多能性幹細胞を原始的な生殖細胞様細胞に分化するためのプロトコル

サマリー

基底膜エキスを重ねた2次元単層法を用いて、ヒト誘導多能性幹細胞から原初生殖細胞様細胞を堅牢な方法で生成するための段階的なガイドライン。

要約

ヒト多能性幹細胞の分化をin vitro で利用することで、 初期発生時に起こる系統指定イベントの理解が大きく広がりました。この期間は非常に調査が困難です。ヒト胚で最初に特定された胚系統の一つが生殖細胞系統であり、原始生殖細胞(PGC)の誘導によって特徴づけられます。PGCは後期の配偶子の唯一の創始集団であり、その仕様は生物の生殖能力への重要な第一歩となります。ここでは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)からPGC様細胞(PGCLCs)を生成する堅牢なプロトコルを記述し、hiPSCの多能性状態と細胞特性の初期評価から始め、効果的なPGCLC分化を確保することから始めます。このため、PGCLC分化に用いられる異なる細胞密度、プレートコーティング、hiPSCの影響について論じます。最後に、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いたhPGCLCsの特性評価および定量のワークフローが提供されます。この区分プロトコルは、ほとんどの検査室で容易に確立・検査でき、必要に応じて調整可能な状態に焦点を当てています。さらに、このプロトコルは高速であり、hiPSCがPGCLC分化に適しているかどうかを判断できます。このプロトコルは、異なるhiPSC系統や培養プラットフォーム間でのhPGCLCアウトカムの一貫性と適合性を促進し、信頼性の高い特性解析を支える堅牢な収量を確保し、ヒトにおけるin vitro 配偶子形成の成功に向けた下流の分化ステップのさらなる最適化を目指しています。

概要

ヒトの生殖細胞の発生は、胚発生の初期段階から始まる高度に協調されたプロセスであり、最終的に卵母細胞や精子細胞を生み出す原始生殖細胞(PGC)の指定から始まります^1。生体内では、PGCの指定は着床直後に隣接細胞^4,5からの誘導信号に応答して起こります。PGCの発生は齧歯類において広く研究されており、特にBMP、WNT、TGFβ 6,7,8,9などのシグナル伝達経路の関与を示す遺伝的研究が示されています。仕様化後、PGCはエピジェネティックな再プログラミングを受け、ゲノム全体のDNA脱メチル化とクロマチンリモデリングを特徴とし、その後(性特異的)生殖細胞同性10,11,12,13,14が確立されます。

哺乳類では、PGCの指定はシグナル伝達経路間の協調的なクロストークによって駆動され、POU5F1やNANOG ^{9,15,16,17,18}などの多能性因子の関与など、ヒト、非ヒト霊長類、豚、マウスの間で進化的に保存される側面もあります.共通の特徴にもかかわらず、PGCの分化機構や遺伝子調節ネットワークにおける種特異的な違いが、動物モデルからヒトへの直接翻訳を制限しています(9,19,20,21)。

ヒトにおける配偶子形成を理解するにはヒト材料を用いた研究が必要ですが、初期ヒト胚へのアクセスが限られているため依然として困難です。誘導多能性幹細胞(hiPSCs)など、ヒト多能性幹細胞からヒト原始生殖細胞様細胞(hPGCLCs)をin vitro分化を可能にするプロトコルの継続的な進歩により、ヒト性腺組織への依存が減少し、アップスケーリングや遺伝学的研究が可能になりました^18,22。hPGCLCの分化に関する確立された戦略の多くは、三次元(3D)集合体や胚体に依存しています¹⁸。これらのプラットフォームを用いる複数の研究で、hPGCLCは生殖細胞転写プログラム^23,24やゲノム全体のDNAメチル化再プログラミング²⁵を含む初期ヒトPGCの主要なエピジェネティック特徴を再再現することが示されています。これらのin vitroプラットフォームは、系統のコミットメントやエピジェネティックリセットを含むヒトPGC生物学の高度な知識を持っています。しかし、集約ベースのhPGCLC分化プロトコルは時間がかかるため依然として困難であり、堅牢なエピジェネティック特性解析、さらなる分化アッセイ、または高スループット実験用途でのhPGCLCの総収量は低いままです。

最近では、希釈基底膜抽出物(BMEx)と低レベルのBMP4を組み合わせてhiPSCをhPGCLCsに分化する2D単層フィーダーフリー法が、組織培養プレート上で比較的容易にスケールアップでき、短時間(5日間)で高い効率(~55%)を達成しました²⁶。誘導前に中間のアクティビンAプライミングステップが必要で、より高いBMP4濃度(40–50 ng/^mL)を用いた他の2Dシステムと比^べて、このBMExアプローチは導入前のステップを必要とせず、より低いBMP4レベル(10 ng/mL)を使用しつつ、同等の効率と向上したスケーラビリティを維持しました。

ここでは、hiPSC維持の初期評価(多能性や細胞特性を含む)から始まり、異なるhiPSCプレートコーティングや細胞密度がhPGCLC分化に与える影響を検証する詳細なステップバイステップガイドを提供します。また、フローサイトメトリー解析や免疫蛍光による下流特性評価も記述しています。重要な取り扱いポイントやトラブルシューティングのガイダンスを提供し、実験室の偏差を減らすための助言を提供し、研究者はこの2D形式でhPGCLCの分化を一貫して再現できます。

プロトコル

このプロトコルは、ライデン大学医療センター(LUMC)、LUMCバイオバンク&バイオマテリアル(TCBio)、およびLUMCライデンhiPSCセンター(BB24.037の下で)のガイドラインと規則に従っています。このプロトコルで使用されるすべての材料および対照オス(XY)hiPSCライン(M54およびM199)は、 材料表に記載されています。すべての組織培養手技は、専用のバイオセーフティレベル2組織培養室で行われ、加湿されたノールキシックインキュベーター(37°C、5%_CO2)、多目的ベンチトップ遠心分離機(スイングバケットローター)、および立体顕微鏡を備えたクラスIIバイオセーフティキャビネットが設置されました。

注意:すべてのhiPSC系統がhPGCLCs26,29に分化できるわけではありません。しかし、他のhiPSCをPGCLC分化に用い、PGCLCが観察された場合、ここで説明した方法(図1A)によりhPGCLC産生のスケールアップが可能になります。

1. hiPSC培養用の組織培養プレートのコーティング

このプロトコルは、希釈したBMExとビトロネクチンの両方を組織培養プレートにコーティングする方法を説明しています。

1. 基底膜エキス(BMEx)コーティング
   1. 氷で溶けたBMExのアリコートを。それはGeltrex、Cultrex、またはMatrigelのいずれかです。
   2. 基底膜抽出物のアリコートを冷たいDMEM/F12で希釈し、最終濃度1%(v/v)にし、優しく再懸浮させます。
   3. 6ウェルプレートの希望の数のウェルに、1ウェルあたり1mLの希釈済みBMExを被覆します。
   4. 被覆されたプレートを37°Cで少なくとも30分間孵化させます。
      注:コーティングされたプレートは2〜8°Cで最大1週間保存可能です。2〜8°Cで保存されたコーティングプレートを使用する場合は、使用前に37°Cで少なくとも10分間培養してください。
2. ビトロネクチンコーティング
   1. ビトロネクチンのアリコートを室温(RT)で10〜15分間解凍します。
   2. ビトロネクチンをカルシウムとマグネシウムなしのDPBSで最終濃度5 μg/mLに希釈し、穏やかに再懸濁します。
   3. 6ウェルプレートの希望するウェル数に希釈したビトロネクチン1mLを1枚のウェルにコーティングします。
   4. コーティングされた6ウェルプレートをRTで1時間培養します。

2. hiPSCの維持のための通過

1. 培養培地の準備:血清フリー細胞培養培地mTeSR Plusに、マイコプラズマ汚染防止液(MycoZap(1:1000))を補足します。
2. 排出準備が整った細胞から培養培地を吸引します。
3. 各ウェルに0.5mLのヒトPSC選択およびパッサージ剤(ReLeSR)を加え、1分以内に吸引します。細胞には非常に薄い層を残してください。
4. 細胞を37°Cで6分間培養します。
5. 6ウェルプレートの側面を数回叩いてみてください。
6. p1000ピペットでピペットを上下に動かして1mLの培地で細胞を慎重に剥離し、コロニー断片のサイズを定期的にチェックして50〜200μmの範囲に保つようにしてください。
7. あらかじめコーティングされた6ウェルプレートを取り出し、コーティング液を除去します(ステップ1)。
8. 各ウェルに2mLの培地を加えます。
9. 分離したhiPSCコロニー断片を含む培養培地を所定の比率で新しい井戸に移します。
   注:hiPSCコロニー断片の理想的な分割比率は1:6〜1:50であり、4〜7日ごとに通過が可能です。
10. 通過したhiPSCコロニー断片とともに細胞培養プレートを加湿したノールモキシックインキュベーター(37°C、5%_CO2)に入れます。
11. hiPSCが再び通過できるまで、2mLの培地で隔日培養液を補充してください。
    注意:週末にリフレッシュする必要を避けるため、6ウェルごとに2mLではなく4mLの培地を加えてください。
    注意:コンフルンスが低すぎる場合はhiPSCを通過させず、健康なhiPSC培養を維持し自発分化を避けるためにコンフルンスが高すぎる場合は培養を廃棄してください。

3. hPGCLCの分化

1. hPGCLC分化前の準備(0日目)。
   1. hPGCLC分化を始める1時間前にhiPScの培養培地を更新してください。
   2. コーティング溶液を準備します:1% BMEx溶液を冷たいDMEM/F12で希釈しました。
   3. 12ウェル板の所定のウェル数を0.5mLのコーティング溶液でコーティングします。
   4. 分化を始める前に、被覆されたプレートを37°Cで少なくとも30分間キュベートしてください。
   5. 培地を準備します:2%(v/v)のBMEx溶液をコールドカルチャー培地に溶かし、解凍後回収培地(RevitaCell)(1:100)を補足します。
      注意:hiPSCの準備およびプレート付け中は培地を氷上に保管してください。
2. hPGCLC分化のためのhiPSCsプレート(0日目)。
   1. hiPSCを含む6ウェルから培養培地を取り出し、hPGCLCの分化に使用します。50〜80%の合流率で高品質なhiPSCから始め、自然分化の兆候はありません。
   2. 1ウェルごとに1mLのトリプシン溶液(TrypLE)を加えます。
   3. hiPSCを37°Cで5分間培養します。
   4. p1000ピペットでhiPSCコロニーを2〜3回慎重に再懸浮させて単細胞懸濁液を作ります。
   5. 逆立顕微鏡で単細胞懸濁液が得られるかどうかを確認しましょう。もしそうでなければ、p1000ピペットでhiPSCコロニーをさらに1〜2回再懸垂します。
   6. hiPSC細胞懸濁液を15mLチューブに移します。
   7. 15mLチューブに4 mLのDMEM-F12培地を加えます。
   8. hiPSCセル懸浮液を200 x g で5分間遠心分離します。
   9. 上澄液を吸引し、hiPSC細胞を0.5〜1.0mLのプレート培地に慎重に再懸濁させます。
   10. 細胞カウンターやヘモサイトメーターを用いてhiPSCの数を数え、hPGCLC分化に必要なhiPSCの数を1ウェルあたり計算します。
       注:出発点として、40〜80Kセル/cm^² のメッキ密度を利用できます。しかし、各細胞株および各パスジェンド数において、最適な収量を得るためにプレート密度の最適化が推奨されます。ここでは、hiPSCを10Kから100Kセル/cm^²のメッキ密度でメッキリングしました。
   11. 適切な容量のメッキ(12ウェルプレートのウェルごとに1mL)に必要な数のhiPSCを慎重に再懸濁し、p1000ピペットを使って均一な細胞懸濁液を得るようにしてください。
   12. インキュベーターからコーティングされた12ウェルプレートを取り出し、コーティング液を除去します。
   13. 12ウェルプレートの各ウェルに1mLの細胞懸濁液を加えます。
   14. セルがウェル内で均等に分布しているか確認するために、プレートを慎重に振ってください。
   15. 12ウェルのプレートを加湿したノールキシックインキュベーター(37°C、5%_CO2)に16〜24時間置きます。
3. hPGCLCの差別化(1〜2日目)
   1. RB27基礎培地を準備します:B-27(1:100)、アミノ酸置換品1個(グルタマックス)、MEM非必須アミノ酸1個、マイコプラズマ汚染防止溶液(1:1000)を用いる高度なRPMI160。
   2. 分化培地を準備します:2%(v/v)のBMEx溶液を冷たいRB27基礎培地に浸し、最終濃度10 ng/mLにBMP4を加えます。基底膜抽出物は、腔形成を誘導し、 in vivoでPGCLCスペシファイを誘導するために必要です。
      注意:分異培地は氷上または4°Cで保管してください。 分化培地は分化プロトコルの1日目と2日目に準備できます。
   3. 1日目(hiPSCをプレート化してから16〜24時間以内)に、インキュベーターからプレートを取り出し、メッキ質を除去します。
   4. ウェルごとに0.5 mL RB27ベースメディウムを加えて洗浄してください。
   5. RB27基底培地を吸引し、1井戸あたり1mLの分化培地を加えます。
   6. 細胞を含んだプレートを加湿したノールキシックインキュベーター(37°C、5%_CO2)に戻します。
   7. 分化2日目には、1ウェルあたり1mLの分化培地で細胞を更新します。
4. hPGCLCの分化(3〜5日目)
   1. 交換培地の準備:RB27基礎培地にBMP4(10 ng/mL)、LIF(10 ng/mL)、SCF(50 ng/mL)、EGF(50 ng/mL)を補足します。スイッチ培地は、hPGC仕様から生存・増殖への 生体内 移行を反映しています。BMExは、もはや発光形成が不要なため省略されています。
   2. 3日目と4日目には、それぞれ1mLのスイッチ培地でウェルを更新します。
   3. 分化5日目には、免疫蛍光法またはフローサイトメトリーを用いてhPGCLCを特徴付けることができます。

4. 免疫蛍光およびフローサイトメトリーによるhPGCLCの特徴付け

1. 免疫蛍光による特性評価。
   1. 透過化溶液を準備します:0.3%のトリトンX-100をPBSで希釈したもの。
   2. 洗浄液の準備:0.05% Tween 20 in PBS(PBST)
   3. ブロッキング溶液を準備します:1%の牛血清アルブミン(BSA)をPBSTに含めて。
   4. hPGCLC分異に使われる井戸からスイッチ媒体を取り除きます。
   5. 細胞を1枚の井戸あたり1mL(DPBS)で洗浄します(-/-)。
   6. 細胞を1mLの1井戸に4%パラホルムアルデヒド(PFA)浸入して15分間RTで固定します。
   7. 細胞をPBSで5分間3回洗浄し、1ウェルあたり1mLを使用します。
      注:この時点で、プレートは免疫蛍光開始前に4°Cで保存できます。
   8. 細胞をRTで15分間、1 mLずつ投与して透過します。
   9. 細胞を洗浄液で3回、1 mLずつ5分間洗浄します。
   10. ブロック液で1時間RTでブロックし、1 mLを1ウェルに使用します。
   11. 一次抗体溶液を準備する:目的の一次抗体を希釈し、ブロッキング溶液として使います。
       注:ここではPGCマーカー用の以下の2つの抗体の組み合わせを用いています:ヤギ抗SOX17およびウサギ抗TFAP2C、ヤギ抗SOX17抗体およびマウス抗POU5F1抗体(材料表)。
   12. ブロッキング溶液を取り出し、1ウェルあたり0.4mLの一次抗体溶液を加え、4°Cで一晩培養します。
       注:非特異的抗体結合を評価するためには、陰性対照を含めることが重要です。この場合、一次抗体は省略してブロッキング溶液に一晩浸し、その後二次抗体溶液で染色します。
   13. 翌日、一次抗体溶液を取り出し、細胞を3回、5分間PBSTで洗浄します。
   14. 二次抗体溶液を準備します:目的の二次抗体(材料表)およびDAPI(1:500)をブロッキング溶液中に希釈します。
       注意:二次抗体溶液は光に敏感で、暗闇に置くべきです。
   15. PBSTを除去し、1ウェルあたり0.4mLの二次抗体溶液を暗闇でRTで1時間加えます。
   16. 細胞をPBSで5分間3回洗浄し、1ウェルあたり1mLを使用します。
   17. 細胞のイメージング(20倍対物レンズ)を行ってください。
       注:免疫蛍光画像はAiryscan顕微鏡の20倍対物レンズで取得し、明視野画像はEVOS顕微鏡の4倍対物レンズおよび10倍対物レンズで撮影しました。
2. フローサイトメトリーによる特性評価
   1. FACSバッファの準備:DPBSで0.5% BSA(-/-)
   2. hPGCLCsでウェルからスイッチ培地を取り出します。
   3. 細胞を1 mL DPBS(-/-)で洗浄します。
   4. 1ウェルあたり0.5mLの予温されたアキュターゼを加え、37°Cで15分間培養します。 解離に関しては、hPGCLCsが非常に敏感であるため、トリプシン溶液よりもアキュターゼが好まれます。
   5. p1000でセルを2〜3回慎重に再懸浮させて単一細胞懸濁液を作ります。
   6. 逆立顕微鏡で単細胞懸濁液が得られるかどうかを確認しましょう。もしそうでなければ、p1000ピペットでさらに1〜2回再懸濁してください。
   7. 細胞懸浮液を40μmのストレーナーで15mLチューブにろ過します。
   8. 40μmのストレーナーを5 mLのFACSバッファーで洗浄します。
   9. セル懸浮液を300 x g で5分間遠心分離します。
   10. 上清液を取り除きます。
   11. 細胞ペレットを0.3 mLのFACSバッファーに1.5 mLのチューブ内で再懸浮させます。
       注意:細胞計数器やヘモサイトメーターを使った細胞数は任意です。セル数を数えると、12ウェルプレートの1ウェルあたり約100万セルが見込まれます。
   12. フローサイトメトリー用の十分な対照サンプル(染色なしおよび単染色対照)を準備します。そのため、細胞懸存液15〜30μLを1.5 mLのチューブに移し、FACSバッファーで100 μLまで充填します。
       注:本研究では、EPCAM-PEcy7(1:200)、ITGA6-BV421(1:200)、7AAD(1:200)の3つの単一染色を準備しました。共役抗体と7AADを含む溶液は光に敏感で、暗闇に保管する必要があります。
   13. 適切な希釈を得るために、関心のある共役抗体を直接細胞懸濁液に加えます。ここでは、PGCマーカーの共役抗体を組み合わせて使用しました:EPCAM-PEcy7(1:200)およびITGA6-BV421(1:200)(材料表)。
   14. 細胞を暗闇の氷の上で30分間潜伏させ、共結合抗体を培養します。
   15. サンプル、未染色対照、単一抗体対照に1 mLのFACSバッファーを加え、300 x g で遠心分離機で5分間加熱します。
   16. 上清液を取り除きます。
   17. サンプルを0.5 mLに、対照サンプルを0.2 mLのFACSバッファーに再懸浮させます。これは1 mM EDTA含有です。これにより細胞の凝集が防げます。
   18. サンプルと対照群を細胞ストレーナーキャップ付きの5mLのFACSチューブに加え、ストレーナーに通します。
   19. 各サンプルに7AADを直接加えてから数分後にフローサイトメーターで測定します。
   20. フローサイトメーターを使ってサンプルを測定します。ここでは蛍光ベースの細胞分析装置を用いてサンプルを測定し、FACSDivaソフトウェア(v9.0)でデータを収集し、FlowJoソフトウェア(v10.10.0)でデータを解析しました。
   21. 対照サンプル(染色なしおよび単一抗体対照)を使ってゲーティング戦略を設定し、必要に応じて補正を行います。
   22. サンプルを機械に入れる前にボルテックスしてください。
   23. すべての事象から細胞集団を抽出するには、まず領域[前方散乱面積(FSC-A)および側散乱面積(SSC-A)]に基づいてゲートを設定します。
   24. この細胞群から、サイズ[FSC-幅(FSC-W)およびFSC-高さ(FSC-H])、粒度[SSC-WおよびSSC-H]に基づいて単一細胞を抽出します。
   25. 7AAD陰性細胞にゲートを設定し、死んだ細胞をさらなる解析から除外します。
   26. サンプルを使ってゲートが正しく設定されているか確認し、必要に応じて調整してください。
   27. この活細胞集団から関心のあるマーカーを解析してください。ここで、EPCAMとITGA6の両方で陽性反応を示したゲート細胞はhPGCLCsに対応しました。

結果

hiPSCsの質と安定状態はさらなる分化に重要です
hiPSCは、異なるコーティングで少なくとも3回の通過にわたり6ウェルプレート内で維持され、その後、分離実験と解析が行われました。hiPSCは細胞コロニーが70–80%の合流度に達したときに通過され(図1B)、これはhPGCLC分化を開始する最適なhiPSC合流点でもあります。健康なhiPSC培養は、明るい視野画像で暗い領域や分化した領域を持たず、均一な群落形態を示しました(図1B)。しかし、細胞コロニーが最適な合流位に維持されなかったり分化の兆候が見られた場合、hiPSCの質は影響を受けました(図1B)。低合流時にはhiPSCは増殖を続け、交配や分化実験に適した合流点が整うまでコロニー形成により多くの時間が必要でした。高い合流度では、hiPSCは互いに重なり合い、分化した領域が現れました。hiPSCsの多能性状態はSOX2またはPOU5F1の発現によって確認^{されました。これらは}いずれもhiPSCsの多能性と自己更新に不可欠な転写因子であり、最も重要なのは、SOX2はhPGCLCs^によって発現されないことです。ファロイジン染色を用いて細胞骨格の組織およびコロニー形態を評価し、hiPSCsの質を示しました。細胞形態の違いはSOX2またはPOU5F1の還元に関連していることに注意してください(図1B)。

hiPSC維持基質がhPGCLC分化に与える影響
異なるコーティング基質にhiPSCを維持することがhPGCLCsへの分化に影響を与えるかどうかを評価するため、hiPSCsは異なる基質(Geltrex、Matrigel、Cultrex、vitronectin)上で培養されました(図2)。すべての基質において、hiPScは強健かつ均一な核のSOX2またはPOU5F1レベルを示し、多能性状態を示しました。Geltrex、Matrigel、Cultrex上で維持されたhiPSCコロニーは、ビトロネクチン上の丸いコロニーと比較すると形態が似ており、明確な群落境界や不規則な全体形が特徴的でした(図2)。70〜80%のコンバーシティに達するhiPSCは40K細胞/cm^² の密度でプレートされ、Geltrex²⁶上でhPGCLCsへ分化しました。5日目には、すべての条件下で特徴的なhPGCLCコロニーが示されました(図3)。さらに、すべての疾患で三重陽性のSOX17/TFAP2C/PDPNまたは二重陽性のSOX17/POUF51 hPGCLCが同定されました(図3)。これにより、異なる条件下で培養されたhiPSCに対して分化プロトコルが適用可能であることが示唆されました。

初期hiPSC細胞密度がhPGCLC分化に与える影響
hPGCLCの最適な分化(ゲルトレックス上)には最適なシーディング密度を確認することが重要です。なぜなら、異なるhiPSCは増殖速度が異なるためです。さらに、hiPSCが継続的に通過するにつれてhPGCLC分化の効率が低下した場合は、hiPSCシーディングセル密度の調整が推奨されます。シーディングセル密度がhPGCLC分化効率に与える影響を評価するために、hiPSCは10Kから100K細胞/cm^² の異なる密度でシードされました(図4A)。5日目には、ヒトPGCマーカーに対する2種類の結合抗体であるEPCAMおよびインテグリンα6(ITGA6)³²を用いたフローサイトメトリーでhPGCLCsの割合が評価されました。フローサイトメトリー解析は、40K細胞/^cm2 でシードされたM199 hiPSCに対して標準的な逐次ゲート戦略に従って行われました(図4B)。簡単に言えば、全細胞集団(すべてのイベント)をデブリ(粒子面積)除外するためにゲートを設定し、次にサイズ(FSC)と粒度(SSC)に基づいて単一細胞を選定し、最後に7AAD染色に基づいて死んだ細胞を除外しました。その後、EPCAM-cy7およびITGA6-BV421を発現する細胞の量産ゲートを染色済みおよび未染色サンプルを用いて設定しました(図4B)。

異なるシーディング細胞密度と異なる基質で培養したhiPSCを用いたhPGCLCの分化効率を比較した結果、密度依存的な傾向が見られた(図4C)。シーディング密度が20〜40K細胞/^cm²の場合、M54およびM199 hiPSCは、GeltrexおよびCultrexで維持されたhiPSCから得られたEPCAM+/ITGA6+二重陽性hPGCLCの割合が最も高かった。興味深いことに、密度が高いほど微分効率は低下しました。PGCマーカーSOX17/TFAP2C/PDPNまたはSOX17/POUF51を用いた免疫蛍光検査の結果は、フローサイトメトリーの結果を検証しました(図4D)。これらの結果は、最適な分化効率を得るために特定のhiPSCsに合わせてシーディング密度を調整することが重要であることを示唆しています。免疫蛍光法とフローサイトメトリーを組み合わせることで、hPGCLC分化アッセイの堅牢性が向上します。

図1:hPGCLCの分化ワークフローとhiPSCの品質。 (A) 本研究で用いられたワークフローの概略図。hiPSCは(培養培地内で)維持され、分化日(Day 0, D0)には60〜80%の合流率に達しました。D0では、hiPSCを単一細胞に解離し、所望のシーディング密度(メッキ中)でプレートしました。翌日、細胞は分化培地(D1–D3)で処理され、その後スイッチ培地(D3–D5)を投与されました。D5では、hPGCLCが免疫蛍光またはフローサイトメトリーに用いられました。(B) 明視野画像(上段 - 4倍倍率);SOX2、ファロイジン染色、DAPI染色(中間列)に対する免疫蛍光;POU5F1、PHALLOIDIN染色、DAPI染色(下段)では、異なる合流度を持つhiPSCが示されました。スケールバー=50μm。図1Aの図は、著者によってAdobe Illustratorの基本的な描画ツールを使って作成されました。有料のソフトウェアやツールは一切使用されませんでした。したがって、著作権ライセンスは必要ありませんでした。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:hiPSC培養中の各種コーティング基材の影響。 明領域画像(上段);SOX2、ファロイジン染色、DAPI染色(中間列)に対する免疫蛍光;POU5F1、ファロイジン染色、DAPI染色(下段)では、異なる被覆基材上で培養されたhiPSCが示されています。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3:hiPSC培養中の各種コーティング基質がhPGCLCsの分化に与える影響。 明視野画像(上段10倍倍);SOX17、TFAP2C、PDPN、DAPI染色(中間列)に対する免疫蛍光;また、異なるコーティング基質上で培養されたhiPSCから開始し、5日目にhPGCLCsの分化(Geltrexを用いて)のPOU5F1、SOX17、DAPI染色(下段)を行った。黄色の線はhPGCLCが検出された領域を強調表示しています。スケールバー=25μm(上段)および50μm(中央・下段)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:hiPSCシーディング密度がhPGCLCs分化に与える影響。 (A) 異なるhiPSCシーディング密度(40K細胞/cm^²、60K細胞/cm²、80K細胞/cm^²)を用いたhPGCLCs分化の第1日目(D1)およびD3のブライトフィールド画像。スケールバー=250μm。4倍倍。(B) EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCの割合を定量化するためのゲーティング戦略を示す代表的なフローサイトメトリープロット。このため、Geltrexを40K細胞/cm^²のシーディング密度でM199 hiPSCsを使用しました。(C) 異なる被膜で培養し、異なる密度でシードしたhiPSCs(M199およびM54)を用いた際のEPCAM+/ITGA6+ hiPGCLCsのD5におけるパーセンテージを示すバープロット。(D) SOX17、TFAP2C、PDPN、DAPI染色の免疫蛍光(左パネル);およびhPGCLCs分化のD5におけるSOX17、POU5F1、DAPI染色(右パネル)を、40Kおよび80K細胞/cm2でシードしたhiPSCs(M199およびM54、Geltrex使用)を用いる。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

ディスカッション

in vitro 配偶子形成は、管理された培養条件下および患者特異的ベースでヒト生殖細胞の発生、生殖毒性、不妊を調査するための強力な実験的プラットフォームを構成しています。hPGCLCとhiPSCを区別するための複数のプロトコル^{が報告されています}が、この分野の進展は、標準化され、拡張可能で再現性のあるアプローチが限られているため、研究室全体で妨げられています。最近の研究では、bM4ベースのマイクロパターン分化²⁷、3.5日以内にhPGCLC生成を可能にする高速2D単層プラットフォーム²⁷、および着床周発生およびパラクリンニッチシグナル伝達をモデル化する3D培養システムなど、hPGCLC誘導のための簡略かつ効率的なアプローチが報告されています。³³。これらのプロトコルはhPGCLCの差別化を効率的にサポートしていましたが、依然として高スループットプラットフォームとしての機能には欠けています。hPGCLCベースの研究が広く適用可能であるためには、特に生殖毒性学的スクリーニングにおいて、プロトコルは堅牢で技術的にアクセスしやすく、下流の定量的アッセイと互換性がある必要があります。ここでは、hPGCLCsのBMEx微分プロトコルの段階的な分析を提示し、再現性と性能を決定する重要な技術的パラメータを強調します。

成功する分化の主要な決定要因は、hiPSCの初期多能性状態です。パッセージ番号、細胞の健康、系統特異的特徴、分化前培養条件はhPGCLCの分化結果に影響を与えることがあります。初期にはhiPSC維持中、コーティング基質、シーディングセル密度、培養プレート形式に注目が集まり、これらはhPGCLC分化開始時にコロニー構造とシグナル環境を定義します。本研究は、異なるコーティングおよび異なるシーディング密度で培養したhiPSCsがhPGCLCsの分化(Geltrex)に与える影響を示しています。ここで試験された両方のhiPSC系統は、20,000–40,000^cells/ cm2のシーディング密度で最大の分化効率を示しました。これは、新しい細胞株の導入、延長された継代後の導入、実験レイアウトや培養皿のフォーマットの変更時に最適なシーディング密度を決定する必要性を強調しています。表面面積対体積比や成長速度論のわずかな変化でも、高い分化効率を維持するために最適化が必要になることがあります。したがって、まずhPGCLC分化に最適な条件を決定するために、小規模なパイロット実験を行うことが推奨されます。

その堅牢な方法であるにもかかわらず、認識すべき限界もあります。複数の被膜や密度に適合しているものの、分化効率はピジェネティック状態や通過履歴など、完全に制御できないhiPSCの本質的特性に敏感であり、依然として感受性があります。いくつかの検査済みhiPSCはhPGCLCs^に分離できないように見えました。最も重要なのは、完全に定義された製品であるビトロネクチンとは異なり、BMExは動物由来の産物であり、バッチごとに変動が生じるため、再現性に影響が出る可能性があることです。マトリジェル、カルトレックス、ゲルトレックスの異なるロットで以前に試験され一貫^{した結果が得られ}ましたが、これは依然として懸念されており、将来の再現性と移行性を確保するためにBMExの完全に定義された代替品を検討すべきです。ここでは2本のオス(XY)hiPSCラインを使用しましたが、このプロトコルはメス(XX)およびオス(XY)²⁶のラインで試験されています。最後に、プロトコルによりhPGCLCsは転写的にhPGCsと類似し、^{さらなる発達能力}を持つことが示^{されましたが、}後期生殖細胞段階へのさらなる成熟についてはここでは扱われていません。スクリーニングスタイルの応用ではスケーラビリティが示されましたが、より広範なhiPSCラインにわたる自動化ベースの適応と実験室間検証は、翻訳の有用性をさらに強化します。

既存のhPGCLC差別化戦略と比較して、このプロトコルにはいくつかの利点があります。高度に専門化されたマトリックス制限のアプローチとは異なり、一般的に使われるhiPSCメンテナンス基板や培養プレートフォーマットに対応し、技術的な障壁を低減します。密度最適化と初期段階の品質管理への重点は、in vitro 配偶子形成の分野で根強い課題である再現性をさらに向上させます。

ここで述べた方法論的枠組みは、生殖毒性学、不妊モデリング、発生生物学において特に重要です。スケーラブルフォーマットとの互換性により、中〜高スループットの化合物スクリーニングが可能であり、再現性はクロススタディ比較や共同コンソーシアムの取り組みを支援しています。より広くは、hPGCLC誘導プロトコルの研究室間での体系的な標準化と、特徴付けおよび機能的エンドポイント^18,35を比較することが、in vitro配偶子形成を予測可能なヒト関連プラットフォームへと進めるために不可欠です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		フローサイトメトリー用機器
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		ソフトウェア
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	PBSTで溶解
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	冷たいDMEM-F12で希釈
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		イメージング機器
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		ソフトウェア
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		ソフトウェア
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	冷たいDMEM-F12で希釈
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		ソフトウェア
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	冷たいDMEM-F12で希釈
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	MTA付きリクエストでhiPSCsを配布可能
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	MTA付きリクエストでhiPSCsを配布可能
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		細胞計数機器
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		ソフトウェア
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	冷たいDMEM-F12で希釈
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	最初に水で8% PFAに溶解し、次いで0.2 Mリン酸塩緩衝液で4%（1:1）に希釈
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	0.1% BSAを含む4 mM HCLに100 µg/mLの標準濃度
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	PBSに50 µg/mLの標準濃度
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	0.1% BSAに100 µg/mLの標準濃度
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	PBSに100 µg/mLの標準濃度
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell