抜出された人間の小臼歯の歯周靭帯残存物の非破壊3D定量解析を口内スキャンで行った

サマリー

このプロトコルは、抜歯歯の歯周靭帯残存を評価するための非破壊的で定量的な3Dデジタル手法を詳述しています。口腔内スキャンとリバースエンジニアリングソフトウェアを用いて、歯周評価のための生外ワークフローを構築し、前臨床研究における抜歯技術の比較方法論的基盤を提供しました。

要約

意図的な歯の再植は、根管病変がある自然な歯を保存するための貴重な治療法です。その成功は、残存歯周靭帯(PDL)の生存可能性と構造的完全性に大きく依存しています。組織学的断片や二次元写真撮影などの従来の評価方法は、破壊的または投影誤差によって制限されます。これらの制約に対処するため、本プロトコルは高精度口内スキャンを用いて残留PDLを評価する非破壊的かつ定量的な方法を提示します。抜歯した歯を染色してPDL組織を可視化し、三次元スキャンして高精度なデジタルモデルを作成しました。データはリバースエンジニアリングソフトウェアを用いて解析され、関心領域が定義され、残留PDLカバレッジは色の閾値によって定量化されました。この手法は、生物学的サンプルを損なうことなくPDLの真の3Dカバレッジ面積を計算しました。このプロトコルの感度と有用性を評価するために、ペリオトームを用いた低侵襲(MI)抜歯と従来の鉗子抜歯を比較しました。デジタル解析では、MI法は従来の法(50.46%)よりも有意に多くのPDL組織(61.99%)を保存していることが示されました。さらに、その後の細胞生存率アッセイでもデジタル結果が裏付けられ、MI群で有意に高い代謝活性が示されました。最終的に、本研究は生 前研究 における抽出技術の比較のための概念実証ワークフローを確立し、前臨床研究における抽出技術の比較に充実した方法論的基盤を提供します。

概要

意図的な歯の再生は、そうでなければ絶望的と見なされる自然な歯を保存するための有効な最終手段としてますます認識されています。持続性根尖病変、アクセス不能な管穿孔、または非^{手術で管理}できない広範な吸収性病変の管理に適応症です^1,2。標準的な処置は、影響を受けた歯を意図的に抜き、その後口外の目視検査、治療的介入(根端切除、準備、根端充填を含む)、そして元のソケット^1,2への再植栽を含みます。

歯根表面に残存する歯周靭帯(PDL)組織の存在と完全性は、歯再生後の治癒パターンを決定する最も重要な予後因子^です。健全で完全なPDLバリアは、生理的可動性の再確立や、代替吸収(無キル症)や炎症性根吸収などの合併症を防ぐために不可欠です。しかし、歯槽からの歯の剥離は、外傷的または意図的であれ、本質的にPDL線維の付着を妨げ、神経^{血管供給を}断ち切る5。したがって、PDLの生物学的再建は再植え歯の歯周治癒にとって極めて^{重要です。}広範な研究により、口腔外臨床手技中に残留PDL組織の活力と体積を最大化することが重要な予後因子であることが確立されており、再植え歯の長期的な機能的生存にとっての重要性は文献^6,7で十分に記録されています。

抜歯は本質的にPDLの付着を妨げるため、抽出技術の選択は根表面に残るPDL組織の体積と生存率に直接影響します。従来の鉗子による抜歯は回転力と牽引力を加え、歯槽骨に押しつぶされたり摩擦で剥がされたりします。この外傷を最小限に抑えるために、低侵襲(MI)抜出法が開発されています。過去の研究では、心筋筋痛法が影響を受けた歯の歯周組織への外科的外傷を大幅に軽減できることが報告されています⁸。ペリオトームを用いたPDL付着部の切断技術や、てこの力を避ける垂直抽出システムなど、根表面に残留PDLを保存するために開発されています。例えば、MIシステムを用いた場合、意図的な歯の移植や外科的抜歯の臨床結果が改善したことが症例報告で記録^{されています。}これらの発見は、抜抜による外傷を最小限に抑えることが根表面の残留PDL組織の保持を改善する可能性を示唆しています。

しかし、非外傷性摘出の利点については臨床的コンセンサスがあるものの、MI法を用いた場合に残存するPDL組織の保存範囲を従来の手法と比較して定量化する直接的な証拠は限られています。この知識のギャップは主に利用可能な評価手法の限界に起因しています。既存の研究では、根表面の残留PDLを評価するために主観的または破壊的な評価手法が主に用いられています。細胞^解析では組織学的切片が標準ですが、本質的に破壊的であり、サンプルをさらなる研究に利用できません。あるいは、染色と2次元(2D)写真撮影を組み合わせて残留PDL¹²の特徴付けが用いられています。しかし、これらの方法は根表面全体の残留PDL組織を定量化するには不十分です。2D写真では、複雑で曲がった三次元根の表面積を正確にマッピングすることはできません。それは必然的に投影誤差や歪みを生み出し、不正確な定量化につながります。

近年、口腔内デジタルスキャン技術は大きく進歩し、高精度かつ迅速なデータ取得を実現しています。デジタル手法は、過去の研究で印象や軟部組織の変化の測定、または若^{年患者の歯}の摩耗評価に用いられてきました。応用は口腔外科における顔の腫れ評価など、複雑な体積解析にも拡大^{しています。}これらの技術により、リバースエンジニアリングソフトウェアで操作・測定可能な高精度な三次元(3D)モデルの作成が可能となり、非破壊的で定量的な分析の潜在的な解決策を提供します。しかし、抜歯歯の残留PDL評価に口腔内スキャンを応用する可能性はまだ検討されていません。

このプロトコルの包括的な目標は、生物学的染色と高精度の口腔内スキャンおよび3Dリバースエンジニアリングを組み合わせた標準化された非破壊ワークフローを確立することです。色付きテクスチャの表面マップを用いた高忠実度デジタルモデルを作成することで、根面全体にわたる残差PDLのより客観的かつ再現性の高い測定が可能になります。本研究は、提案されたワークフローを用いて、ヒト小臼歯におけるペリオトーム補助MI抜歯と従来の鉗子抜歯の2つの抜歯技術の残留PDL被覆を比較します。MI法は従来の方法よりも残差PDLカバレッジの割合をより多く保持すると仮説されています。

重要なのは、このプロトコルが実験室や前臨床環境向けの 生前生前 研究ツールとして厳密に設計されていることです。この手技は染色、自然乾燥、デジタルスキャン、ソフトウェアによるセグメンテーションを含み、総分析時間は意図的な再植栽時の術中使用とは互換性がなく、口腔外の時間を最小限に抑えなければなりません。したがって、この方法は(i) 制御条件下での異なる抽出技術のPDL保存効果を比較するのに適しています。(ii) 教育現場での訓練と校正;(iii) デジタルPDLカバレッジ指標と生物学的アウトカムを結びつけた検証研究。複雑な解剖学を持つ多根歯への応用はさらなる調査が必要です。

プロトコル

研究プロトコルは、北京大学口腔医学部倫理委員会(PKUSSIRB-202054022)のガイドラインに従って実施されました。

1. 患者選択とグループ割り当て

1. 矯正目的で小臼歯の抜歯が必要な患者を選定します。前臼歯がう蝕や歯周病がない場合、対象基準を満たしていることを確認しましょう。
2. 高血圧、糖尿病、喫煙歴、または16歳未満または45歳以上の患者は除外します。
3. 前臼歯をランダムに2つの実験グループに分けます:対照群(従来の抜歯)と低侵襲(MI)群(ペリオトーム補助抜歯)。
4. 各グループの歯をランダムに3Dスキャン解析経路または生物学的検証(CCK-8)経路に割り当て、各評価方法に独立したサンプルを使用することを確認します。

2. 抜歯手術

1. すべての抜歯は標準的な局所麻酔の下で行ってください。
2. 方法A:従来型抽出(対照群)
   1. 歯首の周りに歯肉分離を行います。
   2. 歯のクラウンの頸部に歯科鉗子を位置付けます。
   3. 歯が緩むまで回転力を加えます。鉗子を使って歯槽から歯を抜きます。
3. 方法B:低侵襲抜歯(心筋梗塞群)
   1. 歯肉分離を行います。
      注意:軟部組織の損傷や器具の破損を防ぐために、ペリオトームを慎重に扱ってください。
   2. ペリオトームをPDL空間の最も深く、根の長さの少なくとも3分の2まで挿入します。
   3. ペリオトームを使って根周りのPDL繊維を円周的に切断します。歯を緩めろ。
   4. 歯槽槽から歯を垂直に引き抜き、ピンセットを使ってください。

3. 試料の準備と染色

1. 抜歯後すぐに、無菌生理食塩水で10分間歯をすすぎて血液やゴミを取り除きます。
   注意:トルイジンブルーは有害な化学物質です。取り扱い時には適切な個人用防護具(手袋、ゴーグル)を着用してください。
2. 歯を0.1%トルイジンブルー溶液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸して40分間、歯根表面を染色し、PDL組織を観察します。
3. 生理食塩水で10分間染料溶液を洗い流し、三方向シリンジで表面を優しくドライヤーして余分な水分を除去します。
   注意:根の表面は均一な青紫色の色合いを示すと期待されますが、露出したセメント質は染色されず、淡いベージュ色に見えるべきです。

4. 3Dデジタルスキャニング

1. 製造元の指示に従って口腔内デジタルスキャナーを校正し、0.02mmの精度を確保してください。
2. 歯冠は止血鉗子で固定し、根の表面が見えなくなるのを防ぎます。
3. 標準的なスキャン条件下で根の表面全体をスキャンします。クラウンの補完スキャンを行い、3Dモデルを完成させます。
4. スキャナーの独自ソフトウェアを使って、デジタルスキャンデータを高解像度3Dオブジェクト(OBJ)ファイルおよび関連データパッケージとしてエクスポートします。テクスチャ画像はJPG形式で保存されます。
   注意:ライブスキャンプレビューでは、ルート表面に穴やアーティファクトのない連続的かつ高密度のメッシュが表示されなければなりません。テクスチャ画像は青色に染まった領域と染色されていない根の表面を明確に区別できるはずです。

5. 3D モデル再構築と定量的分析

1. 画像前処理
   1. しきい値キャリブレーション
      1. JPGテクスチャマップを画像編集ソフトにインポートします。画像を8ビットグレースケールに変換してください。
      2. しきい値ツール(画像>>しきい値を調整)を開き、ヒストグラムを確認して、青く染まったすべてのPDLピクセルを捕捉する最小グレースケール値を記録します。3人の独立した観測者を用いて最小グレースケール閾値を決定します。
   2. 元のJPGテクスチャマップを画像編集ソフトにインポートします。色の範囲>選択へ移動してください。シャドウモードを選択し、レンジを65、許容範囲を20%に設定します(5.1.1の閾値データからキャリブレーション済み)。
      注意:すべての青色染色されたPDL領域が完全に選択されていること、そして染色されていない根面が含まれていないことを確認しましょう。
   3. 選択した青色の領域をコピーし、新しい白いレイヤーに貼り付けてバイナリマスク(PDLは青、裸根は白)を生成します。処理済みのテクスチャ画像を保存して元のJPGファイルを上書きします。
2. 定量的測定
   1. 処理済みの3Dモデルをリバースエンジニアリングソフトウェアにインポートします。
   2. ポリゴンを>トリムで、歯肉組織や根尖組織を除外するために関心領域(ROI)を定義します。ROIの上限はセメントエナメル接合部(CEJ)より2mm下に設定します。先端3mmは分析から除外してください。
   3. ROI内で「強化された青い領域」を選択してください。選択後、残存PDL組織は赤色で強調されます。
   4. 分析>計算>計算面積でROIの総表面積と青い領域の表面積(残差PDL)を計算します。
   5. 式1を用いてPDLの補償率を計算します:
      PDLカバレッジ(%) = (残差PDL面積/ROI総面積)×100
3. 可視化
   1. 歯軸に垂直な4つの根面(頬、舌、近中、遠位)の画像を撮影し、詳細な視覚的評価を行います。

6. 生物学的検証(細胞生存可能性アッセイ)

注:この節では、デジタル解析を裏付けるためにサンプルの一部(グループあたりn=8個)に対して実施される検証手順について説明します。

1. 抜歯直後、歯を予備温めた(37°C)培養液を含む無菌遠心分離管に入れます。
2. サンプルを4°Cの冷蔵庫で1時間以内に検査室へ運搬します。サンプル輸送および細胞生存率試験には、10%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補足したDulbecco's Modified Eagle Mediumを使用します。
3. 到着後すぐにバイオセーフティキャビネットで無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で歯を洗い流してください。
4. 到達から10分以内に、無菌メス刃で室温で細胞の生存率を最大化するために、根の中央3分の1のPDL組織(ROIはグラデーション付きプローブで定義)を慎重にこすり取ってください。
5. 採取した組織を0.25%トリプシン-EDTAで30分間消化します。細胞懸濁液を120× gで室温(22–25°C)で5分間遠心分離し、細胞内沈殿物を得ます。
   注意:遠心分離後、チューブの底に白いペレットが見えるはずです。ペレットが見つからない場合は、120 × g でさらに1分間再遠心分離します。
6. 沈殿物を製造元の指示に従って調製した600μLセルカウントキット-8(CCK-8)溶液と培地の混合物に1:10(v/v)で再懸濁します。
7. この懸濁液を1井戸あたり200μLで96ウェル板に分散します(サンプルごとに3回の技術的複製)。プレートを37°Cで加湿インキュベーターで5%_CO2 で3時間培養します。
8. 各ウェルから50μLの上清液を新しい96ウェルプレートに移します。
9. マイクロプレートリーダーを使って450 nmの吸収率(光学密度、OD)を測定します。平均OD値を統計比較のために記録してください。
   注意:(i) トルイジンブルー染色液を収集し、有害化学廃棄物として洗浄し、機関の化学物質安全ガイドラインに従って処分すること;(ii) PDL組織、使用済みメス、細胞培養廃棄物を生物的有害廃棄物(バイオセーフティレベル1)として処理し、機関のバイオセーフティプロトコルに従ってオートクレーブまたは焼却すること;(iii) PPE(手袋、ピペット先端、ペーパータオル)を指定されたバイオハザード容器に捨てること。

7. 統計分析と方法論的検証

1. データ収集:3D解析による総根表面積(mm²)、総染色面積(mm²)、PDL被覆率(%)、生物学的アッセイのOD値を含む定量データをまとめます。
2. 正規性検定:シャピロ・ウィルク検定を用いてデータ分布の正規性を評価します。
3. グループ比較:
   1. MI群と対照群のPDLカバレッジとOD値を比較してください。
   2. 正規分布データにはペアなしの学生t検定を、正規分布でないデータにはマン・ホイットニーU検定を用います。
   3. 効果量(コーエンのd)を計算して差の大きさを決定します。
4. 方法論的ロバスト性分析:
   1. 「根表面積」を独立変数、「PDLカバレッジ」を従属変数として線形回帰分析を行います。
   2. ピアソン相関係数(r)を計算し、測定方法が歯のサイズによってバイアスされているかどうかを判断します。有意でない相関(P > 0.05)はロバスト性を示します。
5. 信頼性分析:
   1. バイオリンプロットとボックスプロットを組み合わせて生成し、データの確率密度や分布特性を可視化します。
   2. グループ間のデータ分布の形状と濃度を比較します。
6. 観測者内および観測者間信頼性試験:
   1. 信頼性評価のために、全データセットから16サンプル(グループごとに8サンプル)を無作為に選びます。
   2. 観察者内での再現性を高めるために、同じ16サンプルに対して1週間間隔で完全な分割および測定手順を繰り返し、合計2回の試験を行います。
   3. 観測者間合意のために、セグメンテーションプロトコルに関する追加の2人の独立した観測者に標準化されたトレーニングを提供します。
   4. 3人の観測者全員が同じ16サンプルに対して独立してROIの定義、色の閾値測定、面積計算を行います。
   5. クラス内相関係数ICC(A,1)を95%信頼区間で計算し、観測者内および観測者間比較の絶対一致を定量化します。ICCの値を報告してください>0.90は優秀、0.75–0.90は良好、0.50–0.75は中等、<0.50は悪質。
   6. すべてのペアワイズ比較に対してブランド・アルトマン解析を行います。平均差(バイアス)と95%の一致限界(平均差+/- 1.96 SD)を計算します。有意でないペアt検定結果(P > 0.05)は、系統的バイアスが無視できる程度のものを示します。
7. ソフトウェア:すべての統計解析は適切なソフトウェアを使用して実施してください。P < 0.05を統計的に有意なものと考えます。

結果

本研究で確立された実験ワークフローは、抜歯後の残留PDLの定量的評価における非破壊プロトコルを成功裏に実証しました。実験デザイン(図1)に示されているように、プロトコルは臨床抽出手順とデジタル取得および生物学的検証を統合しました。口腔内デジタルスキャンの適用と3Dリバースエンジニアリングにより、根表面の正確な再構築が可能となりました(図2)。デジタルモデルは染色されたPDL組織と露出した根面を色の閾値に基づいて効果的に区別し、ROIはギンギバルおよび根尖の変動を除外して機能的な根面に分析を集中させました。

3Dデジタル解析により、2つの抽出法間で残留PDLの形態的パターンが明確に明らかになり、プロトコルの感度の定量的証拠となりました(図3A,B)。MI群では、残留PDL組織は通常、根面の大部分を覆う密な網...

ディスカッション

意図的な再植栽の成功は、根表面に生存可能なPDL細胞の保存に極めて依存しています。心筋摘出法は臨床的に外傷^8,9,10の軽減に推奨されていますが、残存PDL組織に対する生物学的利益の定量化は客観的な評価ツールの不足により依然として課題となっています。本研究は、残留PDL組織を定量化するための概念実証型非破壊3Dデジタル解析プロトコルを確立しました。これらの発見は、MI法が従来の抽出法に比べて根表面の残留PDL組織の保存率を有意に向上させるという仮説を支持しています。

本研究の主な貢献は、体外PDL評価のための口腔内スキャンベースのワークフローの検証です。従来の組織学的手法は細胞の詳細を提供しますが^{、サンプルは}破壊されます。逆に、従来の2D写真手法では、歯根の複雑で曲がった幾何学をマッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	Servicbio	CCP-96H	細胞培養および吸光度測定用マルチウェルプレート
バイオセーフティキャビネット	Thermo Fisher Scientific	1300 Series4 A2	無菌操作用クラスIIバイオセーフティキャビネット
セルカウントキット-8 (CCK-8) 溶液	MedChemExpress	HY-K0301	細胞活性アッセイ試薬
遠心分離機	Ustc Zonkia Zcientific Instruments	SC-3610	細胞沈殿用実験室用遠心機
培養液	Gibco	DMEM 11965	細胞移送および培養用基礎培地
歯科用鉗子	Jinzhong Surgical instruments	K0F130/K0F100	標準的な歯科抜歯器具
胎児ウシ血清	Anhui Kangyuan Biotechnology Co., Ltd	KY-01003S	培養液用胎児ウシ血清サプリメント
目盛り付き歯周プローブ	Jinzhong Surgical instruments	K6F040	根の中央部からPDLをこそぎ取る際の補助
止血用鉗子	Jinzhong Surgical instruments	J31130	スキャン中に歯を固定する外科用器具
加湿インキュベーター	Thermo Fisher Scientific	Forma	37℃、5% CO2で維持される細胞培養インキュベーター
画像編集ソフトウェア	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	色選択用ソフトウェア
画像編集ソフトウェア	Wayne Rasband, National Institutes of Health	ImageJ2 v2.14.0	色しきい値用ソフトウェア
口腔内デジタルスキャナー	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	3Dデジタルモデル取得用光学スキャナー
局所麻酔	Produits Dentaires Pierre Rolland	Primacaine Articaine	歯科麻酔剤（例：アルチカインまたはリドカイン）
マイクロプレートリーダー	Biotek	Elx808	450 nmでのOD測定用分光光度計
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15070063	培養液用抗生物質サプリメント
ペリオトーム	Carl Martin	LS529PT	低侵襲抜歯器具
リバースエンジニアリングソフトウェア	Geomagic Inc.	Geomagic Studio 2013	表面積計算用3Dモデリングソフトウェア
滅菌遠心チューブ	Servicbio	EP-1500-J	サンプル収集および処理用プラスチックチューブ
滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	Gibco	10010	生物学的サンプル用洗浄バッファー
滅菌スカリペル刃	Jiayuan Medical Devices	Sterile Scalpel Blade	PDL組織こそぎ取り用刃
滅菌生理食塩水	Servicbio	G4702-500ML	抜歯した歯をすすぐための生理食塩水溶液
トルイジンブルー	一般実験室サプライヤー	トルイジンブルー（0.1%溶液）	歯周靭帯可視化用生物学的染色
トリプシン	Gibco	25200056	組織消化用酵素試薬