ゼブラフィッシュにおいて、安全な用量（≤200 µg/mL）のMolluginは、アポトーシス関連遺伝子の発現、炎症マーカー、抗酸化酵素活性、およびマクロファージ関連マーカーの変化を伴い、尾部の再生促進に関連していました。これらの知見は、Molluginがゼブラフィッシュの尾部再生過程における局所的な損傷応答を調節する可能性を示唆しています。
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研究記事
* These authors contributed equally
ゼブラフィッシュにおいて、安全な用量（≤200 µg/mL）のMolluginは、アポトーシス関連遺伝子の発現、炎症マーカー、抗酸化酵素活性、およびマクロファージ関連マーカーの変化を伴い、尾部の再生促進に関連していました。これらの知見は、Molluginがゼブラフィッシュの尾部再生過程における局所的な損傷応答を調節する可能性を示唆しています。
Molluginは、抗炎症作用および抗酸化作用が報告されている天然のナフトキノン化合物であるが、組織再生におけるその役割はまだ十分に解明されていない。本研究では、ゼブラフィッシュの尾切りモデルを用いて、Molluginが創傷治癒ならびに関連する免疫およびレドックス応答に及ぼす影響を調査した。尾部損傷後、ゼブラフィッシュ胚に22 µg/mL、66 µg/mL、および200 µg/mLの濃度のMolluginを投与した。Mollugin投与により、用量依存的に尾部の面積回復が改善し、それに伴いアポトーシス関連遺伝子の発現低下およびIL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、NF-κB1を含む前炎症性メディエーターの抑制が認められた。同時に、Molluginはスーパーオキシドディスムターゼおよびカタラーゼの抗酸化酵素活性を回復させた。Tg(mpeg1:GFP)ゼブラフィッシュを用いた蛍光イメージングでは、Molluginがマクロファージの集積に時間依存的な影響を及ぼすことが示され、24 hでは顕著な減少は見られなかったが、48 hにおいて66および200 µg/mL投与群では損傷モデル群と比較してマクロファージ陽性領域が減少していた。qRT-PCR解析ではさらに、M1関連マーカーであるiNOSの発現低下と、M2関連マーカーであるアルギナーゼ-1の発現上昇が示された。以上の結果は、Molluginが炎症、酸化ストレス、アポトーシス関連、およびマクロファージ関連マーカーの変化に関連して、ゼブラフィッシュの尾の再生を促進する可能性を示唆している。その根底にある細胞および分子メカニズムを定義するためには、さらなる研究が必要である。
組織再生は、細胞増殖、分化、および微小環境の恒常性維持の複雑な調節を伴う、生物が損傷を修復するための重要な生理学的プロセスである1。脊椎動物モデルの中で、ゼブラフィッシュは、その優れた再生能力から創傷修復メカニズムを研究するための極めて重要なシステムとなっている。特に、ゼブラフィッシュの尾鰭再生は、炎症調節、酸化応答のバランス、およびアポトーシス制御を含む複数の生物学的イベントの時空間的な協調を包含している2,3。近年、天然物の薬理活性が再生医療研究の焦点となっている。特にナフトキノン化合物は、その多様な生物学的効果から広く研究されてきた4。Molluginはアカネ科植物由来のナフトキノン化合物であり、先行研究において抗炎症作用、抗酸化作用、および細胞周期調節活性が示されている5,6。しかし、組織再生におけるその作用機序は依然として不明であり、炎症性微小環境の調節および免疫細胞の極性化における潜在的な役割について、体系的な調査が必要とされている。
損傷後、炎症が速やかに活性化され、組織修復に直接的な影響を与えます。適度な炎症シグナルは、壊死組織の除去と再生プログラムの開始に不可欠である一方、過剰な炎症カスケードは酸化ストレスを悪化させ、組織の線維化を招く可能性があります7。IL-1β、IL-6、TNF-αを含むサイトカインは損傷後に著しく増加し、TLR4/NF-κBシグナルの活性化を伴い、炎症反応の増幅と組織リモデリングを引き起こします8,9。細胞間接着分子-1（ICAM-1）およびCCケモカインリガンド2（CCL-2）も損傷後に上昇し、損傷組織への好中球およびマクロファージの動員増加に関連しています10。特に、酸化バランスの乱れは組織損傷をさらに悪化させ、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ（CAT）活性の低下は、抗酸化能の低下を示しています2,11。
マクロファージは炎症性微小環境の重要な調節因子として機能し、その機能的極性は再生プロセスに大きな影響を与えます12。M1マクロファージは誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の発現および炎症活性に関連しており、一方でM2マクロファージはアルギナーゼ-1（Arg-1）を発現し、組織修復に関連しています13,14。マクロファージの極性は、局所的なサイトカイン、酸化ストレス、およびアポトーシス関連シグナルによって影響を受けます。この文脈において、B-cell lymphoma-2（Bcl-2）ファミリータンパク質とcaspase-3で構成されるアポトーシス調節ネットワークは、損傷部位における細胞生存に影響を与えるだけでなく、"find-me"シグナルの放出を通じて、免疫細胞の走化性挙動を間接的に調節します15。したがって、炎症反応、酸化ストレス、およびマクロファージの極性を同時に調節する介入戦略を探索することは、組織再生の改善に役立つ可能性があります。
天然化合物は、これらの生物学的プロセスを調節する上で独自の有用性を示しています。近年の研究により、ナフトキノン物質は共役構造を持つため、フリーラジカルを消去する可能性があり、そのベンゾキノン核が電子伝達機構を介してレドックス感受性シグナル伝達経路に影響を及ぼすことが確認されています16,17。Molluginは、DSS誘発大腸炎における炎症反応を減弱させ、炎症性サイトカインの産生を抑制し、結腸組織におけるTLR4の発現を低下させることが報告されています18。また、MolluginはマクロファージにおいてTAK1-NF-κB/MAPKシグナル伝達を抑制し、Keap1-Nrf2経路を活性化することが示されていますが6、in vivoの創傷モデルにおけるマクロファージの分極およびアポトーシス・抗アポトーシスネットワークへの影響はまだ解明されていません。さらに、Molluginの用量依存的な生物学的効果および再生過程における調節的な役割については、依然として系統的な解明が必要です。
本研究では、ゼブラフィッシュの尾鰭再生モデルを用いてMolluginの効果を検討した。具体的には、Mollugin投与後の尾部の再生、アポトーシス関連遺伝子の発現、炎症性シグナル伝達、抗酸化酵素活性、およびマクロファージ関連反応について解析した。その結果、ゼブラフィッシュモデルにおいて、Mollugin投与は尾部の再生促進および複数の傷害応答マーカーの変化に関連していることが示唆された。
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すべての動物実験の手順は、米国国立研究評議会（National Research Council）の「実験動物の飼育および使用に関するガイドライン」に従い、福州第一総合病院の倫理委員会（承認番号：202408002）によって承認されました。
ゼブラフィッシュの繁殖
すべての実験は、標準的な実験室条件下で飼育されたゼブラフィッシュ(Danio rerio)を用いて行われました。毒性試験および尾切断再生試験には、野生型ABゼブラフィッシュを使用しました。マクロファージのイメージングには、特異的にTg(mpeg1:GFP)ゼブラフィッシュを使用しました。Tg(mpeg1:GFP)は、マクロファージで発現するmpeg1プロモーターの制御下でGFPが発現し、マクロファージ系細胞が標識されるリポーターラインです。すべてのゼブラフィッシュ系統は、28.5 °C、14時間明期/10時間暗期のサイクル条件下で維持されました。実験には、形態的に正常な胚のみを使用しました。すべての実験において、胚はDanieau緩衝液中でインキュベートしました。この緩衝液は、NaCl、KCl、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂O、およびpH 7.2に調整したHEPESを含む試薬グレードの化学物質を用いて調製しました。
薬剤の調製および安全性の判定
Mollugin (40 mg) を 1 mL の DMSO に溶解し、40 mg/mL のストック溶液を調製した。このストック溶液をまず Danieau's buffer で 1:10 に希釈して 4 mg/mL とし、さらに処理用に 22、66、および 200 µg/mL まで希釈した。最大安全濃度を判定するため、受精後 48 時間 (hpf) の AB 系胚の卵膜を除去し、0.003% 次亜塩素酸ナトリウムで消毒した後、6ウェルプレートに分配した (n=20、各群 3 ウェル)。胚を E3 Medium 中の Mollugin (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL, または 360 µg/mL) と共に、28.5 °C で 48 時間インキュベートした。実体顕微鏡下で生存率をモニタリングし、胚の生存率が 90% 以上であった最高濃度を、以降の実験における安全な上限値とした。
尾部切断および再生モデルの作製
再生研究のため、受精後48時間（hpf）の野生型AB胚を、胚用培地で調製した0.03%トリカインで麻酔し、実体顕微鏡下で側方に配置した。尾部切断前、胚はDanieau緩衝液中で維持した。実体顕微鏡の誘導の下で、標準的な尾部の横断切断を行った。切断線は、脊索の末端を解剖学的指標として、その直後に設定した。個体間で損傷レベルを一定にするため、この指標より遠位の尾鰭褶曲をマイクロメスで除去した。切断直後（0 h）に、立体蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影した。切断後、再生アッセイのために胚を対応するE3ベースの処理培地に移した。Mollugin作動液は、Molluginストック溶液をE3培地で希釈し、最終濃度を22、66、および200 µg/mLとして調製した。Molluginは、再生期間中に浴浸法で投与した。溶媒曝露条件を合わせるため、非損傷コントロール群および損傷モデル群は、200 µg/mL Mollugin群の最終DMSO濃度に相当する0.5% DMSO含有E3培地で維持した。胚は6ウェルプレートを用い、28.5 °Cで2日間維持し、対応するE3ベースの処理培地を毎日更新した。再生の経過は、切断後24時間および48時間に、白色光および蛍光の両設定で撮影し、尾部の再成長とマクロファージの分布を評価した。画像の測定はImageJを用いて行った。
再生の定量化において、回復した尾部の面積は µm2 の絶対面積として測定し、胚のサイズや元の尾部のサイズによる標準化は行わなかった。ばらつきを最小限に抑えるため、すべての胚を脊索先端の直後にある同一の解剖学的指標で切断し、グループ間で測定領域を定義するためにも同じ指標を用いた。関心領域（ROI）は、尾部の輪郭に基づき ImageJ で手動で設定し、解析は処理グループを知らされていない研究者が行った。マクロファージ陽性面積の定量化では、Tg(mpeg1:GFP) 胚の GFP 蛍光画像を ImageJ で解析した。尾部の損傷・再生領域は、尾部面積の測定に用いたものと同じ解剖学的指標を用いて、関心領域として手動で定義した。画像を 8 ビットのグレースケールに変換し、同一実験内のすべての画像に対して同じ背景補正設定を用いて背景蛍光を差し引いた。その後、各実験内のすべての画像に一定の蛍光しきい値を一様に適用し、GFP 陽性のマクロファージ関連シグナルを特定した。マクロファージ陽性面積は、定義された ROI 内のしきい値陽性 GFP 面積として算出した。測定は、蛍光強度や手動の細胞計数ではなく、蛍光陽性面積に基づいて行った。すべての画像解析は、処理グループを知らされていない研究者が行った。
RNA抽出および定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）
再生アッセイの完了後、各実験条件の胚を回収し、RNA分析のためにプールした（1グループあたり少なくとも20個の胚）。各条件において、1つの生物学的反復は、同一の実験グループから少なくとも20個の胚を含むプールサンプルで構成した。各条件につき3つの独立したプール生物学的反復を調製し、統計分析に使用した。フェノール/グアニジンベースのRNA抽出試薬を用いて機械的ホモジナイズを行った後、全RNAを単離した。RNAの品質と濃度は、A260/A280比を測定することで分光光度計により評価した。市販の逆転写キットを用いてcDNAを合成した。PCR増幅はSYBR Green試薬を用いて行った。qRT-PCRのサイクル条件は以下の通りとした：95 °Cで30 sの初期変性後、95 °Cで5 sの変性と60 °Cで30 sのアニーリング/伸長を40サイクル繰り返した。アポトーシス（caspase-3およびBcl-2）、炎症（TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB1、TLR4、CCL2、およびICAM1）、およびマクロファージ表現型（iNOSおよびarginase-1）に関連する遺伝子の発現レベルを測定した。β-Actinをリファレンス遺伝子として用いた。遺伝子発現のフォールドチェンジは2−ΔΔCt法を用いて算出した。プライマー情報は表1に記載している。
SODおよびCATの活性測定
尾部損傷後の抗酸化状態を評価するために、SODおよびCATレベルを測定した。切断から48時間後に、各群のゼブラフィッシュを回収し、冷PBS中でホモジナイズした。遠心分離後、上清抽出液を用いて市販の活性測定キットによりSODおよびCATの測定を行った。SOD活性は、製造元の指示に従い、WST-1ベースのアッセイキットを用いて測定した。試料を標準試料とともに96ウェルアッセイプレートに分注し、マイクロプレートリーダーで吸光度を読み取った。酵素活性は標準曲線から算出した。すべての測定は3回繰り返し（triplicate）で行った。
統計解析
データは、少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値 ± SEM として示している。毒性アッセイでは、1回の独立した実験を1つの胚バッチとし、1グループあたり20個の胚を用い、3ウェルでn=3とした。Tg(mpeg1:GFP)ゼブラフィッシュにおける再生イメージングおよびマクロファージイメージングでは、個々の胚を測定単位とし、1グループあたり10個の胚を解析した。qRT-PCR解析では、1つの生物学的反復（biological replicate）を、同一実験グループの少なくとも20個の胚を含むプールサンプルとし、1条件あたり3つの独立したプール生物学的反復を解析した。SODおよびCAT活性解析では、1条件あたり5つの独立したプール生物学的反復を解析した。グループ間の差は、Tukeyのポストホックテストを用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）により解析した。統計解析にはGraphPad Prismを使用した。p < 0.05 の差を統計的に有意とみなした。
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毒性および安全投与量の決定
Molluginの影響を調べるため、まず毒性試験を実施した。その結果、ゼブラフィッシュ胚の死亡率は200 µg/mLまでの濃度では低く抑えられていたが、200 µg/mLを超える濃度では死亡率の上昇が認められた（表2）。したがって、最高安全投与量を200 µg/mLと決定し、低用量および中用量をそれぞれ22 µg/mLおよび66 µg/mLに設定した。
尾部切断モデルの作製と尾部領域の早期回復評価
次に、受精後 48 hpf の野生型 AB ゼブラフィッシュを用いて尾部切断モデルを作製し、顕微鏡観察によりモデルの構築が成功したことを確認した（Figure 1）。その後、安全な用量の Mollugin をモデル群に投与した。切断後 24 h において、200 µg/mL の Mollugin 投与は、損傷モデル群と比較して尾部回復領域の増加に関連していた（P < 0.01）。...
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本研究では、ゼブラフィッシュの尾鰭再生におけるMolluginの効果を検討しました。テストした用量範囲において、Mollugin処置は、損傷後の尾鰭面積の回復改善に関連しており、同時にアポトーシス関連遺伝子の発現、炎症マーカー、抗酸化酵素活性、およびマクロファージ関連マーカーの変化が認められました。
再生研究の重要なモデルであるゼブラフィッシュでは、複数のシグナリング経路の協調的な作用を伴う尾部の再生が見られます19。損傷後、caspase-3レベルが上昇し、Bcl-2の発現が減少したことは、アポトーシスの亢進を示しています。このアポトーシスの過剰な活性化は、再生細胞のプールを枯渇させるだけでなく、二次的な炎症反応を悪化させ、さらなる組織損傷を招きます20,21。Molluginによる処理はアポトーシスマーカーのバランスを回復させたことから、過剰なcaspase-3活性を抑制するか、あるいはBcl-2の保護効果を増強し...
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著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。
本研究は、中国福建省衛生健康委員会（助成金番号 2022QNA085）の支援を受けて実施されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6ウェル組織培養プレート | Corning | 3516 | |
| カタラーゼ (CAT) アッセイキット | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| クロロホルム | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| CMax Plus マイクロプレートリーダー | Molecular Devices | iD3s | |
| Danieau’緩衝液 – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’緩衝液中の最終濃度: 0.6 mM。 |
| Danieau’緩衝液 – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’緩衝液中の最終濃度: 5 mM; pH 7.2に調整。 |
| Danieau’緩衝液 – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’緩衝液中の最終濃度: 0.7 mM。 |
| Danieau’緩衝液 – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’緩衝液中の最終濃度: 0.4 mM。 |
| Danieau’緩衝液 – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’緩衝液中の最終濃度: 58 mM。 |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E3 胚培養培地 | ラボ調製 (標準レシピ) | N/A | 標準レシピ。 |
| 遺伝子特異的 qPCR プライマー (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actin) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | Version 8.0。 |
| ImageJ ソフトウェア | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Version 1.52n。 |
| Mollugin (≥98%, HPLC) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Rubia cordifolia由来の活性化合物。DMSOに溶解して40 mg/mLとし、E3培地で22、66、200 µg/mLに希釈して使用。 |
| 電動組織ホモジナイザー | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (または同等品) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| リアルタイム PCR システム (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| 冷却マイクロ遠心機 | SCILOGEX | CF1524R | |
| RNAフリーチップ | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | フェノール/グアニジンベースのRNA抽出試薬。 |
| RNaseフリーマイクロ遠心チューブ, 1.5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| SMZ800N 蛍光実体顕微鏡 | Nikon | SMZ800N | Tg(mpeg1:GFP) 稚魚のイメージングおよびマクロファージ凝集の定量に使用した蛍光実体顕微鏡。 |
| 次亜塩素酸ナトリウム溶液 | McLean, USA | N/A | 0.003% 使用溶液。 |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| SZX16 実体顕微鏡 | Olympus | SZX16 | 稚魚の形態観察、毒性評価、および尾鰭切断に使用。 |
| 全スーパーオキシドディスムターゼ (T-SOD) アッセイキット | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 | |
| トランスジェニックゼブラフィッシュ Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (または自社コロニー) | N/A | マクロファージレポーターライン。 |
| トリカインメタンスルホナート (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | 0.03% 使用溶液。 |
| UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水 | Invitrogen | 10977023 | |
| 野生型ゼブラフィッシュ, CZ98系統 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | 受精卵および稚魚は成魚の繁殖ストックから得た。 |
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