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研究記事

乳がんにおけるMPO発現と免疫微小環境の関連：バイオインフォマティクスおよびシングルセル解析による知見

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DOI:

10.3791/71189

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2026年8月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本論文では、乳がんにおけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）の発現と免疫・骨髄系特性との関連性を探索するための、再現可能なバイオインフォマティクスおよびシングルセルワークフローを提示します。これらの解析は公開データセットおよびin silico手法に基づいているため、得られた知見は探索的であり、仮説を生成するものとして解釈されます。

要約

乳がんは依然としてがん関連死亡の主要な原因であり、探索的な計算ワークフローは、さらなる調査に向けた免疫関連マーカーの優先順位付けに有用です。本研究では、The Cancer Genome Atlas breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA) のバルクトランスクリプトームデータおよび公開シングルセルデータセットGSE161529を用い、ミエロペルオキシダーゼ (MPO) 発現と、臨床転帰、免疫浸潤、メチル化、上流レギュレーターアノテーション、シングルセル発現パターン、仮想ノックダウン感度出力、薬物-遺伝子相互作用リトリーバル、および吸収・分布・代謝・排泄・毒性 (ADMET) アノテーションとの関連性を検討しました。MPO発現は、隣接する非腫瘍組織よりも乳がん組織で低い値を示しました。MPOの高発現は無増悪生存期間の延長と関連していましたが、全生存期間および疾患特異的生存期間との関連に統計的な有意差は認められませんでした。受信者動作特性 (ROC) 解析は、解析した公開データセット内での腫瘍と正常組織の分離を示唆しましたが、これは臨床的な診断的検証として解釈されるべきではありません。免疫デコンボリューションおよび濃縮解析の結果、MPO発現は主に免疫および骨髄系に関連する転写特徴と連動しており、腫瘍固有の免疫微小環境調節を確立しているわけではないことが示されました。シングルセル解像度ではMPOシグナルは希薄であり、k-nearest neighbor (KNN) に基づく近傍拡張の前では、わずか85個のMPO陽性細胞のみが検出されました。検出可能なMPOシグナルおよびMPO関連スコアは、希薄な発現、細胞型アノテーションの不確実性、ドロップアウト、ダブレット、または周囲のRNAの影響を受けている可能性があるため、慎重に解釈されました。In silico 仮想ノックダウンは、候補となる免疫および炎症関連の転写変化を示唆しましたが、これらの結果は探索的なものであると考えられ、検証が必要です。Drug-gene interaction database (DGIdb) に基づく薬物-遺伝子リトリーバルおよびADMETアノテーションは、予備的な化学アノテーションとしてのみ使用され、治療的根拠として解釈されたものではありません。総じて、本研究は乳がんにおけるMPO関連の免疫/骨髄系特徴に関する仮説を生成するための再現可能なin silicoワークフローを提供しており、これらは外部コホートでの検証および実験的な確認を必要とします。

概要

乳がんは高度に不均一な免疫関連悪性腫瘍である1。その病勢進行、再発および転移のリスク、そして治療反応性は、腫瘍免疫微小環境（TIME）の組成および機能状態と密接に関連している2。包括的な治療戦略の最適化が進められているにもかかわらず、一部の患者では依然として進行や再発が見られ、TIMEの状態を特徴づけ、リスク層別化を支援する分子バイオマーカーの同定と、その根底にあるメカニズムの解明が急務となっている。

ミエロペルオキシダーゼ（MPO）は、主に好中球に、また少量ながら単球やマクロファージに発現しているヘム含有ペルオキシダーゼである。MPOは、次亜塩素酸やその他の反応性酸化剤を生成することで抗菌防御に寄与するが、酸化的な組織損傷や慢性炎症を促進する場合もある。がんにおいて、MPOの生物学的意義はコンテキストに依存すると考えられている3。一方で、MPO介在性の酸化ストレスは、DNA損傷、脂質およびタンパク質の酸化、炎症性シグナル伝達、ならびに腫瘍微小環境のリモデリングを通じて、発がんや腫瘍の進展に関与していることが示唆されている4,5,6。その一方で、特定の腫瘍コンテキストにおいては、MPO陽性の自然免疫細胞または骨髄系細胞の浸潤が、良好な予後や抗腫瘍免疫活性に関連している。 7,8,9。これらの一見相反する知見は、MPOの臨床的および生物学的意義が、腫瘍の種類、疾患ステージ、MPOの細胞源、および腫瘍微小環境の免疫組成に依存している可能性を示唆している。しかし、乳がんにおけるMPOの発現パターンおよび予後との関連性、特に単一細胞レベルでの解析については、まだ十分に解明されていない。

腫瘍免疫微小環境（TIME）には、不均一な骨髄系、リンパ系、間質系、および上皮系のコンパートメントが含まれています10。MPOは一般的に好中球やその他の骨髄系細胞に関連しており、バルク腫瘍プロファイルにおけるMPO関連シグナルは、腫瘍細胞固有の活性よりもむしろ免疫細胞組成を反映している可能性があります10。乳がにおいて、バルクおよびシングルセルデータセットにおけるMPOシグナルの分布、免疫浸潤推定値との関連、および後続の計算解析の再現性限界については、まだ十分に特徴付けられていません。したがって、本研究では、MPOを探索的なワークフロー開発のための免疫関連マーカーとして扱い、TIMEの証明された因果的調節因子や検証済みの治療標的としては扱いません。単一コホートの差分的発現解析や単一プラットフォームの免疫浸潤推定と比較して、バルクトランスクリプトミクス、免疫デコンボリューション、メチル化アノテーション、シングルセルマッピング、および計算的摂動を組み合わせた統合ワークフローは、遺伝子に関連する免疫コンテキストについて、より広範な探索的視点を提供できます。このアプローチは、特に実験的なデータセットがまだ利用できない場合に、候補マーカーの優先順位付けや検証可能な仮説の構築に有用です。しかし、このような計算的な統合だけでは、細胞源、因果関係、薬理活性、または臨床的有用性を決定することはできません。大規模な公開がんコホートとシングルセル・トランスクリプトーム技術の進歩により、バイオインフォマティクス的手法を用いて、集団レベルおよびシングルセルレベルの両方で、遺伝子発現、臨床転帰、免疫細胞組成、および転写状態の間の関連性を探索することが可能になります11。シングルセル遺伝子調節ネットワークに基づく計算的摂動法は、遺伝子に関連する転写感受性に関する仮説生成のための情報をさらに提供できる可能性があります12,13。したがって、本研究は、乳がんにおけるMPOの発現パターン、生存との関連、免疫/骨髄系コンテキスト、メチル化プロファイル、シングルセル分布、および探索的な計算的摂動プロファイルを特徴付けることを目的としました。全体のワークフローを図1に示します。

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プロトコル

TCGAデータベースからの取得

TCGA乳管浸潤癌（TCGA-BRCA）コホートのRNAシーケンシングデータおよび臨床情報は、genomic data commons portal14から取得した。STARワークフローによるtranscripts per million (TPM)形式のRNA-seqデータと、それに対応する臨床アノテーションを抽出した。対応する臨床情報がないRNA-seqサンプルは除外した。発現ベースの解析にあたり、TPM値はlog2(TPM + 1)として変換した。MPOの発現量は、遺伝子シンボルMPOおよびEnsembl遺伝子ID ENSG00000005381.8を用いて抽出した。MPO高発現群（MPO-high）とMPO低発現群（MPO-low）のグループ分けが必要な解析では、TCGA-BRCAの腫瘍サンプルのみを含め、隣接する正常サンプルはグループ割り当てから除外した。腫瘍サンプルは、TCGA-BRCA腫瘍サンプルにおけるlog2(TPM + 1)変換後のMPO発現量の中央値に基づいて分割した。中央値以上のMPO発現を示すサンプルをMPO-high群に、中央値未満のサンプルをMPO-low群に割り当てた。特に断りのない限り、この中央値に基づくグループ化戦略を、生存解析、差分的発現解析、エンリッチメント解析、メチル化グループ化、および免疫細胞エンリッチメント比較に使用した。性別、年齢、民族、病理学的Tステージ、組織学的グレード、PAM50サブタイプ、病理学的ステージ、腫瘍の状態などの臨床病理学的特性、および全生存期間 (OS)、無増悪期間 (PFI)、疾患特異的生存期間 (DSS) などの生存エンドポイントの解析には、R version 4.2.1を使用した。

公開免疫組織化学画像検索

定性的なタンパク質レベルの参照として、隣接する正常乳腺組織および乳がん組織の代表的なMPO免疫組織化学（IHC）画像を用いた。これらの画像は、定量的な形態計測または統計解析には含まれていない。枠で囲まれた領域は、高倍率で示した領域である。スケールバーは、20×画像で100 µm、40×画像で50 µmを示す。

発現相関 解析

乳がんにおけるMPO発現と共変動する遺伝子を調べるため、TCGA-BRCAデータセットを使用した。MPOとタンパク質コード遺伝子との間でゲノムワイドなピアソン相関係数を算出し、正の相関が高い上位30遺伝子および負の相関が高い上位30遺伝子を可視化のために抽出した。複数の遺伝子を検定する相関分析において、公称p値はBenjamini-Hochberg法（偽発見率）を用いて補正した。MPO関連のタンパク質相互作用（PPI）ネットワークは、相互作用遺伝子/タンパク質検索ツール（STRING）データベースを用いて構築し、相互作用スコアが0.40を超えるタンパク質ペアを可視化のために保持した15。

機能濃縮 解析

|log2FC| > 1 および Benjamini-Hochberg補正後のp値 < 0.05 をしきい値として、MPO高発現およびMPO低発現のTCGA-BRCA腫瘍グループを比較し、発現変動遺伝子（DEGs）を同定した。DEGsの機能濃縮解析は、RパッケージのclusterProfiler バージョン4.4.4を用い、ジーンオントロジー（GO）の生物学的プロセス、細胞成分、分子機能、および京都遺伝子・ゲノム百科事典（KEGG）パスウェイ解析を含めて実施した16,17,18,19,20。濃縮されたGOおよびKEGG項は、補正後のp値が < 0.05 の場合に有意であると見なした。

MPO高発現群とMPO低発現群の間の差分的発現統計量に基づいた事前ランク付け遺伝子リストを用いて、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を実施した。MSigDB v2022.1.Hsに対応し、3,050の遺伝子セットを含むMSigDB C2 Canonical Pathwaysコレクション c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmtを使用した21,22。濃縮された項目の有意性は、Benjamini–Hochberg補正p値 < 0.05、FDR q値 < 0.25、および|正規化濃縮スコア| > 1に基づいて判定した。必要に応じて、有意に濃縮された項目のZスコアをGOplotパッケージを用いて算出し、可視化した。

腫瘍における 免疫細胞濃縮の解析

TCGA-BRCAコホートにおける免疫成分および間質成分の評価は、Rパッケージestimateバージョン1.0.13に実装されているESTIMATEアルゴリズムを用いて行った。入力データとしてLog2(TPM + 1)変換後の発現データを使用し、各腫瘍サンプルについて免疫スコア、間質スコア、およびESTIMATEスコアを算出した。TCGA-BRCAコホートにおけるMPO発現と、B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、マクロファージ、好中球、および樹状細胞を含む主要な免疫細胞集団の推定浸潤レベルとの関連性の評価には、TIMER/TIMER2.0を用いた23,24,25。TIMERに基づく結果は、対応するオンラインリソースから得られた免疫浸潤推定値として解釈した。24種類の免疫細胞タイプにわたる免疫細胞濃縮分析には、RパッケージGSVAバージョン1.46.0を用いたsingle-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA)を実装した26。CIBERSORTに基づく22種類の免疫細胞タイプのデコンボリューションに使用したLM22免疫細胞シグネチャーマトリックスは、Supplementary Table 1に提示している。MPO発現と免疫細胞濃縮スコアとの相関は、スピアマンの順位相関を用いて評価した。中央値で定義したMPO高発現腫瘍群とMPO低発現腫瘍群との間の免疫細胞濃縮スコアの差は、ウィルコクソン順位和検定を用いて比較した。複数の免疫細胞タイプを含む解析では、Benjamini–Hochberg法を用いてp値を補正した。

MPO遺伝子のDNAメチル化

MPO遺伝子座内のDNAメチル化パターンをMethSurvを用いて評価した。TCGA-BRCAにおけるCpGメチル化ベータ値および生存期間との関連性は、MethSurvプラットフォームから取得した。選択したMPO関連CpGサイトを可視化し、MethSurv27から提供された生存分析の結果を用いて、生存アウトカムとの関連性を評価した。複数のCpGサイトを含む解析では、Benjamini-Hochberg法による偽発見率（FDR）を用いて、テストしたMPO関連CpGサイト間でp値を補正した。これらのメチル化解析は、探索的なエピジェネティック注釈として解釈した。

好中球関連遺伝子のPPIネットワーク構築および相関分析

MPOと好中球関連の生物学的機序との関連を調べるため、系統的なネットワーク解析を行った。既存の文献から、好中球の活性化および関連する炎症プロセスを媒介することが確立されている遺伝子セットをキュレーションした。完全な好中球関連遺伝子リストは補足表2に記載している。遺伝子シンボルを公式の遺伝子シンボルに統一し、重複エントリーを削除した後、利用可能な遺伝子をTCGA-BRCA発現マトリックスと交差させ、STRING/PPI解析、ハブ遺伝子の優先順位付け、およびMPOとハブ遺伝子の相関解析を行った。これらの遺伝子間のPPIネットワークは、STRINGデータベース（バージョン11.5）を用い、中程度の信頼性相互作用スコアしきい値（>0.40）で構築した。このネットワーク内のハブ遺伝子は、ノードあたりの直接的な相互作用数を定量化する次数中心性に基づき、アルゴリズム的に優先順位を決定した。次数スコアが最も高い上位20個の遺伝子を、後続の相関解析のために選択した。

その後、これらのハブ遺伝子およびMPOの発現プロファイルをTCGA-BRCAトランスクリプトームデータセットから抽出した。MPOと各ハブ遺伝子との関連性は、スピアマンの順位相関係数を用いて統計的に評価した。ハブ遺伝子相互間の相関パターンを特徴づけるため、すべての腫瘍サンプルにおいてペアごとのスピアマン相関行列を算出した。これらの相関分析により、MPOとハブ遺伝子の相関を示すロリポッププロットや、ハブ遺伝子間の相関パターンを描いたコードダイアグラムおよびヒートマップを含む、その後の可視化のための定量的な根拠が得られた。

MPOを標的とする上流転写因子およびmiRNAの予測

MPOの標的TFを予測するために、KnockTFデータベース（https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php）28,29、ChIPデータベース（http://chip-atlas.org/）30,31、およびGTRDデータベース32,33（https://gtrd.biouml.org/#!）を使用した。さらに、MPOを標的とする潜在的なmiRNA結合部位を予測するために、TargetScanデータベース（https://www.targetscan.org/vert_80/）を利用した。ベン図は、MicroBioinformaticsウェブサイト（https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html）34を用いて作成した。

MPOの シングルセル解析

特定のデータセットGSE161529は、Gene Expression Omnibus (GEO)に由来する。データのプリプロセッシングでは、まず、ミトコンドリア遺伝子発現率が25%を超える、総ユニーク分子識別子（UMI）数が5000未満、または検出遺伝子数が2500未満のいずれかの基準に該当する低品質な細胞を除外するため、細胞レベルのフィルタリングを行った。続いて、周囲のRNA混入および技術的なバッチ効果を補正した35。次元削減のために主成分分析（PCA）を行い細胞間の類似性を評価し、その後、細胞のクラスタリングと可視化のためにUMAPを用いた。次に、細胞の代表的なマーカー遺伝子に基づいて、各クラスターに細胞型を注釈付けした11。シングルセルシグネチャースコアリングに使用したMPO関連遺伝子セットは、Supplementary File 1に記載されている。スコアリングの前に、遺伝子シンボルを公式の遺伝子シンボルに統一し、重複エントリーを削除して、利用可能な遺伝子とGSE161529の発現マトリックスとの積集合を求めた。細胞ごとのMPO関連スコアの算出には、AUCell、Seurat AddModuleScore、およびssGSEAを用いた。これら3つの手法で得られたスコアをZスコア正規化し、比較可能な範囲にスケーリングした後、統合して、後続の記述解析のための複合MPO関連スコアを生成した。細胞間相互作用ネットワークを解析し、MPO関連シグナルによって層別化した上皮性腫瘍細胞と、多様なパートナー細胞型との間で推定されるリガンド-受容体通信パターンを比較した。これらの結果は、記述的な通信パターンとして解釈され、MPO発現細胞が細胞間通信を直接的に媒介しているという証拠としてではなく扱った。

scTenifoldKnkを用いた MPOの シングルセル仮想ノックダウンおよび パスウェイ濃縮解析

SeuratとscTenifoldKnkを統合することで、MPOのシングルセル仮想ノックダウンを実施した。標準的な品質管理（1細胞あたり200～6,000個の遺伝子、ミトコンドリア分画 < 10%）の後、データを対数正規化し、次元削減およびクラスタリングのために2,000個の高変動遺伝子を選択した。MPOに関連するコンテキストを濃縮するため、骨髄球/好中球遺伝子モジュールのスコアが上位50%に入った細胞を保持した。これらの細胞から、PCA空間におけるk = 40の最近傍を用いてMPO陽性シードから拡張することにより、MPO近傍サブセットを定義した。この拡張されたサブセットは、純粋なMPO陽性集団として扱っておらず、このKNN拡張ステップから細胞型の割合に関する結論は導き出していない。このサブセットに対して、高変動遺伝子とMPO（25個以上の細胞で発現）の和集合を遺伝子セットとして用い、scTenifoldKnkによる仮想ノックダウン解析を行った。有意に変動した遺伝子を特定した（FDR < 0.05、BH補正済み）。得られた遺伝子について、GO Biological ProcessesおよびKEGGパスウェイにおける機能濃縮解析をさらに行った（q < 0.05）。

探索的薬物・遺伝子検索および ADMETアノテーション

DGIdbを用いて、MPOに関連する薬物-遺伝子または化合物-遺伝子の相互作用レコードを予備的に取得した。データベース由来の相互作用リストには、不均一なエビデンスタイプに裏付けられたエントリーが含まれる可能性があり、臨床的に有効な治療薬に直接対応しない場合があるため、抽出された化合物は優先的な治療候補ではなく、探索的なアノテーションとして扱った。続いて、SwissADMEおよびADMETlabを用いて、予測される物理化学的、薬物動態学的、および毒性学的特性をまとめた。これらのin silicoアノテーションは、化合物レベルの解釈に予備的なコンテキストを提供し、治療上の関連性を検討する前に、さらなる薬理学的、毒性学的、および臨床的なキュレーションが必要であることを強調するために使用された36。

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結果

乳がんにおけるMPO発現パターンと生存率との探索的関連性

がんデータセットにおけるMPOの発現パターンを記述するため、TCGAパンキャンサーデータセットのMPO RNA-seqデータを解析した。その結果、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、浸潤性乳癌（BRCA）、多形性膠芽腫（GBM）、頭頸部扁平上皮癌（HNSC）、腎クロモフォブ腎細胞癌（KICH）、肝細胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺扁平上皮癌（LUSC）、膵管腺癌（PAAD）、前立腺腺癌（PRAD）、および甲状腺癌（THCA）の腫瘍組織においてMPO発現が低く、結腸腺癌（COAD）、腎乳頭状細胞癌（KIRP）、およびその他の組織においてMPO発現が高いことが観察された（Figure 2A）。次に、各がん種におけるMPO発現と臨床転帰との関連を評価した。TCGA-BRCAコホートでは、非ペアおよびペアの両方の比較において、正常組織/隣接組織よりも腫瘍組織でMPO発現が低いことが示された（Figu...

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ディスカッション

本研究では、乳がんにおけるMPO発現と免疫・骨髄系特徴との関連を調べるための、公開データセットを用いた探索的なin silicoワークフローを提示します。TCGA-BRCAの解析により、MPO発現は非腫瘍隣接組織よりも腫瘍組織で低く、またMPOの高発現は無増悪生存期間の延長と関連していることが示されました。しかしながら、全生存期間および疾患特異的生存期間については統計的に有意ではありませんでした。したがって、現在のエビデンスに基づけば、MPOを堅牢または確立された予後バイオマーカーとして解釈すべきではありません。今後の研究では、確立された臨床病理学的変数で調整した多変量Cox回帰モデル、独立した検証コホート、およびサブタイプ別解析を用いてMPOを評価する必要があります。

従来の単一コホートによる変動遺伝子解析や単一プラットフォームによる免疫浸潤推定と比較して、このMPOを中心としたワークフローは、バルクトランスクリプトーム解析、免疫エンリッチメント、メチル化アノテーション、シングルセルマッピング、および仮想摂動を統合することで、MPOに関連する免疫/骨髄系機能についてより広範な探索...

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開示事項

著者らは、本研究における利益相反はないことを報告します。AIベースの言語編集ツールは、原稿改訂時の英語の推敲および可読性の向上を支援するためのみに使用されました。このツールは、研究デザイン、データ解析、図の作成、結果の解釈、文献の選定、または科学的な結論の導出には使用されていません。すべての解析、結果、解釈、参考文献、および最終的な本文は、著者らによって慎重に確認、検討、および承認されており、著者らが原稿の内容について全責任を負います。

謝辞

著者は、航空宇宙センター病院科学研究基金（YN202530）からの資金提供に深く感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CellChatRパッケージ/オープンソースhttps://github.com/sqjin/CellChat細胞間コミュニケーション解析
ChIP-Atlas公開データベースhttps://chip-atlas.org/TFターゲットスクリーニング; 2021年更新 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/GO/KEGGエンリッチメント解析; v4.4.4
CytoscapeCytoscape Consortiumhttps://cytoscape.org/ネットワーク可視化およびトポロジー解析
DGIdbワシントン大学/公開データベースhttps://www.dgidb.org/薬物-遺伝子相互作用の検索
GDC/TCGA-BRCA国立がん研究所https://portal.gdc.cancer.gov/バルクトランスクリプトームおよび臨床データのソース
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/シングルセルデータセットのソース
GSEA/MSigDBブロード研究所https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb遺伝子セットエンリッチメント解析および遺伝子セットリファレンス; Version 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/遺伝子セット変動/ssGSEA関連スコアリング; Version 1.46.0
GTRD公開データベースhttp://gtrd.biouml.org/TFターゲットスクリーニング; 2021 
KnockTF公開データベースhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlTF摂動リソース; Version 2.0 
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/統計計算環境
scTenifoldKnkRパッケージ/オープンソースhttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk仮想ノックダウン解析
SeuratRパッケージ/オープンソースhttps://satijalab.org/seurat/シングルセル前処理およびクラスタリング
STRINGELIXIR/公開データベースhttps://string-db.org/タンパク質-タンパク質相互作用解析; v11 
SwissADMESIBスイスバイオインフォマティクス研究所http://www.swissadme.ch/薬物らしさ（Drug-likeness）の評価; 2017年リリース/ウェブツール 
TIMER公開ウェブリソースhttps://timer.cistrome.org/免疫浸潤解析; TIMER2.0 
UCSC XenaまたはリンクされたTCGAポータルUCSChttps://xenabrowser.net/探索的データアクセス/検証 

参考文献

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