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方法論記事

患者由来結腸腫瘍オルガノイドと免疫細胞の共培養を評価するためのマルチモーダルフレームワーク

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DOI:

10.3791/71204

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2026年9月3日

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1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、患者由来の大腸腫瘍オルガノイドを自己リンパ球と共培養して樹立し、その後、治療用低分子化合物および免疫チェックポイント阻害剤で処理することで、T細胞の反応性と治療 efficacy を評価する方法について説明します。

要約

T細胞はがん免疫療法において重要な役割を果たしており、腫瘍との相互作用を理解することは、新規の免疫療法を開発する上で不可欠です。本プロトコルでは、当バイオバンクから大腸がん患者由来オルガノイド（PDO）を構築し、自家PDO-T細胞共培養システムを構築するためのステップバイステップのワークフローについて説明します。Annexin V NIRおよび切断型caspase-3染色を用いて、T細胞の反応性と細胞毒性、および腫瘍オルガノイドの殺傷能を評価するための表面および細胞内染色のフローサイトメトリープロトコルを標準化しました。フローサイトメトリーベースの解析に加えて、granzyme Bおよびperforinの分泌量を定量化するELISpotアッセイや、Annexin Vベースのアポトーシス検出によるT細胞介在性の腫瘍殺傷を経時的にモニタリングするライブセルイメージングなどの機能解析の手法についても記載しています。さらに本ワークフローでは、単剤療法および併用療法の両方の設定において、標的阻害剤および免疫チェックポイント阻害剤を導入することを含む共培養条件の設定について詳しく説明します。また、T細胞反応性のためのCD137、T細胞脱顆粒のためのCD107a、腫瘍アポトーシスのためのcaspase-3、および腫瘍増殖のためのKi67など、主要な免疫学的および腫瘍関連マーカーの選択と適用に関するガイドラインを提供します。総じて、本論文は、大腸がんオルガノイドの構築、自家T細胞の培養と増殖、共培養の設定、治療的摂動、およびフローサイトメトリー、ELISpot、共焦点顕微鏡、ライブセルイメージングを用いたダウンストリーム解析のための、包括的で再現可能な枠組みを提供するものです。

概要

大腸がん（CRC）は、早期発見や複合的な治療法の進歩にもかかわらず、依然として世界的ながん関連死亡の主要な原因の一つとなっています1。患者の転帰を改善する上での大きな課題は、ヒトのCRCで見られる複雑な構造、腫瘍内異質性、腫瘍と免疫系の相互作用、および治療反応を正確に再現した前臨床モデルが不足していることです2,3,4,5,6。遺伝子改変マウスモデル（GEMMs）や患者由来がん組織移植（PDX）などの従来モデルは、CRC研究を大幅に進展させましたが、顕著な限界も抱えています。GEMMsはヒト腫瘍の多様性を捉えきれないことが多く、またヒトの生理機能とは大きく異なるマウスの微小環境で構築されます。同様に、PDXモデルは腫瘍の異質性の一部を保持していますが、費用と時間がかかり、免疫不全マウスに依存しているほか、種特異的な差異のためヒト特有の免疫反応を研究する能力に限界があります7,8。さらに、小動物の使用に対する制限が強まっていることから、よりヒトに近い、倫理的に持続可能な代替法の必要性が強調されています。

近年、患者由来オルガノイド（PDO）は、トランスレーショナルがん研究における革新的なプラットフォームとして登場しました。新鮮な手術検体や生検検体から作製されたCRCオルガノイドは、クローン多様性や治療応答性の細胞状態を含む、原発腫瘍の組織学的、遺伝学的、および表現型的な特性を保持しています。これらの特性により、PDOは疾患モデリング、機能ゲノミクス、バイオマーカー探索、および個別化医療のための価値あるツールとなっています7,8,9,10,11。重要な点として、オルガノイドシステムにヒト免疫成分を組み込んだことで、その有用性はさらに拡大しました。CRCオルガノイドと末梢血単核細胞（PBMC）またはエンジニアリングされた免疫サブセットとの共培養により、生理学的に適切なシステムにおいて、腫瘍・免疫相互作用、免疫逃避メカニズム、抗原提示、および免疫療法の応答を調査することが可能になります12。このようなモデルは、チェックポイント阻害剤、CAR-T/TCR療法、および二重特異性抗体の評価をサポートすると同時に、予測バイオマーカーや耐性メカニズムに関する知見を提供します。

免疫療法以外でも、CRCオルガノイドは薬剤スクリーニングや精密腫瘍学への応用においてますます重要になっています。患者由来の培養系を用いて化学療法剤や標的治療薬に対する試験を行うことで、個々の治療反応を予測することが可能であり、いくつかの研究ではオルガノイドの反応と臨床結果との相関が示されています。したがって、これらのシステムは、従来の動物ベースの手法に代わる、スケーラブルで患者中心の選択肢を提供します10,13,14,15,16,17,18。

本プロトコルでは、トランスレーショナル研究および前臨床研究に向けて、患者由来の大腸がん（CRC）オルガノイドを樹立し、それらを免疫共培養システムに統合するための、簡便で拡張可能な手法を提示します。腫瘍組織を酵素的に分散させ、腫瘍の不均一性と系統分化を維持する最適化された増殖条件下で、3次元細胞外マトリックス内に封入します。樹立したオルガノイドは、拡大培養、凍結保存、遺伝子操作が可能であり、分子特性解析、薬剤摂動研究、免疫プロファイリングなどのダウンストリームアプリケーションに利用できます。さらに、PBMCとの共培養により、免疫介在性細胞毒性、チェックポイント阻害剤への感受性、および腫瘍特異的な免疫活性化の評価が可能になります。

さらに、組織処理、オルガノイドの品質評価、フローサイトメトリー解析、免疫蛍光イメージング、およびELISpotを用いた免疫モニタリングのプロトコルについて詳述します。総じて、これらのオルガノイドベースのシステムは、CRCの生物学、治療抵抗性、腫瘍の不均一性、および免疫療法の反応を研究するための、倫理的に持続可能で臨床的に意義のあるプラットフォームを提供します。オルガノイド工学と微小環境統合における継続的な進歩により、これらのモデルは今後のCRC研究およびプレシジョンオンコロジーの基盤であり続けると考えられます。

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プロトコル

すべての患者は、IRB承認済みのMontefiore Einstein Comprehensive Cancer Center Biobankプロトコル（Einstein IRB# 2021-13730）に基づき、インフォームドコンセントを提供した。臨床調整および規制上のサポートは、Cancer Clinical Trials Office（CCTO）によって提供された。腫瘍組織は、標準治療による外科的切除および病理学的検討後に収集され、ホルマリン固定、患者由来オルガノイドの作製、または20% FBSおよび10% DMSOを含むDMEMでの凍結保存のために処理された。すべての試薬調製は表1に記載されている。

1. 生検または切除組織からの腫瘍オルガノイド培養の確立 (4 h)

  1. 採取したばかりの腫瘍組織を滅菌済みペトリ皿に入れ、オルガノイド洗浄バッファーで5回洗浄します。各洗浄は氷上で5分間行います。滅菌済みカミソリの刃または細い針を用い、組織を約（以下略）の小さな立方体状に切断します。 1–2 mm3.
    注： 乾燥を防ぐため、解剖中は氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて組織を湿らせた状態に保ってください。
  2. 切り出した組織断片を15 mL Falconチューブに移し、Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1回洗浄した後、200 xで遠心分離する。 g 室温（RT）で5分間置く。上清を慎重に取り除き、組織片を滅菌済みの6ウェルプレートまたは35mmペトリ皿に移す。
  3. 滅菌しオートクレーブ処理した角度付きのハサミを用いて、組織をさらに細かく刻みます。1X Gentle Collagenase/HyaluronidaseをDPBS 9 mLで希釈し、1 mLの溶液を調製します。これを加え、 10 µL Y-27632（ROCK阻害剤）および 20 µL プリモシンの
  4. 組織片の入った15 mLチューブに、あらかじめ加温した解離溶液を加えます。組織片を撹拌するためにピペッティングを行う際は、P1000チップに再度コーティングを施してください。
  5. 15 mLチューブを以下でインキュベートします。 37 °C ロッキングウォーターバスで30分間振盪し、10分ごとに転倒混和させる。組織片を沈殿させ、消化液の大部分を新しいチューブに移し、500 x gで遠心分離する。 g 室温で5分間。
  6. 元の15 mLチューブにDMEMを1 mL加え、コーティング済みのP1000チップを用いて激しくピペッティングし、組織片を機械的に解離させてさらに多くの陰窩を遊離させる。
  7. 顕微鏡下で進行状況を確認し、組織が単一細胞または小さな細胞塊に分解されているかをモニターします。10–20 µL 組織片を含むDMEMをペトリ皿に移し、顕微鏡下で陰窩（クリプト）を確認します。
    注： インキュベーション時間はサンプルによって異なります。生検サンプルの場合、インキュベーション時間は 15～30分であり、外科的切除の場合は 45–60分。
  8. クリプトが検出された時点（または生検検体では30分後、切除検体では60分後）で、同量の氷冷した基礎培地を加えて消化を停止させ、500 x gで遠心分離します。 g 室温で5分間。
  9. ペレットをDPBSで洗浄して再懸濁し、再度遠心分離を行う。必要に応じて、懸濁液をコニカルチューブに移し、以下の条件で遠心分離する。 300倍 g 室温で5分間 細胞をペレット化するために。
    注： ～のために CRCでは、通常、赤血球溶血は必要ありません。
  10. ペレットが赤色を呈している場合は、以下の条件でインキュベートして赤血球を溶血させます。 5 mL 赤血球溶血バッファー 室温で15分間置く。溶解後、直ちにチューブにPBSを満たし、再度遠心分離を行う。
  11. ペレットを1回洗浄します。 DPBS。～で遠心分離する。 室温で300 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを少量の培地で再懸濁する。以下を用いて生存細胞数を計測する。 血球計数器 トリパンブルー排除法または 自動細胞計数装置
  12. 細胞を〜に再懸濁する 氷冷したMatrigel（基底膜マトリックス） （任意：濃度 約1.5–3 x 104 〜あたりの細胞数 10 µL 培地）。細胞懸濁液を～と混合します。 冷却したワイドボアチップを用いた基底膜マトリックス（研究室によっては、基底膜マトリックスとオルガノイド完全培地を1:1の比率で混合して使用します）。
    注： 基底膜マトリックスおよびすべての混合物を冷蔵保存する 氷冷した 早期重合を防ぐため。
  13. プレート50 µL 細胞と基底膜マトリックス混合液のドームを、あらかじめ加温した滅菌済みの各ウェルに 24ウェル培養プレート。プレートを以下でインキュベートする。 37 °C 基底膜マトリックスがドーム状に凝固するまで、10〜12分間静置します（プレートを逆さまにして置いてください）。
  14. 基底膜マトリックスの凝固後、プレートを正立させます。慎重に次を加えます。 500 µL/well Rock阻害剤（1:1000）およびPrimocin（1:500）を含むPDO培地。
    注： コンタミネーションを防止するため、凍結保存されたオルガノイドバイオバンクが確立されるまで、すべての培地にPrimocinを使用してください。
  15. オルガノイド培地を交換する 週2回 新鮮な完全オルガノイド培地で置換する。顕微鏡下で定期的にオルガノイドの成長を観察する。

2. 血液からのヒトPBMCの分離 (2 h)

  1. 滅菌済みの15 mL FalconチューブにHistopaqueを5 mLずつ分注し、室温に平衡化させた後、同量の新鮮なヒト血（最大5 mL）を慎重に上層に重ねる。界面を乱さないよう、チューブの壁面に沿ってゆっくりと血液をFicollの上に重ねる。1本あたりの合計容量は10 mL以下とする。
    注：最適な分離を行うため、遠心分離前にFicoll層と血液層を明確に分離した状態に維持してください。
  2. 複数のチューブを使用する場合は、遠心分離機内で適切にバランスを取ってください。混合や振盪は避けてください。 血液とフィコールの界面を維持しなければなりません。
  3. ～で遠心分離し、 1500倍 g 室温で15分間静置する。使用して 勾配の乱れを防ぐため、ブレーキ設定を0にします。遠心分離後、a) 最下層の赤血球層、b) 中間のPBMCバフィーコート層、c) 最上層の血漿層の、明確な層が形成されます。バフィーコート層が見えるまで、血漿を慎重に吸引して除去します。
    注： PBMC層を乱さないよう、チューブを慎重に取り扱ってください。
  4. 新しい滅菌ピペットを使用して、慎重に〜を吸引します。 バフィーコート層 PBMCを含む溶液から、細胞を新しい滅菌済みの...へ移します。 15 mL Falconチューブ。Ficollおよび血小板を除去するため、1000 x gで遠心分離し、10 mLのPBSA（PBS + 0.1% BSA）で細胞を2回洗浄する。 g 室温で7分間静置し、洗浄ごとに上清を注意深く除いてください。
  5. 残留血小板を除去するため、PBSAで1回洗浄し、〜で遠心分離します。 200倍 g 室温で7分間静置する。上清を慎重に除去する。ペレットが赤色に見える場合は、5 mLのRBC溶解バッファー中でインキュベートし、赤血球溶解を行う。 37 °C 5分間放置し、その後PBSAで洗浄して200 x gで遠心分離する g 室温で7分間。
  6. PBMCペレットを2 mLのDPBSまたは培地で再懸濁し、トリパンブルーを用いて血球計数器または自動細胞カウンターで生存細胞数を測定する。直ちに使用しない場合は、PBMCを5～10 x 106 90% FBSおよび10% DMSOを含む溶液中で、〇〇 cells/mLの濃度にし、–〇〇℃で徐々に凍結させる。80 °C 一晩静置した後、長期保存のために液体窒素に移す。
  7. PBMCの増殖（7〜12日間）：
    1. 500 x gで遠心分離し、細胞をペレット化する。 g 室温で5分間静置する。5 x 10の濃度で再懸濁する。5 T細胞増殖培地を用いて1ウェルあたり[数値]個の細胞を播種し、CD3/CD28カクテルで活性化させる。
    2. 500 IU/mLのIL-2で細胞を刺激し、3日間インキュベートする。3日目に細胞を混合して計数し、IL-2を添加したT細胞増殖用培地を加えて培養を拡大させる。
    3. 完全T細胞増殖培地を用いて細胞密度を1～2.5 x 10^5 cells/mLに調整し、2日間インキュベートする。増殖期間中は2～3日ごとに生存率をモニタリングする。
      注：2〜3日ごとに新鮮で温めた完全培地に交換してください（〜を超えないようにしてください） >（3日間）。PBMCは、将来の使用に備えてT細胞凍結保存液で凍結保存することが可能です。

3. オルガノイド共培養（4日間）：

  1. 調製および品質管理：
    1. 共培養の前に、オルガノイドが健全であり、汚染がなく、表現型的に特性評価されていることを確認する。同意を得たドナーまたは市販の供給源からPBMCを取得し、使用前に生存率と基本的な表現型を確認する。
    2. PBMCを新鮮な状態で使用するか、静止させた状態で使用するか、あるいは事前活性化させて使用するかを決定し、また、それが自家か同種であるかを確認する。共培養の前に、オルガノイドの生存率、サイズの均一性、およびマーカー発現を評価する。
    3. PBMCの生存率およびベースラインの免疫組成（CD3、CD4、CD8、NKマーカー、単球）を検証し、ドナーのメタデータを記録する。
  2. PBMCとの共培養のためのオルガノイド分離：
    1. 培養液を除去し、各ウェルに予め加温した細胞回収溶液を加えて細胞外マトリックスを溶解させ、オルガノイドを遊離させる。ワイドボアピペットチップを用いてオルガノイドを穏やかに再懸濁し、マトリックスが溶解してオルガノイドが遊離するまで短時間インキュベートする。
    2. 懸濁液を回収チューブに移し、必要に応じて0.5M EDTAを加え、バランス緩衝液で容量を調整する。遠心分離してオルガノイドをペレット化し、上清を除去する。サプリメント（HEPESおよびGlutamax）と抗生物質を含む基礎培地で洗浄し、再度遠心分離して再ペレット化する。
    3. オルガノイドを完全培養培地で再懸濁し、組織培養処理済みのプレートに播種し、さらなる処理の前に約24時間回復させる。
  3. 並行したPBMCの回収：
    1. 標準的な手順に従って凍結保存されたPBMCを急速解凍し、浸透圧ショックを最小限に抑えるために、直ちに予め加温したT細胞増殖培地で希釈する。
      注：解凍中に一定の細胞喪失が生じるのが一般的である。培地を予め加温することで回収率が向上する。
    2. 解凍したPBMCを400 x gで遠心分離して細胞をペレット化し、凍結培地を除去する。細胞の凝集を抑え、単一細胞懸濁液の品質を向上させるため、ベンゾナーゼを含むT細胞増殖培地中で短時間インキュベートする。
    3. 新鮮な増殖培地でPBMCを洗浄し再ペレット化した後、生存率と回復をサポートするためにサイトカイン（例：IL-2）を添加したT細胞培養培地で再懸濁する。共培養の前のオーバーナイト静止期間のため、PBMCをマルチウェルプレートに播種する。
  4. 共培養前準備（共培養の1日前）：
    1. オプションとして、抗原提示経路を強化するために、共培養前に免疫刺激サイトカイン（例：IFN-γ）でオルガノイドを処理する。
    2. 共刺激抗体（例：anti-CD28）でウェルをコーティングし、少なくとも24時間前に共培養プレートを準備して4 °Cで保存する。使用前に、結合していない抗体を除去し、ウェルをDPBSで2回洗浄する。
  5. オルガノイドの単一細胞への分散（共培養実験当日）：
    1. 事前刺激したオルガノイドを回収してペレット化し上清を除去した後、全細胞集団を回収するために、付着細胞とともに酵素分散試薬（例：TrypLE）で再懸濁する。
    2. 穏やかに混合しながらインキュベートし、過消化を避けながら、ほとんどのオルガノイドが単一細胞または小さなクラスターに分散するまで顕微鏡で観察する。
    3. 緩衝液で分散試薬をクエンチし、細胞をペレット化して上清を除去した後、計数および混合のためにT細胞培養培地で再懸濁する。
  6. 細胞計数および共培養の準備：
    1. 細胞懸濁液を穏やかに混合し、血球計数器または生存率染料を用いた自動カウンターを用いて生存細胞数を決定する。T細胞培地中で、腫瘍細胞–PBMC比を目的の密度に調整する。
    2. PBMCをペレット化し、新鮮な培地で再懸濁して生存細胞数を決定し、準備する。必要に応じて、サイトカイン（例：IL-2）およびオプションの免疫調節抗体（例：anti-PD-1）を添加したT細胞培地でPBMCを洗浄および再懸濁する。
  7. 共培養の実施：
    1. 分散させた腫瘍細胞とPBMCを、目的のエフェクター：ターゲット比で混合する。ウェルが乾燥しないように注意しながら、細胞を添加する前にanti-CD28コーティングされたウェルを洗浄する。
    2. オルガノイド–PBMC混合液を必要なアッセイ量で播種し、標準的な培養条件下でインキュベートする。実験中に必要に応じて培養液の更新または分注を行う。
  8. 実験デザインおよびコントロール（治療戦略用）：
    1. 共培養システムを用いて、薬剤（例：チェックポイント阻害剤または低分子化合物）が腫瘍オルガノイドに対するPBMCの反応をどのように調節するかを評価する。
    2. 生物学的反復（複数のオルガノイド株およびPBMCドナー）およびテクニカル反復（条件あたり少なくとも3ウェルのトリプリケート）を含める。
    3. 以下のコントロールを含める：オルガノイドのみ、PBMCのみ（ビヒクルまたは活性化）、オルガノイド ＋ PBMC（ビヒクル）、オルガノイド ＋ 薬剤、およびPBMC ＋ 薬剤の条件。
  9. 典型的な共培養タイムポイントの枠組み：
    1. 開始後24、48、および72時間で共培養物を分析し、免疫活性化、増殖、サイトカイン分泌、アポトーシス、および腫瘍細胞殺傷能を評価する。
    2. 24時間で早期活性化マーカーとサイトカイン分泌を評価し、48–72時間でフローサイトメトリー、イメージング、または生存率アッセイを用いて細胞毒性、増殖、および活性化/疲弊マーカーを評価する。
      注：慢性的な活性化、免疫疲弊、または長期的な薬剤反応を評価するために、より遅いタイムポイント（例：5–7日目）を含めることができる。
  10. オルガノイドの免疫蛍光染色：
    1. スライドをPBSで5分間洗浄し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で室温（RT）で20分間固定する。固定後、スライドをPBSで5分ずつ2回洗浄する。
      注：染色中はオルガノイドを常に水和状態に保つ。必要に応じてスライドを室温のPBS中で最大3時間保存できるが、PBS中でのオーバーナイト保存は避ける。
    2. オルガノイドの構造を維持しつつ細胞内および核染色を可能にするため、0.1–0.5% Triton X-100含有PBSで室温で15–20分間透過処理する。
      注：過剰な透過処理はオルガノイド構造を破壊する可能性があるため避ける。適切な透過処理により、形態を維持したまま均一な細胞質および核染色が確保される。
    3. スライドを1x IFバッファーで2回洗浄し、非特異的染色を減らすため、1–10% BSA（または種特異的な血清）含有IFバッファーで室温で60–120分間ブロッキングする。
      注：BSAは一般的なブロッキングに適しているが、非特異的結合を減らしシグナルの特異性を向上させるために、特定のマーカー染色には種特異的な血清が推奨される。
    4. スライドを3回（各5分間）洗浄し、1%血清ブロッキングバッファー中の一次抗体（10–50 µg/mL）とともに、加湿チャンバー内で4 °Cでオーバーナイトインキュベートする。
      注：蒸発を防ぐためにスライドをパラフィルムで覆い、バックグラウンドを最小限に抑えた特異的染色のために、タイトレーションによって一次抗体濃度を最適化する。
    5. スライドを1x IFで3回（各5分間）洗浄する。
      注：洗浄は個々の抗体染色に合わせて最適化すべきである。複数の一次抗体を同時に使用する場合は、洗浄手順を標準化する必要がある。
    6. オルガノイドスライドを、蛍光標識二次抗体（1%血清ブロッキングバッファーで1:200–1:500に希釈）とともに、加湿チャンバー内で4 °Cでオーバーナイト、または暗所で室温で2時間インキュベートする。
      注：二次抗体を添加した後は、蛍光色素の光退色を防ぐため、以降のすべてのステップを暗所で行う。
    7. スライドを1x IFバッファー（5分間 × 2回）で洗浄し、続いてPBS（5分間）で洗浄する。5%血清ブロッキングバッファー中のDAPI（1 µg/mL）およびAlexaFluor-594標識抗体（20 µg/mL）とともに、暗所で室温で1時間インキュベートし、その後PBSで洗浄（5分間 × 3回）する。
    8. スライドに封入剤を加え、カバーガラスをかけ、気泡が入らないように注意してカバーガラスをスライドに密着させる。または、DAPI含有封入剤を使用する場合は、DAPI染色を省略する。スライドスキャニング用途には硬化型封入剤を使用する。
    9. スライドを室温で1時間乾燥させ、–20 °Cで保存し、共焦点顕微鏡またはスライドスキャナーを用いてイメージングを行う。

4. オルガノイドのフローサイトメトリーおよび細胞内染色のプロトコル

  1. オルガノイド培養液を慎重に吸引し、1x PBSでオルガノイドを1回穏やかに洗浄して、残留した培地と血清タンパク質を除去する。冷PBSまたはリカバリー溶液を用いてオルガノイドを細胞外マトリックスから遊離させ、せん断ストレスを最小限に抑えながら、ピペッティングで穏やかにマトリックスを崩壊させる。
  2. オルガノイド懸濁液を遠心チューブに移し、4 °C、300 x gで5分間遠心してペレット化し、上清を捨てる。酵素的解離のため、オルガノイドペレットを250–500 µLの0.05% TrypLE溶液に再懸濁する。細胞間接合部を効率的に消化するため、37 °Cでインキュベートする。
    注意: 5分ごとに、タッピングおよびピペッティングで懸濁液を穏やかに混合し、過剰消化が起こらないように、単一細胞懸濁液が得られるまで顕微鏡下で観察する。
  3. 細胞懸濁液を40 µmのセルストレーナーに通して凝集塊を除去する。細胞を4 °C、300 x gで5分間遠心し、Ca2+ / Mg2+フリーの1x PBSに再懸濁する。
  4. 細胞数をカウントし、染色バッファーを用いて約1 x 106 cells/mLに調整する。非特異的結合を抑制し、生細胞と死細胞を識別するため、Fcブロック（1:200）および生存率染料（例：Live/Dead Blue、1:1000–1:3000）とともにインキュベートする。
  5. 細胞を室温、暗所にて30分間インキュベートし、その後、1x PBSで1回、染色バッファーで1回洗浄する。
  6. 各抗体を染色バッファーで最適化した希釈倍率に調整し、マスターミックス用の滴定済みµL/test値を用いて総量を算出し、表面抗体カクテルを調製する。
    注意：パネルに複数のポリマーベースの蛍光色素（例：Brilliant Violet、Brilliant Ultraviolet、またはBrilliant Blue染料）が含まれている場合は、蛍光色素間の相互作用を抑制し、信号分解能を向上させるために、抗体カクテルにBrilliant Stain Buffer (BSB) を添加する。BSBは製造元の指示に従って添加し（通常、最終濃度1x）、穏やかに混合して、すべてのサンプル分のマスターミックス（約10%の余剰量）を調製する。遮光し、使用まで氷上に保持する。
  7. 抗体カクテルを添加し、室温、暗所にて30–50分間インキュベートする。染色バッファーおよびPBS（Ca2+⁺/Mg2+⁺フリー）で洗浄し、500 x gで5分間遠心する。濃縮液を希釈液で希釈して、固定/透過化ワーキングソリューションを調製する。例として、濃縮液1：希釈液3の割合で混合し（1xまたは指定のワーキング濃度にする）。
  8. 固定/透過化溶液を添加して細胞を完全に再懸濁し（100万個の細胞あたり約100–200 µL）、遮光し、室温または2–8 °Cで15–20分間インキュベートする。固定後、細胞を1x Permeabilization Bufferで洗浄する。上清を捨てる。過剰な固定剤を除去するため、洗浄を少なくとも1回（場合によっては2回）繰り返す。
  9. 蛍光標識抗体を1x permeabilization bufferで最適濃度に希釈し、細胞内染色カクテルを調製する。必要に応じて、サイトカイン、転写因子、またはリン酸化タンパク質を標的とする抗体を含む細胞内抗体カクテルを、透過化させた細胞に添加する。
  10. 細胞を室温、暗所にて2時間インキュベートする。
    注意：必要に応じて、インキュベーション時間を製造元の最小推奨時間まで短縮するか、染色品質に影響を与えずに4 °C、暗所で一晩インキュベートすることができる。
  11. 細胞を1x permeabilization bufferで2回、染色バッファーで1回洗浄し、ペレットを250–300 µLの染色バッファーに再懸濁する。
  12. 懸濁液を40 µmのストレーナーに通して単一細胞懸濁液を得て、解析までサンプルを氷上または4 °Cで遮光保存する。染色済みサンプルの長期保存は避け、染色後できるだけ早くサイトメーターでデータを取得する。
  13. 蛍光色素に適合する適切なレーザーとフィルターを備えたフローサイトメーターを使用する。単染色サンプルおよびFMO（fluorescence-minus-one）コントロールを含む補正コントロールを設定する。
  14. 堅牢な統計解析のため、1サンプルあたり少なくとも50,000–100,000イベントを取得する。FlowJo、FCS Express、または同等のソフトウェアを使用してデータを解析する。生細胞かつ単一細胞をゲートし、表面および細胞内マーカーの発現を解析する。
    注意：各抗体-蛍光色素複合体を連続希釈して滴定し、最大信号、最小背景、および明確な集団分離が得られる最適濃度を特定する。

5. フローサイトメトリーによるAnnexin Vを用いたアポトーシス解析：

  1. 必須のコントロールおよび試薬：
    1. 無染色コントロール：細胞の自家蛍光のベースラインを確立し、真の陽性シグナルを背景から区別できるようにします。
    2. シングルステインコントロール：適切なコンペンセーション（従来のサイトメトリー）またはスペクトルアンミキシング（スペクトルサイトメトリー）を可能にするため、パネル内のすべてのフルオロクロムについて必要です。これにより、各チャネル間で正確なシグナルの分離が保証されます。
    3. Fluorescence-minus-one (FMO) コントロール：低発現または移行期の集団のゲートを定義するために不可欠です。これにより、弱陽性イベントの過大評価を防ぐことができます。
    4. アポトーシス陽性コントロール：意図的にアポトーシスを誘導させたサンプル（例：スタウロスポリン処理細胞）により、アッセイがアポトーシスイベントを確実に検出できることを検証します。
    5. アイソタイプコントロール：Annexin Vの結合は抗体介在性ではなくホスホリピッド特異的であるため、Annexin V自体には有用ではありません。ただし、必要に応じて追加の表面マーカー抗体に使用することができます。
      注：Annexin Vの結合はカルシウム依存的であるため、カルシウムイオンを含むAnnexin V結合バッファーを使用してください。市販のバッファーまたは検証済みの同等バッファーを使用してください。
    6. 膜非透過性の生存率染料（例：PI、7-AAD、DAPI、または固定可能な死細胞染料）を用いて、早期アポトーシス細胞を後期アポトーシス/壊死細胞から区別します。フローサイトメーターのレーザーおよび固定条件に適合する染料を選択してください。
  2. 染色手順：
    1. プレートを 500 x g で 5 分間遠心分離し、共培養細胞を回収します。培養液と浮遊デブリを除去するため、上澄みを注意深く吸引して廃棄します。背景染色を低減し、干渉タンパク質を除去するために、冷えた染色バッファー（例：1–2% FBS含有PBS）で細胞を2回洗浄します。
    2. リネージマーカーまたはサブセットマーカー（例：PBMCの場合はCD8、腫瘍細胞内のLgr5などの癌幹細胞マーカー）が必要な場合は、抗体カクテルとともに細胞を室温で 30–45 分間、遮光下で緩やかに振盪しながらインキュベートします。この段階で表面染色を行うことで、抗原の完全性が維持され、コンパートメント特異的な解析が可能になります。
    3. 細胞を2回洗浄します。まず冷えた染色バッファーで未結合の抗体を除去し、次にAnnexin V結合バッファー（例：BioLegend Cat. No. 422201）を用いてカルシウムが利用可能な状態にします。結合バッファー中での細胞濃度を約 1 x 106 cells/mL に調整します。
    4. サンプルあたり 100 µL の細胞懸濁液に、フルオロクロム標識 Annexin V 試薬を 5 µL 加えます。選択するフルオロクロムは、パネル内の他の染料とスペクトル的に適合している必要があります。
    5. PI、7-AAD、またはDAPIなどの生存率染料で対比染色します。PIおよびDAPIの最適希釈倍率は、通常 1:1000 から 1:60,000 の範囲であり、装置やレーザー強度によって異なるため、経験的に決定する必要があります。後工程で固定が必要な場合は、固定可能な生存率染料が好ましいです。
    6. ピペッティングにより細胞を緩やかに再懸濁し、室温・遮光下で 20–40 分間インキュベートします。過剰なインキュベーションは非特異的結合や偽陽性を増加させる可能性があるため、最適なインキュベーション時間は経験的に決定してください。
    7. 各ウェルに 200 µL の Annexin V 結合バッファーを加えます（サンプルが高濃度の場合は最低 100 µL）。これにより、フローサイトメトリーに十分な液量が確保され、データ取得中のバッファー条件が維持されます。校正済みのフローサイトメーターで速やかにサンプルを測定し、陰性集団と陽性集団を明確に分離できるよう電圧設定を最適化してください。
  3. 推奨されるゲーティング戦略：
    1. 前方散乱光 (FSC) 対 側方散乱光 (SSC) プロットを用いて小さなデブリや大きな凝集塊を除去し、完全な細胞のみを保持します。FSC-A 対 FSC-H (または FSC-W) ゲーティングを適用してダブレットや凝集塊を除去し、単一細胞のみが解析されるようにします。
    2. 生存率染料に基づき、適宜、強陽性の死細胞を除外します。あるいは、染料を Annexin V 解析のクアドラントに含めます。表面マーカーを用いて、PBMC（例：CD45+）を腫瘍細胞（例：EpCAM+ またはその他の腫瘍特異的マーカー）から区別します。これにより、コンパートメント特異的なアポトーシスの定量が可能になります。
    3. ゲートされた各コンパートメント内で、Annexin V 対 生存率染料をプロットし、以下の4つの集団を生成します：a) Annexin V− / Dye− = 生存細胞、b) Annexin V+ / Dye− = 早期アポトーシス細胞、c) Annexin V+ / Dye+ = 後期アポトーシスまたは壊死細胞、d) Annexin V− / Dye+ = 一次壊死細胞またはアーティファクト（慎重に解釈すること）。
    4. PBMCをさらにサブセット（例：CD4 T細胞、CD8 T細胞、NK細胞、単球）に分画し、特定の免疫集団におけるアポトーシスプロファイルを検討します。

6. オルガノイド共培養におけるT細胞モニタリングのためのELISPOTアッセイ（3日間）：

  1. 0日目に、あらかじめコーティングされたPVDF膜96ウェルプレートを洗浄し、活性化させます。目的の抗体/サイトカイン検出用ELISpotプロトコルキットに従い、4 °Cで24時間保存します。
  2. 1日目に、
    1. セクション3.5に記載されている方法で、オルガノイドを単一細胞懸濁液にします。室温で500 x g、5分間遠心分離し、CTL培地（CTL ELISpotキットに付属）で再懸濁します。凍結保存されたPBMCを融解するか、あるいは新鮮に単離したPBMCを使用します。PBMCを室温で500 x g、5分間遠心分離します。
    2. PBMCをキットの培地で再懸濁します。オルガノイド単一細胞とPBMCを5:1の比率で穏やかに混合し、共培養を行います。共培養混合液を、あらかじめ活性化した96ウェルアッセイプレートの各ウェルに200 µL/wellずつ分注します。プレートを非常に慎重にタッピングします。37 °Cで4時間インキュベートします。4時間後、アッセイプレートをインキュベーターから慎重に取り出します。適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含め、指定のウェルに処理剤を添加します。
      注：サイトカインスポットの発現およびスキャン結果を最適化するために、オルガノイドとPBMCの比率を最適化する必要があります。
  3. 2日目に、
    1. 24時間のインキュベーション後、製造元の染色プロトコルに従います。特定のマーカーを分泌する細胞数を検出および比較するために、シングルカラーおよびデュアルカラーのコントロールを検討してください。インキュベーション時間は色によって異なるため、スポットの発現を定期的にモニタリングしてください。製造元の指示に従ってプレートをスキャンします。分泌された免疫スポットをプロットし、比較します。
      注：実験デザインおよび目的のマーカーに基づき、播種細胞数とスポット数の関係から、シングルカラーまたはデュアルカラーにおけるサイトカイン/抗体の発現が示されます。

7. Annexin V NIRおよびライブセルイメージングを用いたリアルタイムアポトーシス検出（3日間）：

自動化されたライブセルイメージングと組み合わせることで、Annexin V NIRは、薬剤反応および細胞毒性解析のためのアポトーシスによる細胞死のリアルタイムかつハイスループットなモニタリングを可能にします。

  1. 0日目に、オルガノイドを単一細胞懸濁液にする。GFP細胞トレーサーで細胞を染色する。染色した単一細胞を、1ウェルあたり100 µLの完全培地で播種する。細胞を接着させ、クラスターを形成させる。
    注：96ウェルU底超低接着プレートを使用すること。一般的な初期密度（経験的に調整すること）：5,000 cells/well、10,000 cells/well。未処理の陰性対照、ビークル対照、および各実験的処理のためのウェルを含める（3連またはそれ以上）。
  2. 1日目に、凍結保存されたPBMCを融解するか、あるいは新鮮に単離したPBMCを使用する。PBMCを室温で500 x g、5分間遠心分離する。IL-2を添加した増殖培地でPBMCを再懸濁し、インキュベーター内でインキュベートする。
  3. 2日目に、PBMCをイエロー細胞トレーサー染料で染色する。染色後、PBMCをRPMIで再懸濁する。プレートからオルガノイド培地を非常に穏やかに除去する。オルガノイド単一細胞とPBMCを1:5の比率で穏やかに混合し、共培養を行う。PBMCを含む200 µLのRPMI培地を、共培養混合物の各ウェルに加える。プレートを非常に慎重にタッピングし、インキュベーターに入れる。
    注: ウェル底部のオルガノイド単一細胞を乱さないように注意すること。
  4. 37 °Cで2～4時間インキュベートする。4時間後、プレートをインキュベーターから穏やかに取り出す。
  5. 適切な陽性対照および陰性対照を用いて薬剤ウェルを準備する。凍結乾燥されたAnnexin V NIR試薬を100 µLの完全培地またはPBSで再構成し、穏やかに混合する。最終作動濃度の2倍の濃度（例：最終希釈が1:200の場合は1:100）のAnnexin V NIRを含む2x処理培地を調製し、培地が≥1 mM Ca2⁺を含んでいることを確認する。
  6. 1:200に希釈したAnnexin V NIRをウェルに加える。プレートをライブセルイメージングインキュベーターに入れ、その後48～72時間保持する。
    注：十分な細胞間相互作用と測定可能なアポトーシス応答を確保するため、オルガノイド：PBMC比を最適化する必要がある。
  7. ライブセルイメージングおよび解析
    1. 4倍または10倍の対物レンズを使用し、Annexin V NIR用のNIRチャンネルで画像を撮影する（マルチプレックス解析を行う場合は追加チャンネルも使用する）。処理期間に応じて、24～72時間、4～6時間ごとにプレートをスキャンする。
    2. IncuCyte CX3などのライブセルイメージングソフトウェアを使用する。基本的な定量化には、全面積またはオブジェクト数を用いてNIRチャンネルを解析する。単一細胞のキネティクスには、Cell-by-CellまたはObject解析モジュールを使用する。マルチプレックス（例：Cell tracer yellowとGFP）を行う場合は、スペクトルアンミキシングに関する注記を確認すること。

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結果

まず、標準化されたワークフローを用いて、複数の患者から採取した検体から腫瘍オルガノイドを作製しました（図1）。これらのPDOは通常、確立に2週間を要し、その後、さらなる研究のために拡大および継代が可能です。なお、確立までの時間およびオルガノイドの作製効率は組織によって異なる点に注意してください。例えば、一部の組織ではオルガノイドの作製に追加の時間が必要な場合があり、また、一部のオルガノイドでは継代に適したコンフルエンシーに達するまでにより多くの時間を要する場合があります。それに応じて、オルガノイドの培地添加剤を調整することがあります。

次に、本稿に記載したプロトコル（図2）を用いて、オルガノイドとT細胞の共培養系を構築しました。患者の末梢血からPBMCを既述の手法で単離し、その後、増殖させました。腫瘍細胞とリンパ球の比率は最適化する必要があります。この範囲外の比率では、異なる結果が得られる可能性があるためです。比率が低すぎると、オルガノイドとT細胞の相互作用が制限...

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ディスカッション

本プロトコルでは、バイオバンクのリポジトリからPDOおよび増殖T細胞を生成するための、扱いやすく再現性の高い手法について記述しました。また、異なる変異を持つ患者サンプルのPDO CRC共培養セットアップおよび治療レジメンについても詳細に記述しました。得られた結果は、共培養モデルに対する治療の効果を示すものでした。

ここで述べるオルガノイド共培養システムは、複雑な生物学的相互作用をin vitroでモデル化するための、堅牢で適応性の高いプラットフォームを提供します。PBMCを適合する患者由来オルガノイドと統合することで、本プロトコルは従来の2次元細胞培養よりもオルガノイドのシグナリングダイナミクスおよび機能的な不均一性をより適切に再現します。再現性が低い、あるいは生存期間が限定的であった従来のアプローチとは異なり、本手法では培養条件を最適化することで、目的の時点までオルガノイドの完全性とT細胞活性の両方を維持することが可能です20,21。本プロトコルの主な強みはその柔...

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開示事項

C.K.は以下の開示事項を報告していますが、これらはすべて本原稿とは無関係です：Loki Therapeutics（研究費）、Teiko（コンサルタント）、Seattle Genetics（コンサルタント）、Insights Driven Research（コンサルタント）、BMS（コンサルタント）、Guardant Health（コンサルタント）、OMNI Oncology（コンサルタント）、Exelixis（コンサルタント）、Nuvectis Pharma（コンサルタント、薬剤）、Real CME（謝礼）。C.K.およびN.T.は、2025年1月17日に出願された米国仮出願63/746,435の共同発明者ですが、これは本原稿とは無関係です。その他の著者に報告すべき開示事項はありません。

謝辞

本研究は、Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center CCSG (P30CA013330) の支援を受けて行われました。技術的な支援をいただいた Hillary Guzik、Rotem Alon、Jinghang Zhang、Swathi Swaminathan、および Jacky Chuen に感謝いたします。フローサイトメトリー解析は、Albert Einstein College of Medicine Flow Cytometry Core Facility に設置されている、米国国立衛生研究所 (NIH) の資金援助 (1S10OD026833-01) による Cytek Aurora アナライザーを用いて実施されました。共焦点イメージングは、Albert Einstein College of Medicine Analytical Imaging Facility に設置されている、NIH の資金援助 (1S10OD034397-01) による Leica STELLARIS 8 顕微鏡を用いて実施されました。E.N.、W.E.、および C.K. は、NIH グラント T32CA200561、R01CA248536、R42CA287679、および K12CA279871 の支援を受けました。資金提供者は、原稿の作成において一切の役割を担っていません。

また、MM、NSおよびNTに対し、The Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Researchからの支援に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
化学物質、試薬、および抗体
B27サプリメント（ビタミンA不含） GIBCO C12587-010
B27サプリメント GIBCO 17504-044 
N-アセチルシステイン Sigma-Aldrich A9165-5G 
ニコチンアミド Sigma-Aldrich N0636 
ヒト recombinant EGF Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
プロスタグランジンE2 Cayman Cehmicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
コラゲナーゼ type II Sigma-Aldrich C6885 
ヒアルロニダーゼ type IV Sigma-Aldrich H3506 
Advanced DMEM-F12 GIBCO 12634-028 
ペニシリン/ストレプトマイシン GIBCO 15070063
Ultraglutamine type I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
Recovery Cell Culture Freezing Medium GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
ヒト血清（ヒト男性AB型血漿由来） Sigma-Aldrich H3667 
Benzonase Merck 70746-3 
ヒト recombinant interferon gamma Peprotech 300-02 
Dispase type II Sigma-Aldrich D4693 
Cell Recovery Solution Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
Recombinant Human IL-2 (E. coli expression, carrier-free)Biolegend791906
Recombinant Human IL-7 (E. coli expression, carrier-free)Biolegend569706
Recombinant Human IL-15 (carrier-free)Biolegend570306
PE/Cyanine5 抗ヒト CD107a (LAMP-1) 抗体Biolegend328656
Brilliant Violet 711™ 抗ヒト CD137 (4-1BB) 抗体Biolegend309832
Pacific Blue™ 抗ヒト CD8a 抗体Biolegend300928
抗ヒト CD3-APC/Cy7 抗体Biolegend317342
抗ヒト CD4 PerCP/Cyanine5.5 抗体Biolegend980810
Alexa Fluor® 647 抗ヒト/マウス Granzyme B 抗体Biolegend515406
抗ヒト CD56-PE/Cy7 抗体Biolegend985912
PE/Dazzle™ 594 抗ヒト IFN-γ 抗体Biolegend506530
PE 抗ヒト CD274 (B7-H1, PD-L1) 抗体Biolegend393608
精製 抗ヒト CD28 抗体Biolegend302901
Brilliant Violet 510™ 抗ヒト CD45 抗体Biolegend304036
マウス抗ヒト CD326 (EpCAM) 抗体 (PE/Cy7接合)Biolegend324222
抗Ki67抗体Abcamab15580
NucView® 488 生細胞用 Caspase-3 アッセイキットBiotium30029
FITC Annexin V アポトーシス検出キット (PI含有)Biolegend640914
PE/Cyanine7 Annexin VBiolegend640950
Incucyte® Annexin V NIR DyeSartorious4768
LIVE/DEAD™ Fixable Blue 死細胞染色キット (UV励起用)InvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FischerC34567
Cell Trace Far redThermo FischerC34564
Green CMFDAMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (Fc受容体ブロッキング溶液)Biolegend422302
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563794
BD Pharmingen™ Stain Buffer (BSA)BD Biosciences554657
コンペンセーションビーズBiolegends424602
Corning® Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 (1X, カルシウム・マグネシウム不含)Corning20-031-CM
Corning® Dulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水 (1X, カルシウム・マグネシウム含有)Corning20-030-CV
抗ヒト PD1 抗体 (nivolumab)Merus/SelleckchemA2002
ジメチルスルホキシドFisher ScientificBP231-100 
DMEMGenesee25-500
EDTA緩衝液Invitrogen15575020
FBSVWR97068-075
PBSGenesee25-507
パラホルムアルデヒド (PFA)Thermo Scientific Chemicals0473779L
固定/透過化溶液キットBD554714
ガストリン I (ヒト)MilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
CD3/CD28カクテル STEMCELL Technologies 10971
Immunocult 拡大培地STEMCELL Technologies 10981
ProLong Diamond Antifade Mountant (DAPI含有)InvitrogenP36962
Triton X-100Thermo Scientific Chemicals215680025
トリパンブルー溶液 (0.4%)Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
機器
フローサイトメーター / フローサイトメトリーコアCytek (Wuxi) BiosciencesModel No. N7-0021
フローサイトメーター / Singh LabInvitrogenATTUNE NXT (Model no. 4486517)
共焦点顕微鏡LeicaSTELLARIS 8
生細胞解析システムSartoriusIncucyte CX3

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