ピンミオグラフィーを用いたマウス大動脈内在性硬直の評価:循環環境の影響を問い直すための翻訳的枠組み

サマリー

ここでは、ピンミオグラフィーを用いた大動脈内因性壁剛性(弾性弾性率)を評価するプロトコルと、大動脈内因性壁剛性の調節における循環環境の役割を検証するアプローチを提示します。

要約

大動脈硬直は、心血管疾患や認知機能低下、腎機能障害、視力障害、グルコース・インスリン機能低下などの慢性疾患の独立したリスク因子です。 生体内では、大動脈硬直は一般的に、動脈波形や縦動脈区間を視覚化するトノメトリーまたは超音波を用いた技術で評価されます。しかし、 生体内 での測定は動脈圧や自律神経入力など複数の要因に影響されており、大動脈硬性がどのように、なぜ変化するのかについての機論的な洞察を制限しています。大動脈組織を直接取得できる前臨床マウスモデルは、生 体内 の大動脈硬性と大動脈の内在的な力学的特性を交絡させる生理学的変数なしに評価する独自の実験的枠組みを提供します。これらのモデルはまた、循環環境(すなわち血流中の循環生物活性分子の収集)と、その大動脈硬性の調節における役割を、前臨床から臨床へのトランスレーショナルスペクトラム全体で直接検証することを可能にします。循環環境の変化は、がんやがん治療に関連する原発性老化や早期老化を含む多くの疾患における大動脈硬化の重要なメカニズム的基盤として浮上しており、前臨床試験および臨床試験、さらに介入効果の媒介においても明らかになっています。本記事では、(1) 前臨床マウスモデルにおける内在性大動脈剛性(弾性弾性率)の評価のためのステップバイステップガイドを提供します。(2) 前臨床および臨床検体の両方を用いて、循環環境(およびその構成要素)が大動脈硬化に寄与していることを評価します。

概要

大動脈硬化は心血管疾患およびその他の慢性疾患の独立したリスク因子です^1,2。大動脈の硬さを体内で評価することは、動脈の硬さを調節する統合的な生理学的プロセス(例:血圧や自律神経入力)を考慮すると、生体内での機構的な解決が得られないことがあります²。したがって、ピンマイオグラフィーを用いた大動脈内在性硬直(すなわち大動脈壁剛性/弾性率)を体外で評価することで、交絡する生理的変数に依存しない大動脈硬直性を直接評価する機会が得られます².さらに、生体外実験アプローチの用いにより、大動脈壁の硬化を媒介する可能性のある分子メカニズムの検証が可能になります。圧力筋伝記法、二軸平面検査、周期的・脈動性筋写法システムなど、生理学的モデル(例:腔内圧や脈動性血行動態)に依存する他の確立された動脈硬さ評価方法とは異なり、ピン筋伝記は生体内モデルを必要としない高度に制御された環境下で、等長力を用いて大動脈壁剛性を直接評価することを可能にします。

大動脈に直接かつ頻繁に接触する循環環境(すなわち血流中の生物活性分子の集合)は、大動脈硬化の状況(例:がん生存者やがん生存者のモデルなど、年代的・一次加老や早期老化)で一般的に変化します^3,4。前臨床(マウス)および臨床(ヒト)生体検体(血漿および血清)の両方を用いて、循環環境がプライマ^リー4および^{早期老化3}の大動脈硬化に直接寄与していることを確立しました。さらに、循環環境内で特定の成分が大動脈硬性への影響を媒介する直接的な寄与を明らかにする実験的枠組みを^{確立しました。}ここでは、ピンミオグラフィーを用いて大動脈固性の評価と循環環境(およびその構成要素)の大動脈硬化への寄与を段階的に検証する実験的アプローチを概説し、代表的な結果(図と引用付き)を提供します。

プロトコル

本研究では、野生型C57BL/6Jの若年成体(生後4か月)マウスを用いました。実験用マウスの飼育および処置は、コロラド大学アンシュッツ医科キャンパス施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 冷生理食塩水(CPSS)の調製

1. Ca²⁺ リンガーストック溶液を1リットルのDiH₂Oに準備し、4°Cで保存します(表1参照)。
2. 13.9gのMOPSを100mLのDiH_2Oに加え、MOPSバッファーストック溶液を準備し、4°Cで保存します。
3. EDTAを100 mLのdiH₂Oに0.186 gを加えてEDTAストック溶液を準備し、pHを8.0にして室温で保存します。
4. 上記の原料溶液および以下に記載された化学物質を含むCPSSを準備します(表2)。総容量を2Lにし、diH_2O、pHを7.4、34°Cで、≤0.45μmフィルターでCPSSをろ過します。50mLの円錐形チューブに分散し、-20°Cで保存します。

2. マウス大動脈の解離(図1、図2、図3)

1. イソフルラン(2.5%)を吸入して麻酔し、マウスを背側に横たわる姿勢に置きます(図1A-C)。
2. マウスが麻酔の手術面下に入ったら、心臓穿刺を行い、両側開胸術による二次安楽死法を完全に行って血液を採取します(図1B–C)。
3. 次に、慎重に大動脈を大動脈弓から腹部大動脈へと取り外します(図1D–F)。
4. 大動脈をCPSSに置き、Fine Science ToolsのVannasスプリングシザーズ(2.5mm)を使って結合組織および血管周囲脂肪組織をすべて除去します(図2A–E)。
5. 大動脈弓のすぐ下の胸部領域に幅1mmの大動脈セグメントを慎重に3つ切開します(図3)。
6. 2つの1 mm大動脈セグメントをCPSSで満たした1.5 mLチューブに入れ、-80°Cで保存し、ストレスストレスピンのミオグラフィー実験を行います。第^{3セグメントは} 、以下の組織学的測定のために適切に保管してください。

3. ストレスストレインピン筋伝学実験

注:ピンミオグラフィーシステムは、大動脈硬さの in vitro 検査に使用されます(図4 および 図5参照)。

1. まず、約6mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むチャンバーを37°Cに予熱し、凍結した1mmの大動脈区画を解凍します。
   注:適度に酸素を含みpHが制御された代替生理用塩溶液も^{前述のように}使用されることがあります。
2. 37°Cが得られたら、メーカーの校正プロトコルに従います。
   1. キャリブレーションブリッジをマイオグラフに置き、Tバランスバーがピンマイオグラフィーチャンバーのフォーストランスデューサーに接続されたピンに触れないようにします。
   2. フォーストランスデューサーピンが力を受けていないことを確認してください。相対力が安定したら、Tブリッジに2gの重りを置き、Tバランスバーがフォーストランスデューサーピンに~2gの力を加えるようにします。
   3. 力の読み取り値が9.71〜9.91 mN以内にあるか確認してください。もしそうなら、キャリブレーションは完了です。
3. 基準となるマイクロメーターの読み取り値と記録値(すなわち初期読み取り値)を測定します。
   1. 解剖用スコープで、2本の平行ピンがほぼ接触する基準ミクロメートル距離を決定します(図4)。
      注意:2つのピンが接触しないようにしてください。これは筋グラフチャンバー内の力トランスデューサーを損傷または妨害する可能性があります。
4. 解離顕微鏡の下で、1mmの大動脈セグメントを2つのピンの上に置き、マイクロキャリパーでセグメントの幅を記録します(図6A)。その後、チャンバーユニットをピンマイオグラフィーシステムのインターフェースに接続します。
   注意:大動脈を2つのピンに固定する際に、ピン幅を広げて大動脈セグメントに張力をかけ、大動脈セグメントが外れるのを防ぎます。
5. 大動脈に張力がかかり、チャンバーがピン筋撮影システムに接続・取り付けられた場合は、上記のステップ3.3で決定した「初期位置」に戻します。
6. 大動脈の完全なプレストレッチ。
   1. 2つのピン間の距離を初期のマイクロポジショナー位置から1 mm増やして大動脈を伸ばします(図6B)。
   2. 次に、ピンを元のマイクロポジショナーの読み取り値に戻して大動脈をリラックスさせます。このストレッチ-リラクレーションシーケンスを3回行います(図6A)。
      注意:最後のストレッチ-リラクシーケンスの後、マイクロポジショナーは最初の測定値に戻るはずです。
7. ピンミオグラフィーシステムのインターフェースでは、使用中の各チャンバーでゼロ力の読み取りができます(図7)。
8. ストレスストレス実験を開始。
   1. マイクロポジショナーを調整することで、力の読み取り値を約1 mNに増加させます(図7)。
   2. ~1 mN力の平衡(3〜5秒)後に、新しいマイクロポジショナーの読み取り値を~1 mNの力で記録し、最初の力の読み取り値を記録します。
   3. マイクロポジショナーを50μm(すなわち5クリック/ハッシュ)増やし、大動脈セグメントを3分間伸ばします。3分後、記録的な力。
   4. マイクロポジショナーを3分ごとに50μmずつ増やし、「降伏点」に達するまで力を記録し続けます。
      注意:降伏点とは、大動脈に不可逆的な構造的損傷(すなわち大動脈の裂け目や骨折、力の大幅な低下)が起こる前に発生する最大の力のことです。
   5. 初期降伏点の後、大動脈をさらに50μm伸ばして収縮点を確認します。力の値は降伏点より低くするか、やや上にあることを確認してください。イールドポイントが確定しない場合は、イールドポイントに達するまで3分間の増やしを続けます。
   6. 降伏点が確認されれば、実験は完了します。今すぐ分析を始めろ。

4. 応力ひずみピンミオグラフィー実験の解析:コラーゲンおよびエラスチン領域の弾性率を決定するため

1. 筋写儀から得られた力の読み取り値を用いて、以下の式を用いて応力-ひずみ曲線を生成します。
   ひずみ (λ)=∆d/[d(i)]
   ここで d は直径、 d_i は初直径であり、
   応力(t)=λL/[2(HD)]
   ここでLは一次元荷重、Hは内層媒体の厚さ、Dは容器長です。応力-ひずみ曲線が生成されたら、それを使って前述の^8,9(図8)で説明したように、高力領域と低力領域を計算します。
2. 高力領域(コラーゲン領域)(図8B)を計算します。
   1. 応力-ひずみ曲線の弾性率を、応力-ひずみ曲線の最後の4点への線形回帰フィットの傾きとして求めます。応力-ひずみグラフから高強度の測定を得るには、以下の手順に従ってください。
      1. グラフ上のデータポイントを右クリックし、「 データを選択し 」>「 追加 >系列 名を入力してください:弾性率。
      2. シリーズX値:ひずみ値から4つのデータポイントを選択します。力が「降伏点」に近づくときの3つのポイントであるべきです。4つ目のポイントとして降伏点を含めてください。
      3. シリーズY値:応力値から4つのデータポイントを選択します。力が「降伏点」に近づくときの3つのポイントであるべきです。4つ目のポイントとして降伏点を含めてください。
      4. OKをクリックして、チャート>トレンドラインを追加>表示式>チャートにR二乗値を表示します。
   2. 方程式の傾きは高力弾性率です。弾性率を正確にするためには、R二乗値を0.99≥してください。
3. 低力領域(エラスチン領域)(図8C)を計算します。
   1. 7次多項式方程式(r² > 0.99)をデータに当てはめ、その方程式の根を計算することで、応力-ひずみ曲線のエラスチン優勢領域(低力領域)の境界を決定します。最初の根は、非常に低い力領域とエラスチン領域の境界であり、第二の根はエラスチン領域とコラーゲン繊維の結合開始の境界を考えます。
   2. 次に、線形方程式の傾きが2つの根^8,9間の応力-ひずみデータにフィットする傾きとして、低力領域の弾性率を求める。これを得るために:
      1. 補足表1に示された列を含むスプレッドシートを作成しましょう。
      2. これを「txt」ドキュメントにして、Rコードソフトの「Modulus of Elasticity」Rスクリプトで開いてください。
      3. データを使うためには、正規傾きを確認してください。R出力の3^次 微分グラフは「M」の形をしているべきです。
      4. 結果タブでは、傾き列の下の数値は弾性率です。弾性率を正確に測るためには、R二乗値が0.99以上であることを確認しましょう。
      5. この値をスプレッドシートで取得するには、 Rコードの結果 タブから得られる1微分と2微分の間のひずみ値(およびそれに対応する応力値)を選択します。
      6. ステップ4.2で示された手順に従って、式とスプレッドシートのグラフ上のR² 値を取得します。

5. 大動脈径と壁厚の評価

1. 最後の1mmの大動脈セグメントを最適切断温度(OCT)化合物で満たしたクライオモルドに入れます。リングをルーメンを平らにし、金型の底部に中心にし、光軸が切断面に垂直になるように配置することで横断面が得られます。
2. 液体窒素で冷却した2-メチルブタンの容器を準備し、その後、冷たい2-メチルブタンにクリオモルドを浸し、OCTが不透明な白色になるまで浸します。
3. クライオモルドは-80°Cで保存し、切片するまで保管してください。クライオスタット温度を適切なOCT切断温度(≈-20°C)に設定し、凍結ブロックを試料ホルダーに取り付けます。
4. マウントに固定されたら、厚さを7μmに保ちながら慎重にブロックをトリミングし、組織が現れるまで調整します。
5. マウスIDをスライドにラベル付けし、大動脈組織の横切片を7μmで4〜5本切断します。
6. スライスした組織をスライドに移すには、切断したすべての断片をクライオスタットステージ(ナイフステージとも呼ばれる)に置き、その後ラベル付きのスライドを直接その上に置きます。
7. 転写が完了したら、自然乾燥でスライドします。
8. 明視野顕微鏡で10倍倍の画像断片を撮影します。画像はJPG/TIFF形式に保存し、画像の下部にスケールバーを付けます。
9. 解析のために、ImageJを開き、 ファイル > を開く ことから大動脈画像を選択してください。
10. 大動脈画像が表示されたら、 Control + + アイコンでスケールバーにズームインし、ラインツールでスケールバーの長さを測定します。結果を入力するには 、Control+Mを押してください。長さで計算される測定値がスケールバーの測定値です。
11. ソフトウェアのキャリブレーションは「 Analyze > Set Scale」にアクセスしてください。 距離(ピクセル単位)については、 ステップ8でImageJが計算した線の長さを入力します。 既知距離 にはスケールバーの実際の長さを入力し、 単位 の下に単位(μm、mm、cmなど)を記入します。
12. グローバル ボックスに チェックを入れて、その後のすべての画像を自動的にキャリブレーションします。他の画像のスケールバーが異なるか、またはImageJが閉じているかに注目してください。もしそうなら、再調整が必要です。
13. 壁の厚さについては、 直線 ツールを使い、光の端から外側の陰茎の縁まで垂直な線を引いてください。 Ctrl + M を押すと 、結果 タブで長さを自動で入力できます。
14. ステップ5.13を繰り返し、大動脈周囲の6つの均等間隔の位置で測定を行い、それぞれの値を記録します。
15. マウスごとの平均大動脈厚さを計算するには、同じマウスの4〜5サンプルから得られたすべての厚さを平均します。
16. 光径を測定するには、 ポリゴン ツールを選択して内側の光の境界を時計回りになぞります。 Control + Mを押して周囲(μm)を記録します。
17. 反時計回りにトレースを繰り返し、別の地点から始めます。2つの周囲値が近いものにして、その大動脈環で平均してください。
18. 同じマウスの4〜5個の大動脈サンプルに対してステップ5.16を繰り返し、すべての周囲値の平均を取る。
19. 直径を計算するには、次の式を用います:直径(μm)=周長/3.14。

6. 循環環境媒介大動脈弾性弾性率

注:循環因子や特定の化合物が内因性大動脈硬直に影響を与えるかどうかを明らかにするために、介入未経験マウスの胸大動脈環を、定義された標準培養条件下(37°C、5%_CO2、20%_O2、加湿)下で体外培養可能です(図9)。

1. 胸大動脈を切り離し、各疾患ごとに1mmのリングセグメントを2つ切断します。血管周囲脂肪組織をすべて除去してください。
2. 96ウェルプレートで、大動脈環をDMEM + 1%ペニシリン-ストレプトマイシンからなる標準培地で培養します。
3. 培地に実験的な処理を加えましょう。血漿や血清(未処理の血漿や血清でも使用可能です)には、全培地の10%を使用します。前臨床および臨床(ヒト)血漿または血清^3,4,6を使用します(図9)。
4. 研究グループ間で異なることが示された循環因子の因果関係を確立するために、血漿・血清曝露を繰り返し、同時にグループ間の濃度差を補正(すなわち関心因子の濃度を正規化)し、平均的なグループ差を表す濃度における関心因子の直接的な効果を決定します。 または、循環環境の効果を媒介すると考えられる因子のシグナル伝達を遮断することもあります。
   注:後者2つのアプローチは、それぞれトリメチルアミンN-オキシド(TMAO)⁵ および高度な糖化^最終産物に対する受容体の遮断で以前に実施されていました。
5. 過剰な超酸化物関連の酸化ストレスやミトコンドリアの役割を明らかにするために-
   このモデル系における特定の超酸化物関連酸化ストレスでは、大動脈環をキュベートする際に以下の濃度を使用します:TEMPOL:1 μM ^5,10 および MitoQ:1 μM⁶。
6. 48〜72時間の潜伏後、大動脈リングをピン筋グラフに積み込み、上記の手順に従います。

結果

加齢による大動脈硬化

内在的な機械剛性については、各伸縮間隔に対応する力が記録され、計算に用いられます。前述の計算では、応力-ひずみ曲線を作成し、上記のように1) コラーゲン領域および/または2) エラスチン領域の弾性率を計算^{します。これは}上記の通りで、Gioscia-Ryanらが最初に示した9。応力ひずみ曲線のよりコラーゲン優勢な領域の弾性弾性率は、応力ひずみ曲線8,9,11,12,13の最後の4点に当てはめた線形方程式の傾きとして決定されます。応力-ひずみ曲線のエラスチン優勢領域(低力領域)は、7次多項式方...

ディスカッション

ピンミオグラフィーを用いた大動脈内因性硬直の評価は、血圧や自律神経入力など生体内生理学的変数を介さずに評価する機会を提供します^。さらに、この生体外実験的アプローチは、大動脈内在性剛性の違いの基礎となる可能性のある分子メカニズムをスクリーニングする機会を提供します。ここでは、ピンミオグラフィーを用いた大動脈内因性硬さの評価に関するステップバイステップガイドを提供し、この手法で以前に発表した代表的な結果を紹介しました。さらに、前臨床および臨床の生体試料を用いて循環環境が大動脈内因性硬さの調節に果たす役割を検証する方法、そして大動脈内因性硬さの差異を生み出す循環内の選択因子の因果関係をどのように確立するかについても詳細な指示を提供しています。

以前に、27か月齢の老年型野生型C57BL/6Nマウスから採取した大動脈において、大動脈剛性のコラーゲン領域(すなわちコラーゲン大動脈弾性率)とエラスチン領域(エラスチン大動脈弾性...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メチルブタン	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
塩化カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-グルコース（デキストロース）	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA（A.C.S.）	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
硫酸マグネシウムヘプタ水和物	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
一水素リン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS（Na塩）	Sigma-Aldrich	M9024
マルチピン筋膜測定システム	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
ペニシリン-ストレプトマイシン	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE抗体	R&D System	AF1145
ピルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Tissue-tek OCT化合物	Sakura	4583
トリメチルアミンN-オキシド（TMAO）	Sigma Aldrich	317594