マウスの拡張期機能評価のためのドップラー心エコー

サマリー

本プロトコルは、マウスを用いたドップラーを用いた経胸腔心エコー撮影法を提示し、収縮期機能および従来の拡張期指標の再現性評価を図ります。

要約

心不全(HF)は、心機能障害を特徴とする主要な世界的健康負担です。収縮期機能の低下や異常な拡張期弛緩が原因で、拍出率保持率(HFpEF)の心不全に見られることがあります。信頼できる前臨床モデルと定量的ツールは、疾患のメカニズムや治療介入の研究に不可欠です。経胸心エコーは、マウスモデルにおける心臓の構造と機能を測定するために広く用いられる非侵襲的な画像診断手法です。このプロトコルは、吸入麻酔下で高周波(30–40 MHz)トランスデューサーを用いてマウスで高解像度ドップラーベースの心エコーを行う標準化された方法を記述しています。動物は温度管理されたプラットフォームに置かれ、心拍数、呼吸、体温を継続的に監視して生理的安定性を確保します。ワークフローには、Bモード、Mモード、パルス波ドップラー、カラードップラー、組織ドップラー画像の取得が含まれ、左心室構造、収縮期性能、従来型拡張期指数の評価を行います。オフライン解析は複数の心臓周期に平均した盲検測定を用いて行われます。この方法は心臓機能の再現性評価を可能にし、心血管疾患のマウスモデルでの縦断的研究に適しています。

概要

心不全(HF)は世界中で6,400万人以上に影響を及ぼし、罹患率と死亡率の主要な原因の一つであり続けています^1,2。臨床的には、駆出率低下(HFrEF)、軽度の射出率低下(HFmrEF)、および駆出率維持型(HFpEF)に分類されます^3,4。HFpEFの有病率増加と標的治療の不足は、心臓表現型化のための堅牢な前臨床モデルと定量的手法の必要性を強調しています⁵。HFpEFの中心的な特徴の一つは拡張期機能の障害であり、実験システムにおける心室弛緩や充填力学の評価に信頼できるツールの重要性を強調しています。

マウスモデルは心血管疾患の研究に広く用いられており、血圧過負荷、虚血損傷、薬理学モデルなどが含まれ、遺伝子修飾にも対応^{可能です。}これらの^{モデルでは}、心臓機能の正確かつ再現性のある評価が極めて^{重要です。}経胸部心エコーは非侵襲的で迅速かつ再現性の高い方法を提供し、繰り返し測定可能な方法で疾患の経過と治療的介入への反応を記録し、in vivoで心臓の構造と機能を評価する能力を備え^{ています。}さらに、研究者や研究動物の放射線被曝を排除するという利点もあり、実験結果が混乱する可能性があります。

本論文の主な目的は、ドップラー心エコーを用いてマウスの左心室拡張期機能を標準化かつ再現性のある方法で評価することです。このプロトコルは、従来の二帽門流流測定と組織ドップラーイメージングを統合し、E/AおよびE/e′比などのパラメータを定量化し、これらは心室の弛緩や充満圧のマーカーとなります。同一動物内で縦断的評価を可能にすることで、この技術は前臨床心不全モデルにおける疾患進行や治療反応の研究を促進します。

ドップラー心エコーがマウス研究で開発され広く利用される理由は、前臨床モデルと臨床心臓病学の間の翻訳ギャップを埋める能力にあります。侵襲的血行動態測定は依然としてゴールドスタンダードですが、その末期的な性質から連続試験での使用は困難です。臨床実践から応用されたドップラー心エコーは、低侵襲方法で拡張期機能の生理学的に関連性の高い指標を得ることを可能にします。高周波超音波システムの進歩により、空間的および時間的解像度が向上し、マウスの急速な心拍サイクルを定量分析のために正確に捉えることが可能になりました¹¹。

心臓磁気共鳴画像法のような代替技術は高価で時間がかかり、利用可能性も限られているため、再検査は実用的ではありません。圧力-容積ループ解析は拡張期機能評価のゴールドスタンダードとされていますが、侵襲的で技術的に要求が高く、通常は末期の処置です。対照的に、心エコーは正確性と実現可能性の実用的なバランスを提供し、小動物の縦断表現型化において最もアクセスしやすい手法となっています。スペックルトラッキングストレインイメージングや左心房機能解析などの新興手法と比べて、従来のドップラーベースの手法は専門的な専門知識を必要とせず、実験室全体でより容易に導入できるため、再現性と比較可能性が向上します。したがって、この方法は特にHFpEFや初期心機能障害において、マウスモデルにおける拡張期機能を評価するための堅牢でアクセスしやすく、翻訳可能なアプローチを提供します(^12,13)。

プロトコル

すべての動物処置は、機関動物ケア・利用委員会(IACUC: 承認番号A00007272-23-R26)によって承認され、機関および国家のガイドラインに従って実施されました。本研究では合計8匹のC57BL/6NJ対照マウスが使用されました。イソフルラン麻酔は、人員への曝露を最小限に抑えるために適切なスカベンジングを用いた校正済みの蒸気器を用いて投与されました。動物は生理的安定を維持し、麻酔過剰摂取を防ぐために心拍数と呼吸を継続的に監視しました。低体温症を防ぐために暖房プラットフォームが使用されました。調査者は肛門体温計を使って深部体温を測定することを選ぶことがあります。角膜乾燥を防ぐために眼用潤滑剤が塗布されました。動物は麻酔下で放置されず、ケージ内で直立姿勢と正常な動きの回復からも完全に目覚めるまで監視されました(材料表)。

1. 動物の調理

1. 画像検査の24〜48時間前に脱毛クリームで胸毛を除去し、湿ったガーゼでしっかりと洗浄してください。
2. 胸部から完全に除去し、皮膚の炎症や赤みが完全に治まるまで確認してから画像検査をしてください。
3. 誘導前に画像診断システム、麻酔装置、モニタリング機器を準備してください。
4. 心臓イメージングプリセットを選択し、画像深度を2〜2.5cm、フレームレート≥200フレーム/秒、ゲインを調整して心筋の可視化を最適化します。

2. 麻酔および生理学的モニタリング

1. 酸素中に2〜3%のイソフルランを用いて麻酔を誘導し、鼻錐で1〜1.5%を維持します。
2. マウスを温度管理された台に仰向けにし、四肢を心電図電極に固定します。
3. 角膜乾燥を防ぐために眼用潤滑剤を塗布してください。
4. 心拍数と呼吸数を継続的にモニタリングしてください。
5. ドップラーE波とA波の分離を確保するために、心拍数を約450〜500拍/分に保ちます。
   注意:心拍数が低すぎる(<400拍/分)はより深い麻酔や負荷条件の変化を反映している可能性があり、高心拍数(>500拍/分)はE/A融合を引き起こす可能性があります。生理的パラメータを正常な生理機能と最適なドップラー信号解釈の両方を維持する範囲内に維持すること。心拍数は約400〜500 bpmが推奨されており、これによりE波とA波の分離が明確になり、拡張期測定の精度が向上します。この目標範囲は、厳密な生理学的要件を示すものではなく、主に測定上の考慮に基づいています。心拍数が400bpm未満の場合は、より深い麻酔レベルや負荷条件の変化を反映し、拡張期指数に影響を与える可能性があります。逆に、心拍数が550 bpmを超えるとE波とA波が融合し、解釈性が制限されることがあります。呼吸数は毎分80〜120回、体温は37 ± 0.5°Cに保つべきです。 安定を維持するためにイソフルラン濃度は段階的に調整する必要があります(±0.1〜0.2%)。

3. 画像処理のワークフロー

1. Bモードイメージング
   1. トランスデューサーを胸骨に沿って配置し、副胸骨長軸の視点を得る。
   2. 複数の心周期にわたる心室と壁の動きを示すシネループ(連続ビデオ録画)を取得します。
2. Mモードイメージング
   1. トランスデューサーを位置づけて乳頭筋のレベルで副胸骨短軸視点を得ます。左心室はドーナツのように見え、4時と8時の位置に2つの乳頭筋の基部が見えます。
   2. Mモードカーソルを室中隔および後壁に垂直に合わせます。
   3. 3〜5周期の心拍を記録し、分析のために保存してください。
3. LVOTドップラー
   1. 大動脈レベルでの血流を視覚化するためにカラードップラーを起動します。
   2. ドップラービームを左心室流出路の流れと平行に整列させます。
   3. 3〜5周期の心拍周期にわたってパルス波ドップラー信号を記録します。
4. 僧帽弁流入ドップラー
   1. 頂端の四室ビューを取得。
   2. パルスドップラーサンプルの容積を僧帽弁の葉の先端に置きます。
   3. E波とA波を200〜300 mm/sの速度で記録します。
5. 組織ドップラーイメージング
   1. サンプルの体積を中隔僧帽弁環に位置させます。
   2. 複数周期にわたる初期(e′)および後期(a′)組織の拡張期速度を記録します。

4. 回復

1. 麻酔を中止し、超音波ジェルを除去してください。
2. ネズミを温かいリカバリーケージに入れてください。
3. 完全に外出できるまでモニタリングし、その後住宅に戻ってください。

5. 画像解析

1. 解析ソフトを開いてシネループを読み込みます。
2. 拡張末期および収縮末期の心室寸法を測定してください。
3. E波とA波の速度を測定し、E/A比を計算します。
4. 速度e′を測定し、E/e′比を計算します。
5. 3〜5周期の平均測定値。

結果

このプロトコルにより、マウスの心臓構造と機能の信頼性の高い評価のために高品質な心エコー画像の取得が可能になります。適切な麻酔、体位調整、生理学的モニタリングは、一貫した画像診断のために不可欠です (図1)。Bモードイメージングは心臓の解剖学を明確に可視化します。頂端4室図はすべての心臓室の評価を可能に し(図2A–B)、副胸骨長軸図は左心室構造を定義し、測定の基準となります (図3A–B)。乳頭筋レベルでのMモードイメージングにより、左心室の寸法や壁厚(LVID、LVAW、LVPW (図4A–B)など)を正確に測定でき、心臓のサイズや収縮期機能の評価を支持します。ドップラーイメージングはE/A比の計算のために僧帽弁の流入E波とA波を明確に示し (図5)、組織ドップラーはE/e′評価のために測定可能なE′およびA′速度を提供します (図6)。最適な心拍数とプローブのアライメントは、波形の融合を防ぎ、正確な測定を確保するために非常に重要です。

図1:マウス麻酔および経胸腔心エコーの位置調整。 (A) 温度制御プラットフォーム、麻酔投与システム、心電図電極接続、超音波プローブ定位装置を示す画像装置。このシステムは、画像撮影中の安定した生理学的モニタリングと正確なプローブ操作を可能にするよう設計されています。 (B) イソフルラン投与のための統合心電図(ECG)電極と鼻錐を用いた画像プラットフォームのクローズアップ。これにより、マウスを標準化された仰向け姿勢に固定しつつ、麻酔を維持します。 (C) 麻酔下で画像診断プラットフォームに仰向けに置かれ、4本の足すべてを外科用テープで心電図電極に固定したマウス。鼻のコーンは吸入したイソフルラン(維持費1.0〜1.5%)を供給し、胸部は最適な画像取得と一貫した心臓モニタリングを確保するために平らに位置しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:頂端4室Bモード心エコー図。 (A) 左心房、左心室、右心房、右心室の4つの心室すべてを単一の画像面に示す代表的なグレースケールBモード画像。 (B) 主要な解剖学的構造を強調する注釈付き画像。超音波プローブは左外側胸壁に位置し、心臓頂端に頭蓋を斜めに向けて最適な可視化を実現します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:胸骨傍長軸Bモードイメージング。(A) 左心室室、心室間隔、後壁を含む心臓解剖学を示す代表的な副胸骨長軸Bモード画像。(B) 心臓の寸法の定量解析のためにエクスポートされた高解像度画像。この視点は、全体の心臓構造を評価し、その後の画像診断モードを指針するために用いられます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:乳頭筋レベルでのMモードイメージング。 (A) 乳頭筋が見える中心室レベルでの胸骨傍短軸図。(B) 対応するMモードトレースで、カーソルは脳室間隔および後壁に垂直に整列しています。 (C) Mモード画像でソフトウェア支援解析を行い、システムが自動的に心臓壁を検出・線を描きます。その後、心周期を通じたLVID、LVPW、LVAWなどの値を計算します。略語;LVID = 左心室内径(心室間隔と後壁の距離);LVPW = 左心室後壁厚;LVAW = 左心室前壁厚;心電図=心電図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:実験セットアップとドップラー信号の概要。 (A) 心臓画像撮影のために胸部領域に超音波プローブを置いた小動物モデルをプラットフォームに置いた実験準備。(B) 局所的な血流信号の強度と方向を示す代表的なカラードップラーマップ。(C) サンプル体積配置を示すパルス波ドップラートレーシングと、初期(E)および心房(A)充填速度を示す代表的なパルス波ドップラー波形。IVRTおよびIVCTが適応されており、同時に心電図追跡を行って心周期の相関関係を得ます。略語;IVRT = 等容的緩和時間;IVCT = 等積収縮時間 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:心筋運動の組織ドップラー画像。 組織ドップラー記録により、心筋壁から取得された初期(E′)成分と心房成分(A′)を含む心筋速度パターンが示されました。波形は電気的および機械的活動を相関するために同期した心電図トレースで表示されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

このプロトコルは、マウスにおけるドップラーベースの経胸腔心コー検査において標準化かつ再現性の高いアプローチを提供し、心臓構造、収縮期機能、従来型拡張期指数の包括的な評価を可能にします。Bモード、Mモード、ドップラーイメージングの組み合わせにより、心血管疾患の前臨床モデルにおける心室寸法、収縮機能、充填ダイナミクスの信頼性の高い定量化が可能となります¹⁴。

マウス心エコー検査における重要な考慮点の一つは、吸入麻酔が心血管生理に与える影響です。イソフルランは心拍数を低下させ、前負荷と後負荷を変化させ、心筋の収縮力を調節することが知られており、これらはすべて^{拡張期機能}のドップラー由来指数に影響を与える可能性があります。したがって、麻酔の慎重な使用と安定した生理的状態の維持が、再現可能で解釈可能な測定を確実にするために不可欠です。心拍数、体温、呼吸数の標準化は変動を最小限に抑え、実験群間の比較可能性を向上させます¹⁶。

従来のドップラー由来指標、すね間管流入(E/A)や組織ドップラー由来のE/e′は拡張期機能の評価に広く用いられており、標準化された取得プロトコルを守れば一般的に再現可能です¹⁷。再現性は、複数の心臓周期にわたる測定値を平均化し、盲検解析を行うことで観察者間および観察者内変動を減らすことでさらに高められます。一貫したプローブの位置取りとイメージング面も、縦^{断研究における}テスト・再テストの信頼性向上に不可欠です。

画像診断時に適切な心拍数を維持することは、マウスの本来心拍数が高いため特に重要です。より深い麻酔を伴う低心拍数では、負荷条件の変化が心室充填パターンに影響を与えることがあります。逆に、過度に高い心拍数はE波とA波の融合を引き起こし、拡張期指標の正確な解釈を制限することがあります。したがって、生理学的関連性とドップラー信号分離の両方を保つ範囲内に心拍数を維持することが、正確な評価のために^{不可欠です。}

このプロトコルは拡張期機能の従来のドップラー指数に焦点を当てていますが、近年の文献で注目されているより高度な心エコー技術は取り入れていません。心筋疲労および負荷率イメージング、左心房機能評価(貯蔵相、導管相、ブースターポンプ相を含む)、左心室の捻挫解消の評価は、心筋の弛緩とコンプライアンスに関する追加の機構的洞察を提供します¹⁹。しかし、これらの技術は専門的な取得プロトコル、高い時間分解能、専用の後処理ツールを必要とし、現在のワークフローの範囲外です。これらのモダリティは、より詳細な拡張期表現型化が必要な場合に補完的なアプローチとみなすべきです¹⁶。

心エコー検査に加え、心臓磁気共鳴画像法(MRI)や侵襲的圧力・容積ループ解析などの代替技術も心臓機能の補完的な評価を提供します。MRIは高い空間分解能と正確な体積測定を提供し、圧力・体積解析はゴールドスタンダードの血行動態データを提供します。しかし、これらの方法はコスト、侵襲性、そして縦断的研究への適性の低下により制約があります。これに対し、経胸エコー心電図は、^{マウスモデルにおける}心機能の連続評価において、迅速かつ非侵襲的かつ広く利用可能な技術として依然として利用可能です。

全体として、このプロトコルは生理学的モニタリングと標準化された画像技術に注意を払うことで、マウスにおいて高品質で再現可能な心エコーデータの取得を可能にします。構造的、収縮期的、従来の拡張期測定の統合により、このアプローチは心臓生理学、疾患進行、前臨床心血管研究における治療的介入を調査する縦断的研究に適しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
除毛クリーム	Nair®	該当なし	画像検査前の脱毛
ヒートパッド	VetEquip(または同等のサービス)	該当なし	体温(~37 & deg;C)
高周波超音波システム	富士フイルム・ビジュアルソニックス	Vevo F2(または同等のモデル)	心臓プリセットを備えた小動物イメージングシステム
イメージングプラットフォーム	ビジュアルソニックス	統合プラットフォーム	心電図およびnbsp;呼吸モニタリング
誘導室とノーズコーン	VetEquip(または同等のサービス)	該当なし	ガス麻酔投与
イソフルラン・ヴェポライザー	VetEquip(または同等のサービス)	クラシック麻酔システム(または同等のもの)	麻酔投与システム
リニアアレイトランスデューサ(30-40MHz)	ビジュアルソニックス	MS550D	マウス心臓画像診断用の高周波プローブ
眼科潤滑剤	ジェネリック(例:Refresh PMや同等のもの)	該当なし	角膜乾燥を防ぐ
手術用テープ	3M(または同等)	マイクロポール手術用テープ	心電図のために四肢を固定する
超音波ジェル	パーカー研究所	アクアソニック100(または同等のモデル)	音響結合
Vevo LABソフトウェア	ビジュアルソニックス	バージョン依存	画像取得と解析