方法論記事

マウス肺における細胞浸透ペプチドによるトランスダクション効率と細胞標的化の評価

DOI：

10.3791/71217

⸱

2026年6月16日

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、細胞透過ペプチドのトランスデューション効率と細胞特異性を評価する統合ワークフローを説明しており、肺標的ペプチド環化されたR11A(cR11A;例としてKAPWHLSSQYSATを挙げる。このワークフローは、ペアフラクションFACS、単一細胞RNAシーケンス、AT2レポーターマウスのフローサイトメトリー、共焦点Zスタックイメージングを組み合わせて、AT2関連ペプチド標的結合を確認します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞貫通ペプチド(CPP)は、細胞膜を越え、トランスフェクション試薬を必要とせずに高分子貨物を届けることができる短いペプチド(5〜30アミノ酸)です。しかし、 in vivo で細胞選択性を定義するには細胞型レベルでの検証が必要です。マウスの後視道静脈注射後、Cy5.5標識された環状CPP(cR11A)のトランスダクション効率を評価する統合ワークフローを提示します。肺は注射後15分または60分に採取され、相補的な測定結果を用いて解析されました。これには、Cy5.5⁺およびCy5.5⁻肺の単一細胞懸濁液を単離するためのペアフラクフ・フルレクション・アクティテッド細胞選別(FACS)が含まれ、その後Sftpc-CreERT2(+/−)からの肺単一細胞の単一細胞の単一細胞RNAシーケンスおよびフローサイトメトリーが行われました。LSL-GFP(+/−) AT2レポーターマウスを用いてGFP//Cy5.5/イベントを定量し、肺のクライオカットの共焦点ZスタックイメージングによりcR11A-Cy5.5とAT2関連シグナルの共局在を確認する。このプロトコルは、複数の補完的な読み取り結果を用いた細胞型結合の整合性証拠を生み出し、異なる標的器官に対する修正を加えたCPPsの細胞特異的標的評価のための再現可能な枠組みを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞貫通ペプチド(CPP)は、細胞膜を通過し、トランスフェクション試薬を必要とせずに高分子貨物を完全な形で細胞内送達を促進する5〜30アミノ酸ペプチドです。in vitroおよびin vivoのファージディスプレイの組み合わせ手法を用いた先行研究では、心筋細胞が5分3,4秒以内に特異的に取り込む12アミノ酸の心標的ペプチド(APWHLSSQYSRT)を特定しました。その伝達メカニズムを調べるためにアラニン検査が行われ、S7AとR11A(APWHLSSQYSAT)という2つのバリアントが発見されました。これらは予想外に体内で肺の濃縮を示しました。したがって、これらは肺標的化ペプチド(LTPs)と呼ばれました5。さらに、N末端リジン付加と頭尾への環化により、血清安定性が大幅に改善され、線形5に比べて細胞内取り込みが著しく強化された環状バージョンのR11A(cR11A)が生成されました。

LTPは、肺胞上皮II型(AT2)細胞を含む遠位肺上皮集団に正確に治療薬を届ける可能性を秘めています。これらの細胞は界面活性剤の恒常性維持に不可欠であり、肺胞再生の前駆細胞として機能します。しかし、LTP開発における大きな課題は、生体内細胞選択性の厳密な評価です。臓器レベルの生体分布だけでは真の細胞伝達と血管信号、細胞外保持、または貪食細胞クリアランスを区別できず、単一細胞分解測定値と補完する必要があります。この制約に対処するため、本ワークフローは単細胞トランスクリプトミック割り当て、リポーターベースのフローサイトメトリー、共焦点Zスタックイメージングを統合し、臓器レベルの蛍光やバイオ分布の読み取りを超えた細胞型レベルのペプチド結合の証拠を生成します8,9。

本プロトコルの全体的な目標は、遠位肺におけるCy5.5標識cR11Aの in vivo でのトランスデューション効率と細胞特異性を検証するための再現可能かつ複数読み出しのワークフローを提供することであり、特に眼窩後方注入後のAT2細胞に焦点を当てています。このプロトコルは、ペプチド関連細胞の同一性を補完的かつ独立した読み取り方法を用いて定義します。これには、ペアドフラクション蛍光活性化細胞選別(FACS)(Cy5.5⁺対Cy5.5⁻)、その後の単一細胞RNAシーケンシングによるペプチド関連集団のマッピング、AT2リポーター肺におけるフローサイトメトリー による 定量的取り込み評価、肺クライオセクションの共焦点ZスタックイメージングによるcR11A-Cy5.5とAT2関連シグナルの共局所確認が含まれます。このプロトコルは他のLTPや送達ベクターに容易に適応でき、発生中のCPPの細胞特異性を評価するために肺や他の臓器系にも適用可能です。特に、臓器レベルの蓄積 評価だけでなく、体内での細胞型レベルのCPP標的の検証が必要な応用に適しています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物処置はメイヨークリニックの施設動物ケア・利用委員会(IACUC)のガイドラインに従って実施され、プロトコル番号A00006842-22-R25の下で承認されました。動物の苦しみを最小限に抑え、関連する国家および機関の規制に準拠した倫理的な取り扱いを確保するためにあらゆる努力がなされました。このプロトコルで使用される研究ツールは 材料表に記載されています。

1. 動物

  1. The Jackson Laboratory(株#000664)で入手した成虫の混血C57BL/6Jマウス(6〜8週齢)を使用してください。
  2. AT2特異的な定量化には、Sftpc-CreERT2(+/+)( Jax Strain #028054)とLSL-GFP(+/+)( Jax Strain #007906)を交配してSftpc-CreERT2(+/−)を生成します。LSL-GFP(+/−) AT2レポーターマウス。
  3. 個別に換気されたケージにいる家ネズミ。すべての動物プロトコルが施設動物ケア・利用委員会の承認を受けていることを確認しましょう。
  4. Sftpc-CreERT2(+/−)にタモキシフェン誘導を行う;LSL-GFP(+/−) マウス。マウスが≥6週齢のとき、トウモシ油に溶かしたタモキシフェン100mg/kgを経口ガベージ で 3回、7日間投与します。最終投与後少なくとも2週間後に実験を行い、最大限の組換え効率を得てください。

2. 試薬および機器の準備

  1. 麻酔薬(ケタミン/キシラジンの作動混合物)を準備してください。
    1. 5 mLの作動液を準備します:ケタミン(50 mg/mL 1 mL)、キシラジン(100 mg/mL 50 μL)、および無菌生理食塩水(3.95 mL)。
    2. 体重1 μL/g を投与します。腹腔内注射(最終投与量:ケタミン10mg/kgおよびキシラジン1mg/kg)。
  2. ペプチド(cR11A-Cy5.5)を準備します。
    1. CPPは凍乾粉末として入手してください。粉末は−20°Cで最大2年間保存するか、DMSOの−80°Cで最大6ヶ月間、光保護チューブ内に保存します。凍結・解凍のサイクルを避け、光への曝露を最小限に抑えましょう。d2011-Cy5.5の10 mMストック溶液をDMSOで準備します。
    2. マウスの体重を測り、投与量を計算し、ストックをヌクレアーゼフリーの水で1 mg/kgに希釈し、最終的な1匹あたり100 μLの体積にします。
  3. 消化バッファー(新鮮で氷は保管)を用意してください。
    1. 2 mg/mL ディスパーゼII、0.1 mg/mL DNase I、DMEM/F12、1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシンを含む消化バッファーを準備します。
    2. マウス1匹あたり3mLを使いましょう。
  4. 非特異的なプロテアーゼ酵素ウォッシュバッファーを準備してください(氷で保管してください)。
    1. DMEM/F12は0.05 mg/mLのDNase Iおよび1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシンを含みます。
    2. マウス1匹あたり10mLを使いましょう。
  5. 赤血球溶解バッファーを準備します(氷を保ちます)。
    1. 10×の溶解バッファーをPBSで1×に希釈します。
    2. サンプルごとに2mLを使いましょう。
  6. 灌流バッファーを用意してください。
    1. 氷のように冷たいDMEM/F12(マウス1匹あたり10mL)を使ってください。
  7. 洗浄バッファーを準備します。
    1. DMEM/F12を2%のFBSで使ってください。
  8. 遠心分離機を4°Cまで予備冷却します。

3. cR11A-Cy5.5の後軌道投与

  1. ケタミン/キシラジンの作動液でマウスを麻酔します。足の指をつまんでも手足を引っ込めないことで、十分な麻酔が確保されているか確認してください。
  2. インスリン注射器を用いて、100μLのcR11A-Cy5.5(1 mg/kg)を経眼窩内静脈注射 で 注入します。
  3. タイマーを起動し、適切な監視のもとで15分または60分間マウスを温熱パッドの上に置いたまま維持してください。

4. 肺の収穫と灌流

  1. 承認されたプロトコル(例:CO₂吸入後子宮頸部脱臼)に従って安楽死させてください。ネズミを仰向けにして、胸部に70%エタノールをスプレーします。
  2. 胸腔を開けて心臓と肺を露出させてください。
  3. 灌流中に排膿できるように右心房に切開をしてください。
  4. 26Gの針を10mLの針に取り付け、氷のように冷たいDMEM/F12を右心室に挿入します。灌流中は右側の心房切開部を開いて排膿を可能にしてください。
  5. シリンジポンプを使わずに手動で、約1〜2分間にわたりDMEM/F12をゆっくりと着実に注入します。注射時は低圧を維持し、肺の過膨張や心室壁からの漏れを目に見えないようにしてください。肺が均一に白くなるまで続けます。

5. 肺の膨張と消化

  1. 気管に20Gの点滴カテーテルを挿入し、3-0シルク縫合糸で固定します。1mLの消化バッファーを1mLの注射器 で 注入し、肺を膨らませます。
  2. 肺を一つの完全な単位として切り離し、すぐに氷の上で冷やした100mm皿に移します。
  3. 肺葉を分離し、15mLの円錐形チューブに移管し、2mLの冷消化バッファー(1本の肺)を装着します。
  4. 回転ロッカー(10〜15回転/分)で4°Cで20時間孵化させます。
    注:詳細な方法論についてはJanas PP.ら10 を参照してください。

6. 組織解離

  1. 100μmの細胞ストレーナーを50 mLの円錐形チューブの上に置き、1 mLの非特異的プロテアーゼ酵素ウォッシュバッファーで事前に湿らせます。
  2. 肺組織をストレーナーに移し、無菌シリンジプランジャーで優しく解離させます。
  3. 10mLの非特異的プロテアーゼ酵素ウォッシュバッファーですすぎます。
  4. 遠心分離機で130 × g、4°Cで15分間。
  5. ペレットを室温で2 mL 1× RBC溶解バッファーに90秒間再懸浮させます。
  6. 溶合液を10mL洗浄バッファーで焼き入れします。
  7. 40μmのこしでろ過し、洗浄バッファーで洗い流します。
  8. 遠心分離機で300 × g、4°Cで5分間加熱します。
  9. 細胞を500〜1,000μLのPBS+2%FBS(≥1 ×10 6 cells/mL)で再懸濁します。
  10. 35μmのフィルターキャップを通してFACS管に通します。
    注:詳細な方法論についてはKonishi S.ら11 を参照してください。

7. ペアドフラクションFACSソート

  1. フローサイトメーターを使って選別を行います。
  2. PBS注入肺を陰性対照として用いてCy5.5ゲートを定義します。
  3. 標準的なゲーティングを適用します:デブリ除去、シングレット、Cy5.5⁺セル。
  4. Cy5.5⁺とCy5.5⁻の集団を別々のチューブに分類します。

8. scRNAシークレットのサンプル調製

  1. 選別したサンプルは氷の上に保管してください。
  2. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、500 μLバッファーで再懸濁します。
  3. 生存可能性≥80%の場合にのみ進めてください。
  4. 必要に応じてライブラリやシーケンスを準備してください。

9. AT2レポーターマウスにおけるフローサイトメトリー

  1. 第5〜6節に記載された肺単細胞懸濁液を準備します。
  2. 直せる生死染料(1:1,000)で30分間(光から守るため)ステインをします。
  3. 300 × g で4°Cで5分間洗浄・遠心分離します。
  4. ろ過してサンプルを氷に保管してください。
  5. フローサイトメーターでデータを取得してください。
  6. ゲーティングを行い細胞の特定、シングレットの選択、死細胞の除外、GFPおよびCy5.5の集団を定義します。
    1. GFP⁺/Cy5.5/イベントをGFP⁺細胞の割合で定量化します。

10. 固定とクライオプロテクション

  1. 肺を1mLの4%PFAで膨らませ、気管を固定します。
  2. 4°Cで10mLの4%PFAを一晩固定します。
  3. PBSで洗う(3×)。
  4. 15%ショ糖に一晩培養します。
  5. 30%ショ糖に移して~48時間。

11. 埋め込みと冷凍解剖

  1. OCTでクライオモールドを準備し、肺を位置づけてOCTに埋め込む。
  2. 液体窒素を使って冷凍します。保存温度は˗80°Cです。
  3. 平衡後10μmで切片。一晩中自然乾燥させて滑り降ろします。

12. イメージングと解析

  1. PBSで洗浄する部分(3×)。
  2. DAPI中型でマウントします。
  3. 共焦点Zスタックを入手。
  4. 適切な画像設定を使用してください。
  5. 3D再構築を行う。
  6. 一貫した閾値を用いて共局在化を定量化します。
    オプションの方法:
    これらのオプション方法は代表的なワークフローには含まれていませんが、肺細胞の大部分を占めるCD45⁺免疫細胞群の枯渇や解析を可能にするために組み込まれることがあります12。
    注: 非免疫肺集団に焦点を当てる分析ではCD45⁺除去または除外を用い、これらのステップは免疫細胞の取り込み信号を除去または分離し、サンプルの細胞組成を変化させます。CD45染色は、CD45⁺免疫細胞集団を別々に解析するためにも用いられます。

13. CD45+ 細胞群の減少

  1. 組織解離(ステップ6)後、磁気ビーズに結合したCD45抗体(Miltenyi Biotech 130-052-301)または、Cy5.5、GFP、生死染色と適合する蛍光体に結合したCD45抗体(例:CD45-BV605(BioLegend #103140)のいずれかを使用します。暗闇で4°Cで20分間ステインします。
  2. CD45磁気ビーズ除去を行う場合は、製造元の指示に従って系譜除去(LD)カラム(Miltenyi Biotech 130-042-901)を使用し、磁気セル分離(MACS)(Miltenyi Biotech)を行ってください。次にペアフラクションFACSソート(ステップ7)に進みます。
  3. 蛍光共役抗体を用いてCD45除去を行う場合は、まず細胞懸濁液をウォッシュバッファーで洗浄し、余分な抗体を除去します。次にステップ7に進みましょう。ダブルレットやデブリを排除するゲートを設定した後(ステップ7.3)、CD45+ 集団を除外する追加のゲートを挿入します。その後、 ステップ7.4に進みます。

14. フローサイトメトリー中にCD45+ 細胞群を解析する

  1. ステップ9.3の後、Cy5.5、GFP、生死染色(例:CD45-BV605、BioLegend #103140)と適合する蛍光体に結合したCD45抗体を使用します。暗闇で4°Cで20分間ステインします。
  2. 過剰な抗体を除去するために、細胞懸濁液を洗浄バッファーで洗浄してください。次にステップ9.4に進みます。ダブルレットやデブリを排除するゲートを設置した後(ステップ9.6)、さらにCD45+ 集団を除外するゲートを挿入し、その後GFP+ およびCy5.5+ 集団を確立するゲートを行います。12。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの成功した適用は、ペアドフラクションscRNA-seq、リポーターベースのフローサイトメトリー、共焦点Zスタックイメージングという3つの補完的な読み取り結果から一致する証拠を生成するはずです。

ペアフラクションscRNA-seq解析では、cR11A-Cy5.5.5の全身投与後にCy5.5⁻およびCy5.5⁺肺単一細胞画分を回収し、別々に解析しました。UMAPの可視化により、免疫細胞、内皮細胞、上皮細胞、間葉細胞の各区画を含む主要な肺細胞群が特定されました(図1A, B)。免疫細胞は選別された両画質で優勢集団を示しましたが、Cy5.5/1画は上皮細胞を含む非免疫区画の相対的な濃縮を示しました(図1C)。上皮サブセット解析では、Cy5.5/分画にAT2細胞の代表性がCy5.5/分画よりも多く見られ、一方でAT1細胞は両分画とも低く残りました(図1D)。これらの結果は、ペアフラクションのscRNA-seqがcR11A-Cy5.5陽性肺細胞フラクション内のAT2細胞の濃縮を識別できることを示しています。

フローサイトメトリーを用いて、リポーター定義されたAT2細胞内でcR11A-Cy5.5シグナルを定量しました。代表的なゲートには、FSC-A/SSC-Aによる全細胞の選択、2つの連続シングルレットゲート、ライブセルゲーティング、最終GFP対GFP が含まれます。 Cy5.5の分析(図2A–E)。対照試料ではGFP⁺/Cy5.5⁺イベントが最小限であり、背景蛍光閾値を確立しました。cR11A-Cy5.5投与後、GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2報告陽性イベントは注射後15分で7.99%、60分後に7.41%に増加しました(図2E)。これらの結果は、 AT2レポーター陽性細胞における検出可能なcR11A-Cy5.5シグナルを体内で支持しています。

共焦点Zスタックイメージングは、肺組織切片におけるペプチド関連蛍光の空間的検証を提供します。背景蛍光を評価するために非報告対照群を含め、GFPおよびCy5.5チャネルの信号は最小限であった。cR11A-Cy5.5処理されたAT2リポーター肺では、GFP⁺ AT2リポーター陽性細胞の近くでCy5.5蛍光が検出され、Imaris生成の共局在チャネルによりGFPとCy5.5シグナルの重なりが確認されました(図3A)。代表的なImaris共局在解析では、GFP⁺ AT2区画内でそれぞれ15分と60分で89.6%と86.8%の共局在が示されました(図3B)。

最適でない結果としては、対照試料における高い背景Cy5.5蛍光、上皮細胞回復不良、細胞生存率の低下、GFP/Cy5.5/イベントの分離が弱いなどが挙げられます。これらの問題は通常、灌流不全、過剰な組織破壊、不十分な補償、または画像検査閾値の不一致を示します。

figure-results-1
図1:ペアドフラクションscRNA-seqはcR11A-Cy5.5陽性肺分画における肺胞上皮の濃縮を特定します。 cR11A-Cy5.5の後方眼窩注射後、肺の単細胞懸濁液はCy5.5⁻およびCy5.5/5/分画に分類され、それぞれの分画は単細胞RNAシーケンシングで解析されました。(A) UMAPプロットは、代表的なマウスの一致した細胞型クラスターを示します。(B) UMAPオーバーレイはCy5.5⁻およびCy5.5⁺セルの分布を示します。(A)および(B)で囲まれた領域は、上皮部分集合解析で強調された上皮区画を示しています。(C) 免疫集団は両側に非常に多く、それぞれの80%以上を占めています。Cy5.5/分画と比較して、Cy5.5/5分画は内皮、上皮、間葉系の集団の割合が高く、これらの集団内でcR11Aの取り込みが示唆されています。(D) 上皮集団内で、AT2細胞はCy5.5/fractionよりもCy5.5/fractionでより多く代表されているのに対し、AT1細胞は両細胞とも低く残ります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2
図2:AT2レポーター肺におけるcR11A-Cy5.5取り込みのフローサイトメトリー検証。 AT2レポーターマウスには、経眼窩静脈注射 で cR11A-Cy5.5を投与し、注射後15分または60分後に肺を採取して単細胞製剤を行った。PBS車両対照(Ctrl)およびcR11A-Cy5.5処理サンプルの代表的なゲートを示している:(A) 細胞はFSC-A/SSC-Aで選択され、(B, C) シングルレットは散布型ダブレット排除でゲート化され、(D) 生体細胞は生存性染料除外で同定され、(E) GFP(AT2レポーター) が比較された。 Cy5.5はGFP/Cy5.5/イベントの定量化に用いられました。この代表的なデータセットでは、cR11A-Cy5.5投与後15分および60分の時点でGFP⁺/Cy5.5⁺ AT2イベントは約8%でした。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-3
図3:AT2レポーター肺におけるcR11A-Cy5.5取り込みの共焦点イメージングおよびImaris共局在解析。 (A) 非リポーター対照(Ctrl)およびcR11A-Cy5.5処理済みAT2リポーター肺の代表的なフィールドを示し、注射後15分または60分に採取し、クライオセクティングおよび共焦点Zスタックイメージングを行います。GFPシグナル(緑色)はAT2細胞を示し、cR11A-Cy5.5蛍光(赤色)はペプチド関連シグナルを示します。「Coloc」パネルにはイマリス(黄色)によって共局所化されたピクセルやオブジェクトが表示され、合成画像は2つのチャンネル間の空間的重複を示しています。非報告対照群はGFPチャネルおよびCy5.5チャネルの背景蛍光を評価するために含めました。(B) GFP⁺ AT2区画内の共局在の定量化では、GFP信号の89.6%と86.8%がそれぞれ15分および60分でcR11A-Cy5.5と共局在であることが示されています。これらのデータは両時点でGFP⁺ AT2細胞との強固な重なりを示し、 in vivoでのAT2コンパートメントの優先的な関与を支持しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、複数の独立した読み取り結果を補完的な解像度で動作させることで、特定の細胞集団のペプチド標的を特定します:トランスクリプトームレベルのマッピング(ペアドフラクションscRNA-seq)、定量的イベントベースの測定(リポーターフローサイトメトリー)、空間的確認(共焦点Zスタック)。これらのアプローチは、血管蛍光や細胞外保持の交絡、ペプチド関連シグナルを特定の肺細胞集団に割り当てられないなど、器官レベルでの蛍光またはバルクバイオ分布研究に内在する一般的な曖昧さを軽減します7。

いくつかの手順には特に注意が必要です。灌流品質は背景蛍光および下流の選別性能に強く影響します。十分な灌流はすべての肺葉が均一で象牙色の白色になることが特徴ですが、不完全な灌流は非標的区画でCy5.5信号を上昇させることがあります。組織解離には、通常の消化条件(37°C、1–2時間)ではなく、上皮細胞群を保存し、特に肺胞タイプI(AT1)細胞の回復を促進するために、通常の消化条件(37°C、1–2時間)を長時間の冷消化(4°C、20時間)で用いています。AT1細胞は大きく薄い形態のため、機械的消化に非常に敏感であるため、分離時に容易に失われます。標準的な実験室での操作、例えば一貫した消化、補償、ゲーティング、閾値測定に加え、3D共局在解析は、ペプチドシグナルがAT2リポーターシグナルと重複しているかどうかを判断するのに役立ち、二次元の蛍光重複だけに頼るのではなく、13。

scRNAセクシーやフローサイトメトリー定量の前に、CD45⁺免疫細胞除去ステップが検討されることがあります。免疫細胞は肺細胞集団の大部分を占めており、異物に対する典型的な免疫応答の一環としてCPPを取り込むことがあります。内皮、上皮、間葉系など非免疫集団におけるCPP取り込みをより正確に定量化するために、CD45⁺細胞の除去により感度が向上する可能性があります。これは、選別前のビーズ除去やフローサイトメトリー解析時にCD45⁺細胞を除外することで達成できます。しかし、この修飾は免疫細胞の取り込み情報を除去し、分析対象サンプルの細胞組成を変化させるため、選択的に使用すべきです。

このワークフローにはいくつかの制限を考慮する必要があります。Cy5.5蛍光はペプチド関連シグナルを識別しますが、それだけでは内部化されたペプチドと膜付着性または細胞外シグナルを区別することはできません。ペアドフラクションのscRNA-seqは、組織解離、細胞回復、選別閾値、各肺細胞集団の相対的存在比にも影響を受けます。そのため、基底細胞やイオンサイトのような希少な集団は過小代表または見逃されることがあります。リポーターマウスフローサイトメトリーはより強力な細胞型割り当てを提供しますが、適切なリポーターラインまたは検証済み抗体パネルが必要です。さらに、リポーターマウスを用いた車両対照群は、画像アッセイにおけるGFP/AT2細胞内の背景共局在をより明確に定義できます。したがって、解釈は単一の結果ではなく、scRNA-seq、フローサイトメトリー、共焦点画像における一致した証拠に基づくべきです。

このワークフローはモジュール化されており、代替蛍光体、レポーターマウス株、投与スケジュール、収穫時点に適応可能です。追加の細胞や臓器特異的CPPを開発する研究では、ペアドフラクションscRNA-seq設計を他の臓器(例:肝臓、腎臓、脳)に修正を加えて適用できます。このプロトコルは、同一動物の単一臓器内のペプチド関連集団を効率的に比較し、解釈性を向上させつつ動物間変動を低減します。今後の応用には、追加のCPPのスクリーニング、CPP–カーゴ共役体の試験、線形ペプチド設計と環状ペプチド設計の比較、組織構造や標的細胞の存在比が変化する疾患モデルへのワークフロー適用などがあります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究はNHLBI R01助成金HL153407、NIH助成金HL092961、NHLBI F32助成金HL175907によって支援されました。

材料

```html

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Anti-mouse CD45-BV605 antibodyBioLegend103140CD45+細胞の同定または除外に使用
C57BL/6J マウスThe Jackson LaboratoryStrain #000664実験に使用される野生型マウス
CD45 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-052-301CD45+細胞の磁気除去に使用
セルカウンターInvitrogenCountess 3; AMQAX2000自動セルカウント
CO2インキュベーターThermo ScientificHeracell VIOS 160i; TSH160IDS細胞のインキュベーション
共焦点顕微鏡ZeissLSM 980; 1872-551z-stack画像の取得に使用
cR11A-Cy5.5ペプチドMayo Clinic Proteomics Coreカスタム合成; カタログ番号なしインビボでのデリバリーに使用する蛍光標識CPP
クライオスタットLeica BiosystemsLeica CM1950組織の切片に使用
Dispase IISigma-AldrichD4693-1G肺組織の消化に使用する酵素
DMEM/F12Gibco11330-032細胞の解離と洗浄バッファー
DNase IRoche10104159001DNAを介した細胞の凝集を減少させる
FACSセルソーターBD BiosciencesBD FACSAria II, 4 レーザーシステムCy5.5+およびCy5.5-細胞のソーティングに使用
FBSGibcoA52567-01セルの生存率を向上させるためにバッファーに追加
FlowJo ソフトウェアFlowJoバージョン 10.10.0フローサイトメトリーデータ分析
GraphPad Prism ソフトウェアGraphPad Softwareバージョン 10統計分析とプロット作成
Imaris ソフトウェアOxford Instrumentsバージョン 9.9.13D視覚化とコロケライゼーション分析
振動付きインキュベーターThermo ScientificSolaris; 01-258-086組織の消化に使用
ケタミンWestWard (Hikma)NDC 0143-9508-01
LD カラムMiltenyi Biotec130-042-901磁気細胞分離（MACS）に使用
LD カラムMiltenyi Biotec130-042-901
Live/dead fixable yellow dead cell stain kitInvitrogenL34968フローサイトメトリーの生存率染色に使用
Live/dead fixable yellow dead cell stain kitInvitrogenL34968
LSL-GFP レポーターマウスThe Jackson LaboratoryStrain #007906Cre-誘導型GFPレポーターライン
LSL-GFP レポーターマウスThe Jackson LaboratoryStrain #007906
マイクロ遠心分離機EppendorfEPP-5427Rサンプルの遠心分離
マイクロ遠心分離機EppendorfEPP-5427R
DAPIを含むマウンティング液AbcamAB104139イメージングのための核反染
DAPIを含むマウンティング液AbcamAB104139
ヌクレアーゼフリー水Qiagen175034992
経口投与針Braintree ScientificN-PK 020
PBSGibco10010-023一般的な洗浄バッファー
PBSGibco10010-023
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122細菌汚染を防ぐ
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122
冷蔵遠心分離機Thermo ScientificST16R; TSST16R制御された温度でのセルペレティング
冷蔵遠心分離機Thermo ScientificST16R; TSST16R
生理食塩水Baxter2F7124
Sftpc-CreERT2 マウスThe Jackson LaboratoryStrain #028054AT2特異的な誘導性Creライン
Sftpc-CreERT2 マウスThe Jackson LaboratoryStrain #028054
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 レポーターマウス自家繁殖Sftpc-CreERT2(+/+) マウスとLSL-GFP(+/+)マウスを交配して生成AT2特異的なGFPラベリングに使用
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 レポーターマウス自家繁殖Sftpc-CreERT2(+/+) マウスとLSL-GFP(+/+)マウスを交配して生成
シルクスアチュアLookSP117
シングルセルRNAシーケンシングサービスMayo Clinic Genome Analysis Corehttps://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/servicesライブラリ調製とシーケンシング
シングルセルRNAシーケンシングサービスMayo Clinic Genome Analysis Corehttps://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
タモキシフェンSigma-AldrichT5648
水浴インキュベーターFisherbrandIsotemp GPD 28温度制御されたインキュベーション
水浴インキュベーターFisherbrandIsotemp GPD 28
キシラジン（ロムン）DechraNADA #047-956
```

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

RNA

関連記事