や、異なるステアトーシスグレードの比較に焦点を当て^{ています。}したがって、MASLDにおける肝線維症に関連する特定の腸内細菌群の変化に関する証拠は依然として限られており、線維化は患者の転帰予測において最も重要な要素であるにもかかわらず、依然として限られています。本研究では、DHAを豊富に含む微小藻類オイルが主にHFD誘発性MASLDマウスにおいて、グルコース調節よりも脂質代謝を促進したことを示しました。この効果には肝障害や酸化ストレスの減少、 ラクトバチルス や ビフィドバクテリウムmなどの有益な分類群の選択的富集、そして クロストリジウム や ルミノコッカスを含むHFD関連分類群の個体数減少が伴いました。さらに、組織病理学的解析もこれらの結果を裏付けており、Oil Red O染色では肝脂の蓄積が減少し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2倍PCRマスターミックス	タカラバイオ株式会社、日本	RR902A	16S rRNA PCR増幅に使用
アセトニトリル	メルク、ドイツ	100030	UHPLC移動相に使用する溶媒
麻酔用ヴェポライザー	RWDライフサイエンス	R580	マウスへのイソフルラン麻酔投与に使用されました
自動生化学分析機	建成生物工学研究所、南京、中国	A110-1 &A111-1	血清パラメータ(血糖値、TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT)および肝脂レベルを測定します
バチルス・コアグラン(GIM 1.645)	中国広東省微生物培養コレクションセンター	GIM 1.645	プロバイオティクス製剤の成分株
カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)	シグマ・オルドリッチ、アメリカ	C4888	DHAを豊富に含む微細藻類油の乳化剤成分として使用
カタラーゼ(CAT)アッセイキット	南京建設有限公司	A007-1-1	肝組織における抗酸化能力の指標であるCAT活性を検出します
DADA2ソフトウェアパッケージ	DADA2開発チーム	QIIME 2 v2019.4に収録	シーケンスリードのノイズ除去およびキメラフィルタリングに使用されます
DHAを豊富に含む微小藻類油(Schizochytrium属由来)	-	-	ドコサヘキサエン酸(DHA)が豊富です。10µで毎日GAVAGE投与;L/gを実験的介入として
実験動物(オスのC57BL/6Jマウス)	北京ビタルリバー実験動物技術株式会社	-	生後6週、グループあたりn=4匹;HFDフィーディングによるMASLDモデルの確立に使用されます
蟻酸	シグマ・オルドリッチ、アメリカ	F0507	メタボロミクス解析のための移動相加法
グリーンジーンズデータベース	グリーンジーンズ	バージョン13_8	微生物分類学の割り当てに用いられる
高脂肪ダイエット(HFD)	リサーチ・ダイエッツ社、アメリカ	D12492	炭水化物20%、タンパク質20%、脂肪60%(kcal)で構成されています。MASLDを誘発するために8週間栄養を投与
高分解能質量分析計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	Q エクスアクティブ・オービトラップ	正イオンモードおよびマイナスイオンモードで代謝物検出に使用されます
ヒトメタボロームデータベース(HMDB)	カナダ・アルバータ大学	2024年発売	公開代謝物注釈データベース
イルミナMiSeqプラットフォーム	イルミナ社、アメリカ	MiSeqシステム	ペアエンド2&時間に使用;250 bp シーケンス
イソフルラン	メルク、ドイツ	PHR2874	マウスの吸入麻酔に使用
京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)	金久研究所、日本	2023年版	経路濃縮および代謝物注釈に使用されるデータベース
ラクトバチルス・アシドフィルス(KDB-03)	中国山東農科学院	-	プロバイオティクス製剤の成分株
ラクトバチルス・カセイ(KDB-LC)	中国山東農科学院	-	プロバイオティクス製剤の成分株
ラクトバチルス・プラント(DY-1)	中国山東農科学院	-	プロバイオティクス製剤の成分株
液体窒素	エアリキッド	-	糞便および肝臓検体の急速凍結および保存に使用されます
マロンジアルデヒド(MDA)検査キット	南京建設有限公司	A003-1	肝組織中のMDA(脂質過酸化・酸化損傷のマーカー)を検出します
MassLynxソフトウェア	ウォーターズ・コーポレーション、アメリカ	バージョン4.1	メタボロミクスの生データ処理、特徴抽出、正規化に使用
メタノール	メルク、ドイツ	106035	代謝物抽出に用いられる溶媒
マイクロバイオームデータ解析プラットフォーム	ジェネスクラウド	V1	OMEGA土壌DNAキット	オメガ・バイオテック、ジョージア州ノークロス、アメリカ)	(M5635-02)	DNA分離
OTUの参照シーケンス	ジェネスクラウド		McDonaldら 2012年からの引用;アンプリコン配列変異株(ASV)の分類学的割り当てに使用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Gibco、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	10010023	細菌ペレットの再懸濁に使用
プライマー341F/806R	青科バイオテクノロジー有限公司、中国	-	16S rRNA V3&ndashの増幅に使用;V4領域。341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′;806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′
プロバイオティクス	-	-	具体的な株は明示的に言及されていません。比較介入として使用(主にグルコース恒常性の改善)
QIIME 2ソフトウェア	-	2019.4	マイクロバイオームバイオインフォマティクス解析(ASV処理、アルファ/ベータ多様性計算)に使用
Rソフトウェア	-	4.4.1	肝代謝物濃縮解析および微生物-代謝物関連のスピアマン相関解析に使用
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ、ドイツ	5810R	血清および代謝学サンプル遠心分離に使用
逆相C18カラム	ウォーターズ・コーポレーション、アメリカ	186002350	代謝物のクロマトグラフィー分離に使用
生理食塩水	石家荘第4製薬	2211112304	対照群には毎日ガベージで投与(微小藻類オイル処理と比較)
標準的なチャウダイエット	カオ・シエリ・フィード株式会社、中国	1016706714625204224	炭水化物70%、タンパク質20%、脂肪10%(kcal)で構成されています。制御(RC)グループに送られます
滅菌給餌針	インステック研究所、アメリカ	FTP-20-38	経口ガヴェージ投与に使用
超酸化物ディスミュターゼ(SOD)アッセイキット	南京建設有限公司	A001-3	肝組織内のSOD活性(抗酸化能力の指標)を検出します
トゥイーン80	シグマ・オルドリッチ、アメリカ	P4780	DHAを豊富に含む微細藻類油の乳化剤成分として使用
超音波ホモジナイザー	サイエンツ・バイオテクノロジー、中国	JY92-IIN	代謝物抽出中の肝組織超音波検査に使用
非標的肝代謝学	メタボプロファイルバイオテクノロジー(上海)有限公司	プロジェクトコード:P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH
ボルテックスミキサー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	LPボルテックスミキサー	試料均質化および乳化に使用