研究記事

乳がんにおけるMPO発現と免疫微小環境の関連：バイオインフォマティクスおよびシングルセル解析による知見

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DOI：

10.3791/71189

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2026年8月14日

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1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本論文では、乳がんにおけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）の発現と免疫・骨髄系特性との関連性を探索するための、再現可能なバイオインフォマティクスおよびシングルセルワークフローを提示します。これらの解析は公開データセットおよびin silico手法に基づいているため、得られた知見は探索的であり、仮説を生成するものとして解釈されます。

要約

乳がんは依然としてがん関連死亡の主要な原因であり、探索的な計算ワークフローは、さらなる調査に向けた免疫関連マーカーの優先順位付けに有用です。本研究では、The Cancer Genome Atlas breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA) のバルクトランスクリプトームデータおよび公開シングルセルデータセットGSE161529を用い、ミエロペルオキシダーゼ (MPO) 発現と、臨床転帰、免疫浸潤、メチル化、上流レギュレーターアノテーション、シングルセル発現パターン、仮想ノックダウン感度出力、薬物-遺伝子相互作用リトリーバル、および吸収・分布・代謝・排泄・毒性 (ADMET) アノテーションとの関連性を検討しました。MPO発現は、隣接する非腫瘍組織よりも乳がん組織で低い値を示しました。MPOの高発現は無増悪生存期間の延長と関連していましたが、全生存期間および疾患特異的生存期間との関連に統計的な有意差は認められませんでした。受信者動作特性 (ROC) 解析は、解析した公開データセット内での腫瘍と正常組織の分離を示唆しましたが、これは臨床的な診断的検証として解釈されるべきではありません。免疫デコンボリューションおよび濃縮解析の結果、MPO発現は主に免疫および骨髄系に関連する転写特徴と連動しており、腫瘍固有の免疫微小環境調節を確立しているわけではないことが示されました。シングルセル解像度ではMPOシグナルは希薄であり、k-nearest neighbor (KNN) に基づく近傍拡張の前では、わずか85個のMPO陽性細胞のみが検出されました。検出可能なMPOシグナルおよびMPO関連スコアは、希薄な発現、細胞型アノテーションの不確実性、ドロップアウト、ダブレット、または周囲のRNAの影響を受けている可能性があるため、慎重に解釈されました。In silico 仮想ノックダウンは、候補となる免疫および炎症関連の転写変化を示唆しましたが、これらの結果は探索的なものであると考えられ、検証が必要です。Drug-gene interaction database (DGIdb) に基づく薬物-遺伝子リトリーバルおよびADMETアノテーションは、予備的な化学アノテーションとしてのみ使用され、治療的根拠として解釈されたものではありません。総じて、本研究は乳がんにおけるMPO関連の免疫/骨髄系特徴に関する仮説を生成するための再現可能なin silicoワークフローを提供しており、これらは外部コホートでの検証および実験的な確認を必要とします。

概要

乳がんは高度に不均一な免疫関連悪性腫瘍である1。その病勢進行、再発および転移のリスク、そして治療反応性は、腫瘍免疫微小環境（TIME）の組成および機能状態と密接に関連している2。包括的な治療戦略の最適化が進められているにもかかわらず、一部の患者では依然として進行や再発が見られ、TIMEの状態を特徴づけ、リスク層別化を支援する分子バイオマーカーの同定と、その根底にあるメカニズムの解明が急務となっている。

ミエロペルオキシダーゼ（MPO）は、主に好中球に、また少量ながら単球やマクロファージに発現しているヘム含有ペルオキシダーゼである。MPOは、次亜塩素酸やその他の反応性酸化剤を生成することで抗菌防御に寄与するが、酸化的な組織損傷や慢性炎症を促進する場合もある。がんにおいて、MPOの生物学的意義はコンテキストに依存すると考えられている3。一方で、MPO介在性の酸化ストレスは、DNA損傷、脂質およびタンパク質の酸化、炎症性シグナル伝達、ならびに腫瘍微小環境のリモデリングを通じて、発がんや腫瘍の進展に関与していることが示唆されている4,5,6。その一方で、特定の腫瘍コンテキストにおいては、MPO陽性の自然免疫細胞または骨髄系細胞の浸潤が、良好な予後や抗腫瘍免疫活性に関連している。 7,8,9。これらの一見相反する知見は、MPOの臨床的および生物学的意義が、腫瘍の種類、疾患ステージ、MPOの細胞源、および腫瘍微小環境の免疫組成に依存している可能性を示唆している。しかし、乳がんにおけるMPOの発現パターンおよび予後との関連性、特に単一細胞レベルでの解析については、まだ十分に解明されていない。

腫瘍免疫微小環境（TIME）には、不均一な骨髄系、リンパ系、間質系、および上皮系のコンパートメントが含まれています10。MPOは一般的に好中球やその他の骨髄系細胞に関連しており、バルク腫瘍プロファイルにおけるMPO関連シグナルは、腫瘍細胞固有の活性よりもむしろ免疫細胞組成を反映している可能性があります10。乳がにおいて、バルクおよびシングルセルデータセットにおけるMPOシグナルの分布、免疫浸潤推定値との関連、および後続の計算解析の再現性限界については、まだ十分に特徴付けられていません。したがって、本研究では、MPOを探索的なワークフロー開発のための免疫関連マーカーとして扱い、TIMEの証明された因果的調節因子や検証済みの治療標的としては扱いません。単一コホートの差分的発現解析や単一プラットフォームの免疫浸潤推定と比較して、バルクトランスクリプトミクス、免疫デコンボリューション、メチル化アノテーション、シングルセルマッピング、および計算的摂動を組み合わせた統合ワークフローは、遺伝子に関連する免疫コンテキストについて、より広範な探索的視点を提供できます。このアプローチは、特に実験的なデータセットがまだ利用できない場合に、候補マーカーの優先順位付けや検証可能な仮説の構築に有用です。しかし、このような計算的な統合だけでは、細胞源、因果関係、薬理活性、または臨床的有用性を決定することはできません。大規模な公開がんコホートとシングルセル・トランスクリプトーム技術の進歩により、バイオインフォマティクス的手法を用いて、集団レベルおよびシングルセルレベルの両方で、遺伝子発現、臨床転帰、免疫細胞組成、および転写状態の間の関連性を探索することが可能になります11。シングルセル遺伝子調節ネットワークに基づく計算的摂動法は、遺伝子に関連する転写感受性に関する仮説生成のための情報をさらに提供できる可能性があります12,13。したがって、本研究は、乳がんにおけるMPOの発現パターン、生存との関連、免疫/骨髄系コンテキスト、メチル化プロファイル、シングルセル分布、および探索的な計算的摂動プロファイルを特徴付けることを目的としました。全体のワークフローを図1に示します。

プロトコル

TCGAデータベースからの取得

TCGA乳管浸潤癌（TCGA-BRCA）コホートのRNAシーケンシングデータおよび臨床情報は、genomic data commons portal14から取得した。STARワークフローによるtranscripts per million (TPM)形式のRNA-seqデータと、それに対応する臨床アノテーションを抽出した。対応する臨床情報がないRNA-seqサンプルは除外した。発現ベースの解析にあたり、TPM値はlog2(TPM + 1)として変換した。MPOの発現量は、遺伝子シンボルMPOおよびEnsembl遺伝子ID ENSG00000005381.8を用いて抽出した。MPO高発現群（MPO-high）とMPO低発現群（MPO-low）のグループ分けが必要な解析では、TCGA-BRCAの腫瘍サンプルのみを含め、隣接する正常サンプルはグループ割り当てから除外した。腫瘍サンプルは、TCGA-BRCA腫瘍サンプルにおけるlog2(TPM + 1)変換後のMPO発現量の中央値に基づいて分割した。中央値以上のMPO発現を示すサンプルをMPO-high群に、中央値未満のサンプルをMPO-low群に割り当てた。特に断りのない限り、この中央値に基づくグループ化戦略を、生存解析、差分的発現解析、エンリッチメント解析、メチル化グループ化、および免疫細胞エンリッチメント比較に使用した。性別、年齢、民族、病理学的Tステージ、組織学的グレード、PAM50サブタイプ、病理学的ステージ、腫瘍の状態などの臨床病理学的特性、および全生存期間 (OS)、無増悪期間 (PFI)、疾患特異的生存期間 (DSS) などの生存エンドポイントの解析には、R version 4.2.1を使用した。

公開免疫組織化学画像検索

定性的なタンパク質レベルの参照として、隣接する正常乳腺組織および乳がん組織の代表的なMPO免疫組織化学（IHC）画像を用いた。これらの画像は、定量的な形態計測または統計解析には含まれていない。枠で囲まれた領域は、高倍率で示した領域である。スケールバーは、20×画像で100 µm、40×画像で50 µmを示す。

発現相関 解析

乳がんにおけるMPO発現と共変動する遺伝子を調べるため、TCGA-BRCAデータセットを使用した。MPOとタンパク質コード遺伝子との間でゲノムワイドなピアソン相関係数を算出し、正の相関が高い上位30遺伝子および負の相関が高い上位30遺伝子を可視化のために抽出した。複数の遺伝子を検定する相関分析において、公称p値はBenjamini-Hochberg法（偽発見率）を用いて補正した。MPO関連のタンパク質相互作用（PPI）ネットワークは、相互作用遺伝子/タンパク質検索ツール（STRING）データベースを用いて構築し、相互作用スコアが0.40を超えるタンパク質ペアを可視化のために保持した15。

機能濃縮 解析

|log2FC| > 1 および Benjamini-Hochberg補正後のp値 < 0.05 をしきい値として、MPO高発現およびMPO低発現のTCGA-BRCA腫瘍グループを比較し、発現変動遺伝子（DEGs）を同定した。DEGsの機能濃縮解析は、RパッケージのclusterProfiler バージョン4.4.4を用い、ジーンオントロジー（GO）の生物学的プロセス、細胞成分、分子機能、および京都遺伝子・ゲノム百科事典（KEGG）パスウェイ解析を含めて実施した16,17,18,19,20。濃縮されたGOおよびKEGG項は、補正後のp値が < 0.05 の場合に有意であると見なした。

MPO高発現群とMPO低発現群の間の差分的発現統計量に基づいた事前ランク付け遺伝子リストを用いて、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を実施した。MSigDB v2022.1.Hsに対応し、3,050の遺伝子セットを含むMSigDB C2 Canonical Pathwaysコレクション c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmtを使用した21,22。濃縮された項目の有意性は、Benjamini–Hochberg補正p値 < 0.05、FDR q値 < 0.25、および|正規化濃縮スコア| > 1に基づいて判定した。必要に応じて、有意に濃縮された項目のZスコアをGOplotパッケージを用いて算出し、可視化した。

腫瘍における 免疫細胞濃縮の解析

TCGA-BRCAコホートにおける免疫成分および間質成分の評価は、Rパッケージestimateバージョン1.0.13に実装されているESTIMATEアルゴリズムを用いて行った。入力データとしてLog2(TPM + 1)変換後の発現データを使用し、各腫瘍サンプルについて免疫スコア、間質スコア、およびESTIMATEスコアを算出した。TCGA-BRCAコホートにおけるMPO発現と、B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、マクロファージ、好中球、および樹状細胞を含む主要な免疫細胞集団の推定浸潤レベルとの関連性の評価には、TIMER/TIMER2.0を用いた23,24,25。TIMERに基づく結果は、対応するオンラインリソースから得られた免疫浸潤推定値として解釈した。24種類の免疫細胞タイプにわたる免疫細胞濃縮分析には、RパッケージGSVAバージョン1.46.0を用いたsingle-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA)を実装した26。CIBERSORTに基づく22種類の免疫細胞タイプのデコンボリューションに使用したLM22免疫細胞シグネチャーマトリックスは、Supplementary Table 1に提示している。MPO発現と免疫細胞濃縮スコアとの相関は、スピアマンの順位相関を用いて評価した。中央値で定義したMPO高発現腫瘍群とMPO低発現腫瘍群との間の免疫細胞濃縮スコアの差は、ウィルコクソン順位和検定を用いて比較した。複数の免疫細胞タイプを含む解析では、Benjamini–Hochberg法を用いてp値を補正した。

MPO遺伝子のDNAメチル化

MPO遺伝子座内のDNAメチル化パターンをMethSurvを用いて評価した。TCGA-BRCAにおけるCpGメチル化ベータ値および生存期間との関連性は、MethSurvプラットフォームから取得した。選択したMPO関連CpGサイトを可視化し、MethSurv27から提供された生存分析の結果を用いて、生存アウトカムとの関連性を評価した。複数のCpGサイトを含む解析では、Benjamini-Hochberg法による偽発見率（FDR）を用いて、テストしたMPO関連CpGサイト間でp値を補正した。これらのメチル化解析は、探索的なエピジェネティック注釈として解釈した。

好中球関連遺伝子のPPIネットワーク構築および相関分析

MPOと好中球関連の生物学的機序との関連を調べるため、系統的なネットワーク解析を行った。既存の文献から、好中球の活性化および関連する炎症プロセスを媒介することが確立されている遺伝子セットをキュレーションした。完全な好中球関連遺伝子リストは補足表2に記載している。遺伝子シンボルを公式の遺伝子シンボルに統一し、重複エントリーを削除した後、利用可能な遺伝子をTCGA-BRCA発現マトリックスと交差させ、STRING/PPI解析、ハブ遺伝子の優先順位付け、およびMPOとハブ遺伝子の相関解析を行った。これらの遺伝子間のPPIネットワークは、STRINGデータベース（バージョン11.5）を用い、中程度の信頼性相互作用スコアしきい値（>0.40）で構築した。このネットワーク内のハブ遺伝子は、ノードあたりの直接的な相互作用数を定量化する次数中心性に基づき、アルゴリズム的に優先順位を決定した。次数スコアが最も高い上位20個の遺伝子を、後続の相関解析のために選択した。

その後、これらのハブ遺伝子およびMPOの発現プロファイルをTCGA-BRCAトランスクリプトームデータセットから抽出した。MPOと各ハブ遺伝子との関連性は、スピアマンの順位相関係数を用いて統計的に評価した。ハブ遺伝子相互間の相関パターンを特徴づけるため、すべての腫瘍サンプルにおいてペアごとのスピアマン相関行列を算出した。これらの相関分析により、MPOとハブ遺伝子の相関を示すロリポッププロットや、ハブ遺伝子間の相関パターンを描いたコードダイアグラムおよびヒートマップを含む、その後の可視化のための定量的な根拠が得られた。

MPOを標的とする上流転写因子およびmiRNAの予測

MPOの標的TFを予測するために、KnockTFデータベース（https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php）28,29、ChIPデータベース（http://chip-atlas.org/）30,31、およびGTRDデータベース32,33（https://gtrd.biouml.org/#!）を使用した。さらに、MPOを標的とする潜在的なmiRNA結合部位を予測するために、TargetScanデータベース（https://www.targetscan.org/vert_80/）を利用した。ベン図は、MicroBioinformaticsウェブサイト（https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html）34を用いて作成した。

MPOの シングルセル解析

特定のデータセットGSE161529は、Gene Expression Omnibus (GEO)に由来する。データのプリプロセッシングでは、まず、ミトコンドリア遺伝子発現率が25%を超える、総ユニーク分子識別子（UMI）数が5000未満、または検出遺伝子数が2500未満のいずれかの基準に該当する低品質な細胞を除外するため、細胞レベルのフィルタリングを行った。続いて、周囲のRNA混入および技術的なバッチ効果を補正した35。次元削減のために主成分分析（PCA）を行い細胞間の類似性を評価し、その後、細胞のクラスタリングと可視化のためにUMAPを用いた。次に、細胞の代表的なマーカー遺伝子に基づいて、各クラスターに細胞型を注釈付けした11。シングルセルシグネチャースコアリングに使用したMPO関連遺伝子セットは、Supplementary File 1に記載されている。スコアリングの前に、遺伝子シンボルを公式の遺伝子シンボルに統一し、重複エントリーを削除して、利用可能な遺伝子とGSE161529の発現マトリックスとの積集合を求めた。細胞ごとのMPO関連スコアの算出には、AUCell、Seurat AddModuleScore、およびssGSEAを用いた。これら3つの手法で得られたスコアをZスコア正規化し、比較可能な範囲にスケーリングした後、統合して、後続の記述解析のための複合MPO関連スコアを生成した。細胞間相互作用ネットワークを解析し、MPO関連シグナルによって層別化した上皮性腫瘍細胞と、多様なパートナー細胞型との間で推定されるリガンド-受容体通信パターンを比較した。これらの結果は、記述的な通信パターンとして解釈され、MPO発現細胞が細胞間通信を直接的に媒介しているという証拠としてではなく扱った。

scTenifoldKnkを用いた MPOの シングルセル仮想ノックダウンおよび パスウェイ濃縮解析

SeuratとscTenifoldKnkを統合することで、MPOのシングルセル仮想ノックダウンを実施した。標準的な品質管理（1細胞あたり200～6,000個の遺伝子、ミトコンドリア分画 < 10%）の後、データを対数正規化し、次元削減およびクラスタリングのために2,000個の高変動遺伝子を選択した。MPOに関連するコンテキストを濃縮するため、骨髄球/好中球遺伝子モジュールのスコアが上位50%に入った細胞を保持した。これらの細胞から、PCA空間におけるk = 40の最近傍を用いてMPO陽性シードから拡張することにより、MPO近傍サブセットを定義した。この拡張されたサブセットは、純粋なMPO陽性集団として扱っておらず、このKNN拡張ステップから細胞型の割合に関する結論は導き出していない。このサブセットに対して、高変動遺伝子とMPO（25個以上の細胞で発現）の和集合を遺伝子セットとして用い、scTenifoldKnkによる仮想ノックダウン解析を行った。有意に変動した遺伝子を特定した（FDR < 0.05、BH補正済み）。得られた遺伝子について、GO Biological ProcessesおよびKEGGパスウェイにおける機能濃縮解析をさらに行った（q < 0.05）。

探索的薬物・遺伝子検索および ADMETアノテーション

DGIdbを用いて、MPOに関連する薬物-遺伝子または化合物-遺伝子の相互作用レコードを予備的に取得した。データベース由来の相互作用リストには、不均一なエビデンスタイプに裏付けられたエントリーが含まれる可能性があり、臨床的に有効な治療薬に直接対応しない場合があるため、抽出された化合物は優先的な治療候補ではなく、探索的なアノテーションとして扱った。続いて、SwissADMEおよびADMETlabを用いて、予測される物理化学的、薬物動態学的、および毒性学的特性をまとめた。これらのin silicoアノテーションは、化合物レベルの解釈に予備的なコンテキストを提供し、治療上の関連性を検討する前に、さらなる薬理学的、毒性学的、および臨床的なキュレーションが必要であることを強調するために使用された36。

結果

乳がんにおけるMPO発現パターンと生存率との探索的関連性

がんデータセットにおけるMPOの発現パターンを記述するため、TCGAパンキャンサーデータセットのMPO RNA-seqデータを解析した。その結果、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、浸潤性乳癌（BRCA）、多形性膠芽腫（GBM）、頭頸部扁平上皮癌（HNSC）、腎クロモフォブ腎細胞癌（KICH）、肝細胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺扁平上皮癌（LUSC）、膵管腺癌（PAAD）、前立腺腺癌（PRAD）、および甲状腺癌（THCA）の腫瘍組織においてMPO発現が低く、結腸腺癌（COAD）、腎乳頭状細胞癌（KIRP）、およびその他の組織においてMPO発現が高いことが観察された（Figure 2A）。次に、各がん種におけるMPO発現と臨床転帰との関連を評価した。TCGA-BRCAコホートでは、非ペアおよびペアの両方の比較において、正常組織/隣接組織よりも腫瘍組織でMPO発現が低いことが示された（Figure 2B,C）。腫瘍におけるMPO発現の中央値をカットオフ値としてTCGA-BRCAの腫瘍サンプルを層別化したところ、Kaplan-Meier解析により、MPO発現が高い患者の方が無増悪期間が長いことが示された（ハザード比 (HR) = 0.67, p = 0.028）（Figure 2D）。全生存期間（OS）（p = 0.296; Supplementary Figure 1A）および疾患特異的生存率（DSS）（p = 0.18; Supplementary Figure 1B）には統計的な有意差は認められなかった。腫瘍対正常のROC曲線は、このデータセットにおける組織群間の分離を示唆していたが（Figure 2E）、この解析を臨床診断のバリデーションとして解釈すべきではない。この探索的な識別は、正常サンプルのソース、バッチ効果、腫瘍の純度、および組織組成の違いに影響されている可能性がある。また、MPO発現は病理学的Tステージ（Figure 2F）およびPAM50サブタイプの分布（Figure 2G）とも関連していた。タンパク質レベルの定性的な参照として、隣接する正常乳腺組織および乳癌組織の代表的なMPO免疫組織化学（IHC）画像を示した（Figure 2H）。枠で囲まれた領域は、高倍率で示した領域である。20倍の概観図には100 µmのスケールバーが含まれ、40倍の高倍率図には50 µmのスケールバーが含まれている。

TCGA-BRCAコホートにおけるMPOの相関および濃縮解析

ピアソン相関分析により、MPOと正の相関を示す上位30遺伝子が特定され、これらはMPOの発現勾配に沿って協調的な発現上昇を示した（図 3A）。一方、負の相関を示す上位30遺伝子は、逆の発現パターンを示した（図 3B）。パスウェイレベルでは、MPOの発現は、炎症反応シグネチャー（r = 0.41; 図 3C）、EMTマーカー（r = 0.264; 図 3D）、および活性酸素種（ROS）関連遺伝子セットスコア（r = 0.415; 図 3E）を含む、複数の腫瘍関連シグネチャースコアと有意な正の相関があった。このことは、TCGA-BRCAコホートにおいて、MPOの発現が炎症性/酸化ストレスおよび間葉系様の転写状態と連動していることを示唆している。

MPO関連遺伝子の教師なしクラスタリングにより、腫瘍をさらに病理学的TステージやPAM50固有サブタイプなどの臨床的アノテーションと一致する発現パターンへと層別化した(Figure 3F)。MPO関連遺伝子間の潜在的な結合性を探索するため、STRINGを用いてタンパク質相互作用（PPI）ネットワークを構築したところ、いくつかのMPO相関遺伝子間で相互に連結したモジュールが明らかになった(Figure 3G)。このPPIネットワークにおいて、ESR1、FOXA1、XBP1、GATA3、およびKRT18は、この相関由来モジュール内で高いネットワーク結合性を示した。これらの結果は、MPO発現と共変動する遺伝子を特定するものであり、MPO関連の病因や方向性を立証するものではない。MPO高発現群とMPO低発現群の間で差分的発現解析を行った結果、ボルケーノプロットにまとめられたトランスクリプトームの違いが明らかになった(Figure 3H)。合計1,159個の上昇遺伝子と854個の低下遺伝子が特定され、これらが後続のエンリッチメント解析への入力データとなった。

次に、RのclusterProfilerパッケージを用いて、MPO高発現群とMPO低発現群の間で差次的に発現している遺伝子（DEG）の機能的な関連性を検討しました。ジーンオントロジー（GO）濃縮解析の結果、これらのDEGは主に免疫応答関連の細胞表面受容体シグナリングの調節やリンパ球介在性免疫などの免疫関連の生物学的プロセスに関与しており、またT細胞受容体複合体などの細胞成分や、受容体活性化因子活性に関連する分子機能においても濃縮が認められました（図 4A）。これと一致して、KEGGパスウェイ解析では、サイトカイン–サイトカイン受容体相互作用、ケモカインシグナリング、T細胞受容体シグナリング、ナチュラルキラー細胞介在性細胞傷害性、Th1/Th2およびTh17分化、NF-κBシグナリング、原発性免疫不全、ならびにIgA産生のための腸管免疫ネットワークを含む、免疫および炎症関連のパスウェイが強調されました（図 4B）。

発現の方向性と機能的用語をさらに統合するため、DEGの|log2FC|値に基づいて用語レベルのZスコアを算出するためにGOプロットを用いました。その結果、体液性免疫応答、白血球/リンパ球介在性免疫、免疫応答の活性化、および信号伝達などの免疫濃縮的な転写プログラムが改めて強調されました（図 4C）。ランク付けされた遺伝子リストに基づく遺伝子セット濃縮解析（GSEA）においても、適応免疫系、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、および好中球脱顆粒を含む免疫系経路の濃縮が示されました（図 4D–G）。MPOは骨髄系/好中球関連遺伝子であるため、これらの濃縮は、MPO自体が免疫微小環境を再構築しているという根拠ではなく、MPO高発現サンプルがより強力な免疫/骨髄系転写シグナルを示しているという根拠であると解釈されます。

乳がんにおける MPO発現と免疫細胞浸潤との相関

TCGA-BRCAコホートにおけるMPO発現と腫瘍微小環境特性との関係を評価した。ESTIMATEアルゴリズムを適用した結果、MPO発現とESTIMATEスコア（R = 0.347, p < 0.001）、免疫スコア（R = 0.361, p < 0.001）、およびストローマスコア（R = 0.232, p < 0.001）との間に有意な正の相関が認められた（Figure 5A）。サンプル間におけるこれらのスコアの分布をFigure 5Bに示す。TIMER/TIMER2.0リソースを用いた解析により、TCGA-BRCAコホートにおいてMPO発現が、B細胞、CD8+ T細胞、好中球、CD4+ T細胞、マクロファージ、樹状細胞を含む主要な免疫細胞集団の推定浸潤レベルに関連していることが示された（Figure 5C）。この関連パターンを、24種類の免疫細胞に対するssGSEAベースの免疫細胞濃縮スコアを用いてさらに評価した。Benjamini–Hochberg法による偽発見率補正後、MPO発現は、T細胞、B細胞、細胞傷害性細胞、樹状細胞サブセット、マクロファージ、Tヘルパーサブセット、調節性T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞、マスト細胞、好中球を含む複数の免疫細胞濃縮スコアと正の相関を示した（Figure 5D）。これらの知見は、MPOが免疫細胞の浸潤を直接制御しているという証拠ではなく、免疫組成との関連として解釈される。TCGA-BRCAコホートにおけるサンプルレベルの免疫細胞濃縮パターンを可視化するため、ヒートマップを作成した（Figure 5E）。次に、中央値で定義したMPO高発現群とMPO低発現群の間で、ssGSEAにより推定された免疫細胞濃縮スコアを比較した。その結果、活性化樹状細胞（aDC）、B細胞、CD8+ T細胞、細胞傷害性細胞、好中球、T細胞、Tregs、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、γδ T細胞、濾胞性ヘルパーT細胞（TFH）、高度可変遺伝子（HVG）細胞、エフェクターメモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞、およびTヘルパー細胞を含むいくつかの免疫細胞濃縮スコアにおいて、2群間に差が認められた（Figure 5F,G）。加えて、LM22シグネチャーマトリックスを用いたCIBERSORTベースのデコンボリューションを行い、22種類の免疫細胞の相対分画を推定した。得られた免疫細胞組成パターンをFigure 5Hに示す。

TCGA-BRCAコホートにおけるMPOのDNAメチル化解析

同一の腫瘍MPO発現の中央値カットオフを用いて、TCGA-BRCAサンプルをMPO高発現群とMPO低発現群に分類し、各群のDNAメチル化パターンを可視化した（図 6A）。MethSurv解析において、cg22331200、cg14619064、cg11151395を含むMPO遺伝子座内の特定のCpG部位で生存期間との関連が示された（図 6B–G）。これらのメチル化に関する結果は、探索的なエピジェネティック注釈として解釈されており、予後またはメカニズムに関する結論を導き出す前に、独立した検証が必要である。

乳がんにおけるMPO発現と好中球関連遺伝子ネットワークとの関連性

MPO発現と好中球関連遺伝子との関連を調べるために、TCGA-BRCAコホートを使用した。好中球関連遺伝子のSTRINGベースのPPIネットワークを構築し、ネットワークトポロジーに基づいてハブ遺伝子を優先的に抽出した（図 7A）。その後、上位20個のハブ遺伝子について、MPO発現との相関を評価した。ロリポッププロットに示されているように、MPOは複数の好中球関連メディエーターと主に正の相関を示し、CCL5、CCL2、TLR2などのケモカイン／自然免疫シグナル伝達成分、およびTLR4、CXCR4、TNF、MMP9においてより強い関連が観察された（図 7B）。

これらのハブ遺伝子間の共調節パターンをさらに特性づけるため、コードダイアグラムと相関ヒートマップを用いてペアごとの関係を可視化した。その結果、ハブモジュール全体にわたって広範な正の遺伝子間相関が認められ、これは協調的な炎症性/好中球関連の転写プログラムと一致していた（図 7C、D）。総合すると、これらの結果は、乳がんにおいてMPOの高発現が好中球関連遺伝子ネットワークの協調的な発現を伴っていることを示している。

MPOに対する候補転写因子のアノテーション

MPOに関連する可能性のある候補転写因子を探索するため、KnockTF、ChIP-Atlas、GTRDを含む公開転写因子リソースを検索し、それらを交差させた。さらに、ネットワークベースの優先順位付けおよび相関分析を用いて、候補転写因子の要約を行った。図式的なまとめを図に示す。 付随図 2、および完全な表形式の結果は～に記載されている。 付随ファイル 2これらのデータベースは、不均一な実験背景からのエビデンスを統合しているため、データベースの重複およびネットワーク次数は、候補のアノテーションおよび優先順位付けにのみ使用した。これらの結果は、乳がんにおけるMPOの直接的な転写調節の機能的なエビデンスとして解釈したものではない。したがって、MYCを含む候補因子は、検証済みのアップストリーム調節因子としてではなく、補足的な探索的アノテーションとして提示している。

MPOシグナルによって層別化した単一細胞クラスタリングおよび記述的な細胞間コミュニケーション解析

細胞型の注釈付けを行うため、まず各系譜の標準的なマーカーに基づいたクラスター特異的な発現解析を実施しました。これらの主要遺伝子のクラスター間における平均発現レベルと発現細胞の割合を示しており、これが後の注釈付けの根拠となっています（図8A）。これに従い、注釈付けされた細胞クラスターをt-SNE（uniform manifold approximation and projection; UMAP）プロットで可視化し、各集団を同定された細胞型（プラズマサイトイド樹状細胞、内皮細胞、筋上皮細胞、増殖期上皮細胞、形質細胞、細胞傷害性T細胞、上皮系腫瘍細胞、B細胞、活性化CD4 T細胞、単球・マクロファージ、線維芽細胞、および従来型T細胞）に応じて色分けしました（図8B）。ヒートマップは、細胞クラスター（C1-C8）における選択した遺伝子の発現レベルを示しています。各行は遺伝子を、各列は細胞クラスターを表します。色のグラデーションは発現レベルを示し、赤色は高発現、青色は低発現であることを示します。左側のデンドログラムは、同様の発現パターンを持つ遺伝子をクラスター化したものです（図8C）。MPO関連スコアは、Supplementary File 1で提供されているMPO関連遺伝子セットを用いて細胞ごとに算出しました。細胞ごとのスコアの算出には、AUCell、Seurat AddModuleScore、および単一サンプル遺伝子セット濃縮解析（ssGSEA）を用いました。これら3つの手法によるスコアをZスコア正規化して比較可能な範囲にスケーリングし、統合することで、後続の記述解析に用いる複合MPO関連スコアを導出しました（図8D）。

この細胞間相互作用解析では、MPO関連シグナルによって層別化された細胞群間におけるリガンド–受容体通信パターンの推定を、相互作用ネットワーク、シグナリングパターンヒートマップ、流出シグナリングバブルプロット、および流入シグナリングバブルプロットを用いて比較しました（図 8E–H）。単一細胞レベルでのMPOシグナルは希薄であり、アノテーションされた細胞型における見かけ上の分布は、ドロップアウト、アンビエントRNA、ダブレット、およびアノテーションの不確実性の影響を受けている可能性があるため、これらの通信プロットは記述的なワークフロー出力として解釈されるべきです。これらは、MPO発現細胞が細胞間通信を媒介または制御していることを証明するものではありません。検出可能なMPOシグナルは、アノテーションされた上皮性腫瘍細胞や単球–マクロファージを含む、限られた数の細胞で観察されました（図 8I）。MPOは標準的に好中球/骨髄系リネージに関連しているため、このパターンは独立した単一細胞データセットまたは直交的な実験的手法による検証が必要です。

スパース性を基にした探索的scTenifoldKnk感度分析 MPO陽性細胞

複数の10x Genomicsサンプルを統合し、続いて正規化およびHVG選択、PCAに基づく次元削減、k近傍グラフの構築、およびLouvainクラスタリングを行った。各クラスターにおける標準的なマーカー遺伝子の発現パターンをDotPlotを用いてまとめ、その後の細胞型アノテーションの根拠とした（図 9A）。UMAP可視化により、統合データセットにおけるアノテーション済みの単一細胞集団を示した（図 9B）。標準的なリネージマーカー（例：上皮細胞のEPCAMおよびKRT8/KRT18、免疫細胞のPTPRC、B細胞のMS4A1、骨髄系細胞のLST1/S100A8/S100A9、内皮細胞のPECAM1、および線維芽細胞/平滑筋リネージのCOL1A1）はクラスター特異的な発現パターンを示し、細胞型アノテーションを裏付けた（図 9C）。サンプル別に層別化した積層棒グラフにより、各サンプルに複数のクラスターが含まれており、全体的なバッチ間変動は限定的であることが示された（図 9D）。

シングルセルデータセットにおいてMPOの発現は比較的希薄であり、当初は85個のMPO陽性細胞のみが検出されました（図 9E）。この限定的な細胞数に基づき、KNNベースの近傍拡張は、探索的な感度分析のための局所的なMPO近傍サブセットを定義するためのみに使用されました。この拡張サブセットには、MPO発現が低いか検出不可能な近接細胞が含まれている可能性があるため、純粋なMPO陽性集団として解釈すべきではありません。このMPO近傍サブセット内において、計算上の感度分析としてscTenifoldKnkを用いたMPOの仮想ノックダウンを実施しました。得られたボルケーノプロット、マニホールド変位分析、マニホールドアライメントの可視化、GO/KEGG濃縮解析の結果、および上位変位遺伝子（図 9F-N）により、抗原提示、骨髄系/リンパ球活性化、サイトカイン産生、およびファゴソーム関連経路に関連する候補転写プログラムが浮き彫りになりました。これらの結果は、探索的な転写感度出力として解釈されるべきであり、乳がんにおいてMPOがこれらの経路をメカニズム的に調節しているという直接的な証拠として捉えるべきではありません。これらの観察結果を実証するには、独立したシングルセルデータセットおよび、免疫組織化学、フローサイトメトリー、qPCR、または機能的アッセイなどの直交的な実験的検証が必要となります。

探索的な薬物-遺伝子相互作用の検索およびADMETアノテーション

MPOを中心とした解析の探索的な拡張として、DGIdbから薬物・遺伝子相互作用情報を取得した。その概要図を以下に示す。 補足図3、および化合物レベルの結果は～に記載されている。 付随表 3DGIdbによるクエリの結果、MPOに関連する化学物質のエントリが不均一なセットとして得られたが、そこには臨床的な妥当性が低い化合物や、好ましくない毒性プロファイルを持つ化合物も含まれていた。したがって、本解析に基づけば、これらのデータベース由来の化合物は乳がんの治療候補とは見なされなかった。予測される物理化学的性質、薬物動態学的性質、および毒性学的性質について予備的な注釈を付すため、ADMET関連情報を要約した。データベースに基づく化合物の検索およびADMET注釈は、臨床的に精査された薬剤の優先順位付けと同等ではない。したがって、これらの結果はあくまでスクリーニングレベルの化学的注釈として機能するものであり、いかなる化合物であっても治療目的の調査を検討する前に、薬理学的、毒性学的、および臨床的なフィルタリングを慎重に行う必要があることを示している。本研究の主な知見は、MPO発現と免疫/骨髄系関連の転写的特徴との関連性に焦点を当てている。

データの可用性：

TCGA-BRCAのトランスクリプトームおよび臨床データは、Genomic Data Commonsポータル（https://portal.gdc.cancer.gov；2025年8月26日にダウンロード；データリリース/バージョン 202208）から取得した。シングルセルデータセットGSE161529は、Gene Expression Omnibus（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529）から取得した。本研究において新たなシーケンスデータは作成していない。解析スクリプトは、https://github.com/tengfeitcm/MPO で公開されている。

マルチオミクス解析、細胞間相互作用、MPO発現、臨床データの統合に関するフローチャート。
図 1: データ収集および解析プロセスのフローチャート. こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

乳がん研究；MPO発現バーチャート、生存曲線、ROC、組織像解析。
図 2: 乳がんにおけるMPOの発現パターンと生存関連の探索的解析。 (A) TCGAデータベースを用いて、33種類の異なるがん種およびその隣接正常組織におけるMPO発現レベルを解析した。 (B) TCGA-BRCAデータセットから非ペアサンプルを選択し、乳がん組織と正常組織におけるMPO mRNA発現を解析した。 (C) TCGA-BRCAデータセットからペアサンプルを選択し、乳がん組織と正常組織におけるMPO mRNA発現を解析した。 (D) TCGA-BRCAコホートにおいて、腫瘍のMPO発現量の中央値で層別化した患者のPFIに関するカプランマイヤー解析。 (E) 解析した公開トランスクリプトームデータセットにおいて、MPO発現に基づく腫瘍と正常組織の判別能を評価した探索的ROC曲線。 (F) 異なる病理学的TステージにおけるMPO発現。 (G) PAM50分子サブタイプ別のMPO発現（サブタイプラベルを表示）。 (H) 隣接正常乳腺組織および乳がん組織の代表的なMPO免疫組織化学（IHC）像。枠で囲まれた領域は高倍率で示した領域である。20×の概観像には100 µmのスケールバーが含まれ、40×の高倍率像には50 µmのスケールバーが含まれている。これらの画像はタンパク質レベルの定性的参照として提示されており、定量的な形態計測または統計解析には使用されていない。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

遺伝子発現解析チャートおよびネットワーク図、ヒートマップ、散布図、ボルケーノプロット。
図 3: 乳がんにおけるMPO関連の相関および差分的発現解析。 (A) TCGAデータベースのピアソン相関係数に基づいた、mRNAレベルでMPO発現と正の相関を示す上位30個のコーディング遺伝子。 (B) ピアソン相関係数に基づいた、mRNAレベルでMPO発現と負の相関を示す上位30個のコーディング遺伝子。 (C) MPOと炎症反応によってアップレギュレートされる遺伝子とのスピアマン相関を示す散布図。 (D) MPOとEMTマーカーによってアップレギュレートされる遺伝子とのスピアマン相関を示す散布図。 (E) MPOとROSによってアップレギュレートされる遺伝子とのスピアマン相関を示す散布図。 (F) 臨床的意義（TステージおよびPAM50）に基づいたMPO関連遺伝子クラスターのヒートマップ。 (G) STRINGデータベースを用いて予測したMPO関連タンパク質のPPIネットワーク。 (H) TCGA-BRCAコホートにおける、中央値で定義されたMPO高発現腫瘍群とMPO低発現腫瘍群の間の差分発現遺伝子のボルケーノプロット。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

パスウェイとオントロジーカテゴリーを示す遺伝子濃縮解析図；棒グラフおよび折れ線グラフ。
図 4: 乳癌におけるMPOの濃縮解析。 (A) MPO高発現群とMPO低発現群の間で差発現した2,013個の遺伝子のGene Ontology濃縮解析。 (B) 2,013個の差発現遺伝子のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomesパスウェイ濃縮解析。 (C) 濃縮された用語に差発現の方向と|log2FC|値を統合したGene Ontology濃縮の複合可視化。 (D) MPO関連免疫関連遺伝子セットの代表的なGSEA濃縮プロット；パネル内に遺伝子セット名、正規化濃縮スコア、およびFDR q値を示す。 (E) 別のMPO関連免疫関連遺伝子セットの代表的なGSEA濃縮プロット；パネル内に遺伝子セット名、正規化濃縮スコア、およびFDR q値を示す。 (F) 別のMPO関連免疫関連遺伝子セットの代表的なGSEA濃縮プロット；パネル内に遺伝子セット名、正規化濃縮スコア、およびFDR q値を示す。 (G) 別のMPO関連免疫関連遺伝子セットの代表的なGSEA濃縮プロット；パネル内に遺伝子セット名、正規化濃縮スコア、およびFDR q値を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子発現解析チャート、免疫細胞浸潤におけるMPOの役割、相関およびデータの可視化。
図5: 乳がんにおける免疫細胞濃縮度とMPO発現の相関関係. (AMPOの発現量とESTIMATEスコア、免疫スコア、および間質スコアとの相関を示す散布図。B) 中央値で定義したMPO高発現腫瘍群とMPO低発現腫瘍群の間における、ESTIMATEスコア、免疫スコア、および間質スコアの差を示すボックスプロット。（C) MPO発現量と主要な免疫細胞集団の推定浸潤度との関連を示すTIMER/TIMER 2.0に基づく解析。（D) MPO発現量と24種類の免疫細胞タイプにおけるssGSEA推定濃縮スコアとのスピアマン相関を示すロリポッププロット。複数の免疫細胞相関から得られたP値は、Benjamini–Hochberg法による偽発見率（FDR）を用いて補正した。(E) TCGA-BRCAコホートにおけるサンプルレベルの免疫細胞濃縮パターンを示すヒートマップ。 (F) 中央値で定義したMPO高発現およびMPO低発現の腫瘍群間における、ssGSEAで推定された免疫細胞濃縮スコア差の第1セットを示すボックスプロット。群間比較には、Benjamini–Hochberg補正を用いたWilcoxon順位和検定を使用した。 (G) 中央値で定義されたMPO高発現群およびMPO低発現群の腫瘍間における、ssGSEAで推定された免疫細胞濃縮スコアの差の第2セットを示す箱ひげ図。群間比較には、Benjamini–Hochberg補正を用いたWilcoxon順位和検定を使用した。(H) 中央値で定義されたMPO低発現およびMPO高発現の腫瘍群における、LM22シグネチャーマトリックスに基づきCIBERSORTで推定した22種類の免疫細胞分画を示す積層棒グラフ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子発現研究におけるDNAメチル化パターンのヒートマップおよび生存分析グラフ。
図 6: 乳癌におけるMPO遺伝子のDNAメチル化分析。 (A) 中央値で定義したMPO高発現群および低発現群におけるMPOメチル化パターンを示すヒートマップ。 (B) cg27456487部位におけるメチル化の予後への影響を示すカプラン-マイヤー生存曲線。 (C) cg02668773部位におけるメチル化の予後への影響を示すカプラン-マイヤー生存曲線。 (D) cg07110356部位におけるメチル化の予後への影響を示すカプラン-マイヤー生存曲線。 (E) cg11151395部位におけるメチル化の予後への影響を示すカプラン-マイヤー生存曲線。 (F) cg14619064部位におけるメチル化の予後への影響を示すカプラン-マイヤー生存曲線。 (G) cg22331200部位におけるメチル化の予後への影響を示すカプラン-マイヤー生存曲線。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

遺伝子発現ネットワーク解析；ダイアグラム、チャート、相関結果；タンパク質相互作用データ。
図 7: TCGAデータベースを用いたmRNAレベルでのMPOおよび好中球関連遺伝子の相関解析。（A）コアタンパク質と他のタンパク質との相互作用を示すタンパク質相互作用ネットワークの可視化。（B）MPOと上位20個の好中球関連遺伝子の相関解析であり、各遺伝子の相関係数とP値の分布を示す。（C）上位20個の好中球関連遺伝子間の相関を示すコードダイアグラムであり、遺伝子間の関連性の強さと方向を視覚的に表している。（D）上位20個の好中球関連遺伝子の相関ヒートマップであり、カラーグラデーションと統計マーカーを用いて相関係数と有意水準を表示している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

細胞クラスターおよび発現解析、グラフ、ヒートマップ、ネットワーク図、RNAシーケンシングデータ。
図8乳がんシングルセルデータセットにおけるシングルセル・クラスタリングおよびMPO関連の細胞間コミュニケーション解析. (A) 細胞型アノテーションのための、クラスター間におけるカノニカルマーカー遺伝子のドットプロット。 (B) アノテーション済み細胞集団のUMAP可視化 (C) 細胞クラスターにおける選択したマーカー遺伝子のヒートマップ。 (D) 提供された遺伝子セットに基づき、AUCell、ssGSEA、およびSeuratのAddModuleScoreを用いて算出した、アノテーション済み細胞型におけるMPO関連スコアをまとめたドットプロット 補足ファイル 1. (E）MPO関連シグナルによって層別化された上皮性腫瘍細胞と他の細胞種との間の通信を描いた細胞間相互作用ネットワーク。エッジの幅は相互作用の強度を、ノードのサイズは総合的な相互作用活性を反映している。（F) 各細胞型における発信および受信シグナリングパターンを示すヒートマップ。(G) 上皮性腫瘍細胞から他の細胞型へ向かうシグナリング経路のバブルプロット（MPO関連シグナルで層別化）。(H) MPO関連シグナルで層別化した、他の細胞型から上皮性腫瘍細胞へ向かう流入シグナル伝達経路のバブルプロット。 (I) アノテーション済み細胞型におけるMPO発現分布。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

データ解析におけるUMAPクラスタリング図、遺伝子発現ヒートマップ、棒グラフ、およびボルケーノプロット。
図 9: シングルセルアトラス解析およびMPO感受性出力の探索的仮想ノックダウン。(A) シングルセルクラスターにおける標準的なマーカー遺伝子の発現を示すDotPlot。ドットの大きさは各マーカーを発現している細胞の割合を、色の強さは平均発現レベルを表す。(B) アノテーション済みシングルセル集団のUMAP可視化。各色は異なる細胞型またはクラスターを表す。(C) 主要なマーカー遺伝子発現のUMAP可視化。骨髄系細胞を含む細胞型のマーカー遺伝子の発現分布を示す。(D) サンプル間における細胞クラスター割合の積層棒グラフ。(E) MPO遺伝子発現のUMAP可視化。(F) シングルセルシーケンシングのQC指標を示すバイオリンプロット。(G) 主要マーカー遺伝子のクラスタリングプロット。(H) クラスターレベルにおける標準的マーカー遺伝子のDotPlot。(I) 仮想ノックダウン感受性解析で変化した遺伝子のボルケーノプロット。(J) 変位と有意性の散布図。(K) マニフォールドアライメントの矢印プロット。(L) 仮想ノックダウン出力から得られた遺伝子のGO BP濃縮解析。(M) 仮想ノックダウン出力から得られた遺伝子のKEGGパスウェイ濃縮解析。(N) MPO除外後に最も高いマニフォールド変位を示した上位20遺伝子。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足図1：TCGA-BRCAコホートにおけるMPOの追加生存解析。(A,B) このファイルには、腫瘍のMPO発現量の中央値で層別化した(A) 全生存期間および (B) 疾患特異的生存期間に関する補足のカプランマイヤー生存解析が含まれています。これらの解析は、図2Dの補足的なアウトカム解析として提供されており、本コホートでは統計的に有意ではありませんでした。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図2：MPOに関する探索的な候補転写因子のアノテーション。（A）3つの公開転写因子リソースから得られた候補転写因子の共通部分を示すベン図。（B）MYC発現比較の出力結果。（C）行および列のラベル付き転写因子相関ヒートマップ。（D）MPO–MYC相関の出力結果。（E）MYC生存解析の出力結果。（F）MYC ROCの出力結果。MYCに関連する出力は、補足的な候補転写因子アノテーションとしてのみ示されており、メカニズム的な上流制御因子の結論を裏付けるために使用されているわけではない。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補完図 3：MPOに関するDGIdbの探索的薬剤-遺伝子検索出力。グレーのノードはMPO遺伝子を、オレンジ色のノードは検索された低分子化合物を表し、接続線はデータベースで予測された薬剤-遺伝子関係を示している。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表1： 22種類の免疫細胞のCIBERSORTベースの免疫細胞デコンボリューション解析に使用したLM22免疫細胞シグネチャーマトリックス。ダウンストリーム解析の前に、遺伝子シンボルの統一、重複項目の削除、および利用可能な遺伝子と対応するTCGA-BRCAまたはGSE161529発現マトリックスとの積集合の抽出を行った。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

付録表2： STRING/PPI解析、ハブ遺伝子の優先順位付け、およびMPOとハブ遺伝子の相関解析に使用した好中球関連遺伝子リスト。 こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表3：MPOに関するDGIdbを用いた探索的な薬剤-遺伝子検索およびADMETアノテーション出力。このファイルには、DGIdbで検索されたMPOに関連する化学物質-遺伝子相互作用レコードと、化合物レベルで予測された物理化学的、薬物動態学的、および毒性関連のアノテーションが含まれています。これらの出力は予備的な化学アノテーションとしてのみ提供されるものであり、治療候補リストとして解釈されるべきではありません。これらは、MPO阻害、ターゲットへの結合、リガンド特異性、選択性、安全性、治療有効性、または臨床的適格性を立証するものではありません。本表の値は、記載された化合物の予測物理化学的パラメータおよび薬物らしさパラメータを示しています。分子量はg/molで表記されています。水素結合受容体および水素結合供与体の値は、それぞれ予測される水素結合受容体および供与体の数を示します。Moriguchiオクタノール-水分配係数は、予測される親油性を示します。Lipinskiの違反数は、各化合物が満たさなかったLipinskiのルールオブファイブ基準の数を示します。バイオアベイラビリティスコアは、予測される経口バイオアベイラビリティ関連スコアを表し、トポロジカル表面積は予測されるトポロジカル極性表面積を指します。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル1：AUCell、Seurat AddModuleScore、およびssGSEAを用いたシングルセルシグネチャースコアリングに使用したMPO関連遺伝子リスト。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 2：MPOに関する探索的候補転写因子およびmiRNAのアノテーション出力。このファイルには、KnockTF、ChIP-Atlas、GTRD、TargetScanなどの公開リソースに基づく、データベース由来の候補転写因子およびmiRNAのアノテーション結果が含まれています。これらのアノテーションは、探索的な候補の優先順位付けのためにのみ提供されるものであり、乳癌におけるMPOの上流制御に関する機能的な根拠として解釈されるものではありません。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本研究では、乳がんにおけるMPO発現と免疫・骨髄系特徴との関連を調べるための、公開データセットを用いた探索的なin silicoワークフローを提示します。TCGA-BRCAの解析により、MPO発現は非腫瘍隣接組織よりも腫瘍組織で低く、またMPOの高発現は無増悪生存期間の延長と関連していることが示されました。しかしながら、全生存期間および疾患特異的生存期間については統計的に有意ではありませんでした。したがって、現在のエビデンスに基づけば、MPOを堅牢または確立された予後バイオマーカーとして解釈すべきではありません。今後の研究では、確立された臨床病理学的変数で調整した多変量Cox回帰モデル、独立した検証コホート、およびサブタイプ別解析を用いてMPOを評価する必要があります。

従来の単一コホートによる変動遺伝子解析や単一プラットフォームによる免疫浸潤推定と比較して、このMPOを中心としたワークフローは、バルクトランスクリプトーム解析、免疫エンリッチメント、メチル化アノテーション、シングルセルマッピング、および仮想摂動を統合することで、MPOに関連する免疫/骨髄系機能についてより広範な探索的視点を提供します。ただし、本ワークフローは外部コホートによる検証、空間的またはタンパク質レベルでの検証、および実験的な摂動アッセイを代替するものではなく、それらを補完するものであることに留意してください。

免疫浸潤および濃縮の結果は、MPOによる免疫リモデリングではなく、MPOに関連する免疫コンテクストとして解釈されるべきである。MPOは主に好中球およびその他の骨髄系細胞で発現している37。したがって、MPO発現とESTIMATEスコア、免疫スコア、免疫細胞濃縮スコア、好中球関連遺伝子、サイトカイン経路、抗原提示シグネチャー、または好中球脱顆粒経路との間の正の相関は生物学的に妥当であり、主にバルク腫瘍サンプル内における免疫細胞または骨髄系細胞の存在量の差を反映している可能性がある。この解釈は、乳がんにおいてMPO陽性好中球の浸潤が良好な予後と関連していること、およびMPOが樹状細胞機能やT細胞主導の組織炎症に関与していることを示した先行研究と一致している38,39。バルクRNA-seqデータでは、MPOが腫瘍細胞固有の活性を持つのか、あるいは観察されたシグナルが主に浸潤免疫細胞を反映しているのかを判断することはできない。細胞の由来と機能を明らかにするには、独立したシングルセルデータセット、空間プロファイリング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、または摂動ベースの実験モデルが必要である。

単一細胞解析によってさらなる記述的情報が得られたが、MPOの検出感度が低いことが制限となっている。KNNベースの近傍拡張を行う前には、わずか85個のMPO陽性細胞しか検出されなかった。KNN拡張により、MPO陽性細胞の局所的な転写近傍にある細胞の感度分析が可能になったが、この手順ではMPOを直接発現していない細胞が含まれる可能性がある。したがって、scTenifoldKnkによる仮想ノックダウンの結果は、MPO介在性のパスウェイ調節の証拠ではなく、探索的な計算感度分析として解釈されるべきである40。メカニズム的な結論を導き出すには、独立した乳がん単一細胞データセットおよび直交する実験的アッセイによる検証が必要である。

転写因子の解析についても、慎重に解釈する必要があります。KnockTF、GTRD、およびChIP-Atlasによる予測の重複と、それに続く次数に基づいた優先順位付けによって候補となる転写因子を挙げることはできますが、乳がんにおけるMPOの機能的な転写調節を確定させることはできません。したがって、MYCおよびその他の候補因子は、探索的なアノテーションとしてのみ保持されました。転写因子の活性は文脈依存性が高く、腫瘍のサブタイプ、細胞組成、アッセイプラットフォーム、および前処理戦略によって変動する可能性があるため、候補因子に上流の調節的役割を割り当てる前に、文脈特異的な検証が必要となります。このような検証には、ChIP-qPCRまたはChIP-seq、プロモーターリポーターアッセイ、および転写因子の摂動後のMPO発現量の測定を含めるべきです。

薬剤–遺伝子の検索およびADMETアノテーションについても慎重に解釈する必要があります。DGIdbは、選択的なMPOリガンドではない化合物や、臨床的な妥当性が限定的である、あるいは好ましくない毒性学的特性を持つ化合物を含む、不均一な化学物質–遺伝子間の関連性を返す可能性があります36。ADMET予測は予備的な化学的アノテーションを提供するものであり、ターゲットへの結合、効力、選択性、安全性、または治療有効性を立証するものではありません41。したがって、現在の化合物レベルの結果を治療可能性の推論に使用すべきではありません。有意義なトランスレーショナル評価を行うには、薬理学的に関連のあるMPO阻害剤またはプローブのキュレーションされたセット、確立されたMPO標的化合物との比較、および生化学的、細胞学的、薬理学的アッセイを用いた検証が必要です。薬剤関連の知見を解釈する際は、がんにおけるMPOのコンテキスト依存的かつ潜在的に二面的な役割についても考慮する必要があります。MPOは、酸化ストレス、反応性酸化剤の生成、DNA損傷、慢性炎症、および腫瘍微小環境のリモデリングを通じて、腫瘍促進プロセスに寄与している可能性があります。同時に、バルク腫瘍データセットにおけるMPOの発現は、好中球またはその他の骨髄系免疫細胞の浸潤を反映している可能性があり、これは一部のコンテキストにおいて、免疫活性化された微小環境や、より良好な臨床転帰に関連している場合があります39,42。したがって、MPOの生物学的な解釈は、腫瘍の種類、細胞源、疾患ステージ、および免疫細胞の組成に依存します。

MPO遺伝子座におけるDNAメチル化の知見もまた、探索的なものと考えられた。MethSurv解析において、選択されたCpGサイトに生存率との関連が見られたが、予後的または機序的な結論を導き出すには、これらの結果に独立した検証が必要である。MPOのエピジェネティックな制御は、転写因子の結合やクロマチンレベルの制御と相互作用している可能性があるが、機能的なクロマチンデータや摂動データが得られない限り、そのような相互作用は推測の域を出ない43。

MPO発現の臨床的意義については、慎重に解釈されるべきである。本結果は、MPOが臨床的に適用可能なバイオマーカーであることや、現在の乳がんにおける免疫療法の決定を導き出せるマーカーであることを立証するものではない。むしろ、MPOは腫瘍微小環境における骨髄系細胞または好中球に関連した免疫状態を反映している可能性がある。今後の研究では、腫瘍浸潤リンパ球、PD-L1発現、免疫チェックポイント遺伝子の発現、分子サブタイプ、および検証済みの免疫シグネチャーを含む、確立された免疫療法関連マーカーと共にMPO発現を評価することが考えられる。MPOを患者の層別化や免疫療法の決定に検討するためには、独立したコホート、多変量モデル、および治療反応データセットを用いた解析を行う必要がある。

再現性を確保するためには、一貫したTCGA-BRCAデータの前処理、腫瘍サンプルのみを用いた中央値に基づくMPO-high/MPO-lowのグループ分け、事前に定義された統計的閾値および多重検定補正、免疫細胞濃縮アルゴリズムとシグネチャーセット、シングルセル品質管理およびアノテーション、KNNベースのMPO近傍拡張、そしてバーチャルノックダウンおよびDGIdb/ADMET出力の探索的な取り扱いなど、いくつかのワークフローステップが極めて重要です。これらのパラメータの変更は、下流の結果や解釈に影響を及ぼす可能性があるため、慎重に報告し、再現させる必要があります。トラブルシューティングにおいては、出力に不整合がある場合、サンプルのソース、発現の正規化、グループ分けのカットオフ、多重検定補正、免疫細胞シグネチャーセット、シングルセルQCおよびアノテーション、KNN近傍の定義、バーチャルノックダウンの閾値、濃縮カットオフ、および不均一なDGIdb/ADMET化合物の記録を確認することで対処してください。

本研究にはいくつかの限界があることを認める必要がある。第一に、本研究はTCGA-BRCAおよび公開されているシングルセルデータを用いた公的データベースの後方視的解析に基づいており、そのため、コホートの不均一性、サンプルソースの違い、バッチ効果、不完全な臨床アノテーション、および腫瘍組成の違いによる影響を受けている可能性がある。第二に、本知見は主にトランスクリプトーム的な関連性とin silico解析から得られたものであり、直接的な実験的検証を欠いている。したがって、MPO発現、免疫/骨髄系特性、メチル化アノテーション、転写因子候補、および仮想ノックダウン出力の間で観察された関連性は、因果関係にあるメカニズムとして解釈されるべきではない。第三に、シングルセルデータセットにおけるMPOの検出はまばらであり、KNNベースの近傍拡張前にはわずか85個のMPO陽性細胞しか検出されなかった。拡張されたMPO近傍サブセットには、MPO発現が低い、あるいは検出不可能な細胞が含まれている可能性があり、純粋なMPO陽性集団とみなすべきではない。第四に、MPOは主に好中球およびその他の骨髄系細胞に関連しているため、バルクRNA-seqデータにおけるMPO関連シグナルは、腫瘍細胞固有の活性を反映しているのではなく、免疫細胞の豊富さ、腫瘍純度、および細胞組成によって混同されている可能性がある。最後に、DGIdbに基づく薬剤-遺伝子検索およびADMETアノテーションは、探索的な化学アノテーションに過ぎない。これらの出力は、MPO阻害、ターゲットエンゲージメント、選択性、安全性、治療有効性、または臨床的適合性を立証するものではない。これらの知見の生物学的および臨床的な関連性を確認するには、独立したコホート、空間的またはタンパク質レベルでの検証、および機能実験を用いた今後の研究が必要である。

要約すると、現在の公開データセット解析は、乳がんにおけるMPO発現と免疫/骨髄系転写特徴との関連を支持しており、解析したコホートではMPO発現が高いほど無増悪期間が長いことに関連していた。これらの知見は依然として探索的であり、仮説を生成する段階にある。MPOが腫瘍免疫微小環境を因果的に調節すること、MYCが機能的にMPOを調節すること、あるいは抽出された化合物に治療的意義があることが立証されたわけではない。本研究の主な貢献は、再現可能な計算ワークフローと、外部コホートによる検証および実験的な確認を必要とする一連の検証可能な仮説を提示したことである。

開示事項

著者らは、本研究における利益相反はないことを報告します。AIベースの言語編集ツールは、原稿改訂時の英語の推敲および可読性の向上を支援するためのみに使用されました。このツールは、研究デザイン、データ解析、図の作成、結果の解釈、文献の選定、または科学的な結論の導出には使用されていません。すべての解析、結果、解釈、参考文献、および最終的な本文は、著者らによって慎重に確認、検討、および承認されており、著者らが原稿の内容について全責任を負います。

謝辞

著者は、航空宇宙センター病院科学研究基金（YN202530）からの資金提供に深く感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CellChatRパッケージ/オープンソースhttps://github.com/sqjin/CellChat細胞間コミュニケーション解析
ChIP-Atlas公開データベースhttps://chip-atlas.org/TFターゲットスクリーニング; 2021年更新 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/GO/KEGGエンリッチメント解析; v4.4.4
CytoscapeCytoscape Consortiumhttps://cytoscape.org/ネットワーク可視化およびトポロジー解析
DGIdbワシントン大学/公開データベースhttps://www.dgidb.org/薬物-遺伝子相互作用の検索
GDC/TCGA-BRCA国立がん研究所https://portal.gdc.cancer.gov/バルクトランスクリプトームおよび臨床データのソース
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/シングルセルデータセットのソース
GSEA/MSigDBブロード研究所https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb遺伝子セットエンリッチメント解析および遺伝子セットリファレンス; Version 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/遺伝子セット変動/ssGSEA関連スコアリング; Version 1.46.0
GTRD公開データベースhttp://gtrd.biouml.org/TFターゲットスクリーニング; 2021 
KnockTF公開データベースhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlTF摂動リソース; Version 2.0 
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/統計計算環境
scTenifoldKnkRパッケージ/オープンソースhttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk仮想ノックダウン解析
SeuratRパッケージ/オープンソースhttps://satijalab.org/seurat/シングルセル前処理およびクラスタリング
STRINGELIXIR/公開データベースhttps://string-db.org/タンパク質-タンパク質相互作用解析; v11 
SwissADMESIBスイスバイオインフォマティクス研究所http://www.swissadme.ch/薬物らしさ（Drug-likeness）の評価; 2017年リリース/ウェブツール 
TIMER公開ウェブリソースhttps://timer.cistrome.org/免疫浸潤解析; TIMER2.0 
UCSC XenaまたはリンクされたTCGAポータルUCSChttps://xenabrowser.net/探索的データアクセス/検証 

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