肺線維症フェレットモデルにおける肺実質および気道再構築の定量的マイクロCT解析

サマリー

ここでは、フェレットモデルにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症の特徴を定量的に評価するためにマイクロCTを用いるプロトコルを提示します。このフェレットモデルは、肺線維症の理解や新療法の検証において強い翻訳的可能性を示しています。

要約

肺線維症(PF)は、反復性肺泡損傷を特徴とする慢性かつ進行性の肺疾患であり、肺実質の肥厚、瘢痕形成、呼吸障害を引き起こします。特にブレオマイシン(BLEO)を用いた現在の齧歯類モデルは、呼吸気管支の欠如などの解剖学的差異により、ヒト特発性肺線維症(IPF)への翻訳的関連性は限定的です。この制限に対処するため、私たちは人間に似た呼吸性細気管支を持つフェレットの肺線維症の大型動物モデルを開発しました。生後3か月の野生型フェレットには気管内にBLEO注入を受けました。治療後8週間で肺を採取し、マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)および組織学的評価を行いました。マルチディテクターCT(MDCT)によるフェレットの小気道の可視化における空間分解能の制限により、切除された肺はマイクロCTスキャナーを用いて、制御された気道圧力(0 cmH₂Oおよび25 cmH₂O)で体外画像化し、呼気および吸気条件を模擬しました。

マイクロCT画像により、正常なフェレット肺とBLEO処理済みの肺の間に明確な構造的差異が見られました。正常肺は減衰が低く建築構造が保存されていたのに対し、BLEO処理肺は線維症と一致する著しい減衰を示しました。ヒト線維化性肺疾患の特徴として、嚢胞性空間を伴うハニカム状、小葉中隔の肥厚化、初期の線維化または炎症性変化を示す研磨ガラスの不透明性などが認められました。定量的なマイクロCT解析を用いると、BLEO処理されたフェレット肺の気道は、加圧された空気圧の両方で放射状膨張、縦方向の伸縮、体積変化が有意に減少することが観察されました。さらに、世代別解析では、視界線維化が見られる領域における気道壁の有意な肥厚が示されました。マッソンのトリクロム染色を含む組織学的評価により、広範なコラーゲン沈着と線維化が確認されました。

本研究は、BLEO処理フェレットがヒト肺線維症に似た放射線学的、機械的、組織病理学的特徴を発達させることを示しています。さらに、マイクロCTは線維化性分布、気道動態、肺容積変化の高解像度評価を可能にします。これらの発見は、フェレットがPFの病因を研究し新規治療戦略を評価するためのトランスレーショナルモデルとしての可能性を強調しています。

概要

肺線維症(PF)は、繰り返しの歯槽損傷が実質肥厚、線維化、進行性^{呼吸機能障害}を引き起こす慢性かつ進行性の間質性肺疾患です。肺線維症は、薬物、環境毒素、感染症、基礎疾患など様々な曝露によって引き起こされることがあり、特発性の場合^{もあります。}特発性肺線維症(IPF)患者に対して進行を遅らせる薬剤が開発されていますが、肺線維症は依然として治癒不可能であり、診断後3〜5年の生存率が^1,2です。ほとんどの場合、決定的な治療法は肺移植です。したがって、新たでより効果的な治療法の開発が緊急に求められています。

ブレオマイシンは、ヒトで悪性腫瘍の治療に一般的に用いられる薬剤です。しかし、肺毒性により使用が制限されており、急速に肺線維症へと進行^{する可能性があります。}この副作用の発見を受けて、ブレオマイシンは肺線維症の動物モデル開発の研究に用いられました。マウスは^{この目的で}一般的に用いられ、IVや気管内挿入を含む様々なブレオマイシン投与^法を用いています^。これらのモデルでは線維化が進行しますが、いずれも人間で見られる肺線維症の主要な特徴をすべて含んでいる^{わけではありません。}齧歯類の肺線維症モデルは、ハニカム嚢胞形成や遠位肺胞の気管支化など、進行した疾患の主要な特徴を反映^{していません。}さらに、研究によれば、ブレオマイシンによる肺損傷は、ブレオマイ^{シン治療から}約28日後に齧歯類で自然に治癒し始めることが示されています。さらに、これらのモデルで線維化を抑制することが示された薬剤は、ヒトでは同等の効果を示さず、^{治療選択肢を}制限しています。

家畜のフェレット(Mustela putorius furo)は、解剖学的に人間の呼吸器系に類似しているため、呼吸器生物医学研究でますます利用されています¹²。さらに、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)やインフルエンザなど、人間に感染する類似の呼吸器病原体にも感受性があり、生理学的な類似性を示しています¹²。フェレットモデルでは、ブレオマイシンの細気管支化、線維化焦点の形成、異常な基底細胞様細胞(KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)の存在が^{示されています9}。フレオマイシンの単回投与でフェレットに持続的な肺線維症が誘発され、制限的な生理学的特徴と線維化性肺の異常が少なくとも22週間持続しました¹³。この発見は、線維症が一般的に自己制限的で約28日後に改善し、6〜8週間で大幅な後退が起こる広く使われているマウスのブレオマイシンモデルとは大きく異なり、フェレットモデルがヒト肺線維症の慢性かつ進行性をよりよく再現している可能性を示唆しています。さらに、フェレットは最近、呼吸器系に最もよく影響を及ぼす全身性疾患である嚢胞性線維症の研究にも利用されています。これは人間に似ているためです¹⁴。したがって、これらの動物は従来の齧歯類モデルよりもPFのより良いモデルとして機能する可能性があります。

本研究は、人間の状態により近い肺線維症の動物モデルを開発することを目的としています。私たちは家庭用フェレットに気管内ブレオマイシンを投与しました。8週間後、これらのフェレットは肺線維症の人間に見られるものと同様の放射線学的および組織学的変化を示しました。

プロトコル

すべての動物処置は、ミシガン州立大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)のガイドラインおよび規則に従って実施されました(動物プロトコル承認番号)。PROTO202300066)。動物ケアおよび実験プロトコルはミシガン州立大学によって承認され、研究における動物の倫理的利用に関する機関基準に準拠して実施されました。

1. フェレットにおける気管支下ブレオマイシンの注入

1. 3〜4ヶ月の年齢のオスのフェレットを飼いましょう。この年齢のオスのフェレットの平均体重は約0.9〜1.6kgであるべきです。動物は21°C、湿度40%〜50%で飼育します。
2. 精密蒸気麻酔装置を用いて、3%〜5%のイソフルランガスをフェレットに投与します。
3. 鼻に鼻をかぶせて麻酔を維持し、3%〜5%濃度のイソフルランガスを投与し続けます。
4. フェレットが十分に鎮静され横たわったら、外径2.7mmの気管支鏡を使って気管支鏡検査を開始します。
5. ブレオマイシン(体重2 U/kg)と生理食塩水の混合液を作業チャネルを通じて遠位気管に注入し、ブレオマイシンの拡散を可能にします。注入される総量が1 mLを超えないようにしてください。フェレットはそれぞれの住まいに戻し、8週間観察してください。
   注意:インスティレーションは2分以内に完了してください。
6. 精密な蒸気化ガス麻酔装置を使ってイソフルランを投与します。フェレットの鼻を鼻にコーンで覆い、1%〜5%のイソフルランを投与して、フェレットが横たわるまで投与します。臨床的な死が確認されるまでガス曝露を続けてください。90 mg/kgの静脈内安楽死溶液を投与し、死亡が確認されるまでバイタルサインを監視します。
7. 治療後8週間に肺を採取し、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)および組織学的評価を行います。

2. フェレット肺の高解像度マイクロCT画像

1. 下大静脈切開から余分な組織と血液を除去し、血液排出を可能にして切除した肺組織を画像診断のために準備します。肺の準備が終わった直後にCT検査を行います。
2. 以下の画像取得設定で、マイクロCTシステムを用いてトモグラフィーマイクロCT画像を取得します:90 keV、88 μA、出力設定、60 μm銅フィルターと500 μmアルミニウムX線コリメーターフィルター、72 mm視野角(FOV)、144 μm等方性画像解像度を用いる。
3. 自動ステッチプロトコルを用いて、重複・ステッチ・リジェクトを用いて、18秒の標準ガントリー時間で合計5枚の画像を取得し、重複したスライスを除去して気道管解析用の最終縫い付け画像を作成します。これにより、68mm円筒径のFOV×186mmの総縫合画像深度(Z平面)で144μmのボクセル分解能が得られ、 体外 フェレット肺ブロック全体を完全に捉えることができます。
   1. この画像診断プロトコルを、0 cmH₂Oおよび25 cmH₂Oの各体外フェレット肺に対して繰り返します。
   2. 肺に直接接続された圧力モニタリングシステムを用いて、画像撮影中に気道圧力を正確に制御・維持します。
   3. 圧力計を調整された気流源に接続し、肺内圧を継続的に調整できるようにします。
   4. 画像撮影前に、システムを所定の圧力レベル(0 cmH₂Oまたは25 cmH₂O)に設定し、一定の気流で肺を膨らませます。
   5. 画像撮影中は、圧力計を使って気道圧力のリアルタイムフィードバックを提供し、気流源を使ってわずかな圧力変動を補正します。

3. 画像処理とセグメンテーション

1. 再構築されたマイクロCT画像ボリュームをDICOM形式で読み込み、神経画像情報技術イニシアチブ(NIfTI)形式に変換して気道分割パイプラインに格納します。
2. マイクロCT画像で関心領域(ROI)を定義するには、上端の軸方向スライスを手動でトリミングしてチューブやその他の気管挿入物を除外します( 図1A参照)。
3. 自動凍結・成長アルゴリズム^15,16を用いて気道分割を行い、以下の主要なステップで説明します。
   1. ROIの最上部軸方向画像スライスに気管内にシードを置きます。入力画像サイズの空の画像配列を作成し、初期の自信気道体積(CAV)をすべてのボクセルが「0」に割り当てます。そして、シードボクセルをCAVに追加し、その値を「1」に設定します。
   2. 気道ルーメンの分割のために、初期の保守的なマイクロCT強度閾値 t = -1000 HU を設定します。
   3. 入力画像サイズの空の画像配列を作成し、禁止体積(FV)を表すために、すべてのボクセルを「0」に初期化します。
   4. 気道ルーメン分割の収束が2つのフラグのいずれかで定義されるまで繰り返します:1) 閾値範囲全体(-1000から-600 HU)をチェックするか、2) CAV画像内で「1」ボクセルに隣接するすべての「0」ボクセルをFV画像で「1」とマークします。
      1. CAV中心線^ツリー17 を計算し、ターミナルブランチエンドポイント¹⁸を識別します。
      2. 現在のtの値でマイクロCT画像にバイナリ閾値を適用し、CAVを閾値領域(ボクセル値≤t)上のシードとして新たに接続したルーメン¹⁸を計算します。
      3. 各CAVエンドポイントに対して、新しいルーメンボリューム内の関連するボクセルを計算します。ただし、そのエンドポイントに他のCAVエンドポイントより近いCAVは除外します。
      4. 新しい腔体積内の潜在的な漏れ箇所として、多数の関連するボクセル(>150ボクセル、0.5 mm³相当)を持つCAVエンドポイントを検出します。
      5. Nadeemら¹⁵で定義された自動基準を用いて、潜在的な腔漏りを確認しましょう。
      6. 漏れ根の遠位にあるサブツリー体積を削除してルーメン体積の漏れを除去し、漏れ根の周囲にボクセルを追加してFVを拡張するアルゴリズムを用い、前^述の15のアルゴリズムを用います。
      7. 漏れ除去したルーメンボリュームを割り当て、前述のアルゴリズム¹⁵を使ってCAVを更新します。
      8. 閾値tに「1」を加えます。
      9. ステップ3.3.4に進みます。
4. 以下の主なステップで説明された、以前に検証された自動アルゴリズム¹⁷ を用いて、1ボクセル厚の気道中心線木の計算を行います。
   1. セグメント化された気道木をバイナリNIfTI画像として入力します。
   2. 以下の主要なステップで説明する、内側優先の最小コスト経路アプローチ¹⁷ を用いて初期気道中心線ツリーを計算します。
      1. 入力画像サイズの空の骨格画像配列を作成し、すべてのボクセルを「0」に割り当てます。step 3.3.1の自動シードを初期のスケルトンボクセルとして追加し、値が「1」となります。
      2. 入力画像サイズの空の画像配列を作成し、すべてのボクセルを「0」に割り当てて気道体積画像を表現します。
      3. 現在の骨格に最も遠い無標識気道体積のボクセルを特定し、前述のアルゴリズム¹⁷を用いて、この点から現在の骨格へつながる内側優先の最小コスト経路を計算します。
      4. 得られた経路を骨格画像配列に新しい骨格分岐として追加し^、前述の通り分岐に沿って局所スケール適応拡張を適用して気道標識体積を更新します。
      5. 3.4.2.3–3.4.2.4を繰り返し、マークされた気道容量が満たされるまで続けます。
   3. 前述の通り、真の気道中心線を維持しつつ、偽のトポロジカル枝を剪定します。これは前述の¹⁷点です。
   4. 気道中心線上で分岐終点でない単純な点¹⁹ (すなわち、複数の中心線ボクセルに隣接する点)を排除し、トポロジカルな一貫性を確保し、単一のボクセル厚の中心線を維持します。
5. フェレット肺の微小画像で0 cmH₂Oで肺実質の断片を行います。
   1. ITK-SNAP²⁰に組み込まれた計算アルゴリズムとグラフィカルインターフェースを用いて、5枚目の冠状画像スライスごとに肺実質を手動で描画します。
      注:25 cmH₂O膨張状態における肺実質と周囲背景とのマイクロCT強度コントラストは不十分であり、肺容積の信頼できる断片を妨げました。
   2. 画像補間を適用して、中間画像スライスで肺実質の断片を生成します。
   3. 軸方向および矢状面の両方に沿った実質断片の構造的連続性を確保するために二次品質管理レビューを実施します。
   4. 局所スケールベースの腔体積拡張を用いて、肺実質から気道腔および壁領域を除外し、次に肺実質から拡張容積を差し引います。
6. 航空路の機械的測定を定量化²¹.
   1. 呼吸関連の気道内腔断面積(CSA)の変化を測定することで、吸気(25 cmH₂O膨張)と呼気(0 cmH₂O膨張)肺容積の変化を測定することで、個々の気道の放射状拡大を定量化します。気道枝 bでの放射状膨張(Δ_air-R(b)で表す)を次のように計算します。
      (1)
      ここで、CSA_ins(b)およびCSA_exp(b)は、吸気および呼気時の気道腔CSAを表します。bでのCSAは、放射線トレーシングと支線^b22の中央半分にわたる局所適応半最大法を用いて計算されます。
   2. 呼吸関連の各気道の縦方向伸縮を以下のように定量化します。
      (2)
      ここでL_ins(b)とL_exp(b)は、それぞれ吸気および呼気性肺容積における気道枝 b の測地線経路長を示します。枝の測地線経路の長さは、カリーナから枝²¹の遠端点までの中心線経路をたどることで計算されます。
7. 肺実質の強度に基づく測定を定量化すること。
   1. 健康で線維化したフェレットにおける肺実質の微小CT強度分布を空間的に可視化し、気道樹の文脈で肺実質体積の「ルックスルー3D体積再現」を生成します。マイクロCTの強度定義された透明度マッピングと色分けを用いて、ルックスルー効果を実現します。健康なフェレットの肺と線維化性の肺の両方に、同じ透明マッピングと色分けのスケールを適用してください。ルックスルー3Dボリュームレンダリングを生成するために、以下のステップが適用されます。
      1. 3D スライ^サー23を使って、気道断片の3次元(3D)NIfTI画像を「断片」として開いてください。
      2. Segmentationsモジュールを使って3D気道表現を生成します。気道体積を入力として選択し、Representationsタブの「Closed surface」オプションの「作成」をクリックします。
      3. 分離された肺実質を含むマイクロCT強度画像を3Dスライ サーにボリュームとしてインポートします。この画像では、肺ボクセルの元のマイクロCT強度値は保持され、非肺ボクセルには-2000 HUの値が割り当てられています。
      4. Volume Renderingモジュールを使って、肺実質の強度に対する色と透明度マッピングを設定できます。マップの強度値は-1500 HU、-600 HU、0 HU、1500 HUから、それぞれ不透明度0、0.15、0.3、1の黒、緑、黄、赤に変換されます。
   2. 本研究で開発されたアルゴリズムを用いて、マイクロCT画像で観察された強度分布を解析し、肺実質内の病変組織の割合を推定します。この手法は、健康な実質領域の強度値がガウス分布に従うと仮定しています。対照的に、線維化領域は特徴的に強度が高く、観察されたヒストグラムの右側のガウス性を歪めます。この作業は以下のステップで達成してください。
      1. ステップ3.7.1.3で、強度範囲-1500 HUから500 HUの50ビンで孤立した肺実質画像のヒストグラムを計算します。
      2. ターゲットガウス分布の平均をヒストグラムのモードとして計算し、ヒストグラム上のモードの左側にある強度値を用いて標準偏差パラメータを導出します。
      3. 線維化組織体積を、観察されたヒストグラム右側で、ステップ3.7.2.2で得られた平均および標準偏差パラメータで定義される予想ガウス分布曲線の上にある余剰面積として定量化します。
      4. 病変組織の割合を線維化組織体積と実質領域の総ヒストグラム数の比率として計算します。

結果

5匹のフェレットのうち、1匹の健康なフェレットと1匹の線維化フェレットから切除された肺を、マイクロCTスキャナーで呼吸時および吸気時の呼吸圧をそれぞれ0 cmH₂Oの制御された気道圧で画像化しました。

図1は、0 cmH₂O圧力での体外外フェレット肺のマイクロCT画像(図1A)の画像処理パイプラインの中間結果を示しています。図1Bは、切除したフェレット肺のマイクロCT画像で0cmH₂Oに膨張させた気道ツリー体積分割の中間結果と対応する閾値パラメータを示しています。図1Bは、後の反復でパラメータ緩和を用いてより小さな気道を捉えるFGアルゴリズムの効果を示しています。図1Cは、偽枝を剪定する前後の気道中心線樹木検出の結果を示しています。

第5世代以降、線維化性肺で検出される気道の数は、健康な肺の同世代で検出された気道の数よりも著しく少ないことが観察されました(図2A)。具体的には、健康な肺では第5世代以降に161本の気道枝が検出されたのに対し、相応する世代を通じて線維化肺では91本の気道が検出されました。一般的に、線維化性肺の気道壁は健康な肺よりも厚くなっています(図2B)。計算解析の結果、健常肺の一致領域と比べて、視界線維化が見られる領域で腔径正規化気道壁厚が有意に増加していることが示されました。

線維化した肺は、ハニカム状、小葉中隔の厚み、グラウンドグラス不透明領域に一致する、小さく厚い嚢胞性気道を示した。グラウンドグラス不透明度とは、肺の組織が厚くなり、気道が部分的に満たされているため、CT画像でその部分が霞んだ灰色に見える領域を指します。線維化性肺は線維化領域に対応する実質のCT強度値が高いことが観察されました。 図3A は、分節された肺実質体積と分節気道樹の「ルックスルー3D体積再現」を示しています。線維化フェレット肺の実質上でのマイクロCT強度値は(-502 ± 238 HU)は、健康なフェレット肺(-588 ± 167 HU)よりも有意に高く(p < 0.001)。局所強度上昇解析(図3B)では、線維化性肺の実質容積が27.8%で、CT強度が上昇していることが示されました(ヒストグラムの紫色部分で示されています)。これに対し、CT強度が高い健康肺は実質体積のわずか1.24%しかありません。

正常肺と病変肺の気道力学の視覚的比較は、健康で線維化したフェレット肺における気道の呼吸力学バイオマーカーの気道枝にまたがる分布を示しています(図4)。健康なフェレット肺では気道の橈骨拡大が66.8%±9.8%で観察され、線維化フェレット肺(32.4%±7.6%)よりも有意に高く(p < 0.001)。また、気道縦方向の伸縮に有意な差(p < 0.001)が観察されました。健康なフェレット肺は35.7%±5.3%±線維性肺は16.0%4.9%)でした。

代表的なCT画像は、マイクロCTスキャナーを用いて、それぞれの肺の異なる気道圧(0 cmH₂Oおよび25 cmH₂O)で取得しました。図5は正常肺(図5B,C)とBLEO処理されたフェレット肺(図5E、F)の違いを示しています。正常な肺では、CTスキャンで典型的な肺構造が示され、減衰が低く線維化の兆候はありません(図5B,C)。対照的に、BLEO処理されたフェレットの肺は、組織線維化を示す肺の減衰の増加を含む有意な病理学的変化を示します(図5E,F)。さらに、顕著なハニカム状の形成が観察され、嚢胞間と厚くなった小葉間隔が特徴です(図5E,F)。炎症や初期線維化変化の領域を表すグラウンドグラス不透明度(GGO)もBLEO治療肺に確認されます(図5E,F)。

組織学的解析(図6)により、ブレオマイシン治療を受けたフェレット肺において著しい組織の再構築と線維化が確認されました。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色により、正常肺では肺胞構造が保存されていることが明らかになりました(図6A、C)が、線維化した肺は広範な構造歪み、細胞性の増加、気道壁の肥厚、顕著な線維化病変を示しました(図6B,D)。マッソンのトリクロム染色は、正常肺の気道および実質におけるコラーゲン沈着が最小限であることを示しました(図6E,G)一方、線維化肺では気道(図6F)および実質領域(図6H)の両方にコラーゲンが著しく蓄積しました。定量画像解析(図6I,J)により、線維化性肺のコラーゲン陽性面積が正常対照群と比較して気道および実質区画の両方で有意に増加していることが確認され(P < 0.0001)、広範な細胞外マトリックス沈着と進行的な組織再構築が示唆されました。

図1:CT画像処理とセグメンテーション。 (A) マイクロCT画像における関心領域(ROI)の選択。切除したフェレット肺を膨らませるために使われたチューブやその他の気管挿入物を除外するために、クロッピングラインは手動で選択されました。(B) 凍結・成長(FG)アルゴリズムを用いて0cmH₂Oで膨張したフェレット肺のマイクロCT画像における気道樹断片の中間結果。(C) 0 cmH₂OのマイクロCT画像から気道断片体積に施された偽骨格枝の剪定前後の中心線検出結果。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:気道樹生成の計算解析。 (A) 健康肺と線維化肺で検出される気道の数。(B) 健康肺と線維化性肺における気道壁厚の違い。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:色分けされたマイクロCT強度の可視化。 (A) 健康で線維化性フェレット肺の0 cmH2O膨張時の実質全体にわたる色分けされたマイクロCT強度分布の3D可視化。(B)健康で線維化したフェレット肺のマイクロCT強度ヒストグラム。ヒストグラム領域は紫色で示されており、ガウスモデリングに基づきCT強度が高い領域を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:健康で線維化性フェレット肺の気道呼吸力学的バイオマーカー。各バイオマーカー(Aは気道の放射状拡大を示し、Bは気道の縦方向の伸縮を示す)に対して、各指標の平均(μ_x)と標準偏差(σ_x)を健康なフェレット肺のすべての枝で計算した、μ_{x σ±} 3 x の範囲にわたる正規化された色分けスキームが適用されました。定量的な比較結果については本文を参照してください。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:マイクロCT画像は、ブレオマイシン誘発性線維化フェレット肺における広範な構造的再構築と肺容積の減少を示しています。(A–F) 25 cm H₂Oの膨張圧下で取得した代表的なマイクロCT画像は、健康な対照フェレット(A–C)とブレオマイシン処理された線維化フェレット(D–F)を比較します。三次元(3D)体積レンダリング再構築(A,D)では、健康な肺(A)では肺構造が保存され、均一な拡張が見られますが、線維化した肺(D)では肺の拡張が減少し、顕著な実質の歪みが見られます。横断(B,E)および冠冠断面(C,F)は、グループ間の違いをさらに強調しています。健康な肺は均一に気圧化された実質を持ち、正常な気道分岐と最小限の組織密度(B,C)を示します。対照的に、線維化性肺は広範囲にわたる両側胸膜下および基底優勢の不透明化、実質密度の増加、構造的歪み、嚢胞性空域拡大を示し、ハニカム状の再形成(赤い矢印)(E,F)と一致します。黄色い破線で肺の境界線が示されています。これらの画像診断所見は、フェレットへのブレオマイシン曝露後に重度の線維化性再構築と機能的空気肺容積の著しい減少を示している。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:BLEO誘発性フェレット肺線維症の検証。 (A–H)代表的な明視野ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色切片は、正常肺(A,C)と線維化性肺(B,D)の間に違いを示しています。低倍率のHE画像では、正常肺(A)に肺胞構造が保存され、線維化肺(B)では広範な組織再構築と線維化病変が見られます。高倍率のHE画像は、正常肺(C)の正常な肺泡構造や、線維化性肺(D)における細胞性の増加、気道壁の肥厚、構造的歪みをさらに強調します。マッソン氏トリクロム染色されたフェレット肺断片の代表的な明視野画像では、正常な肺気道(E)および実質(G)ではコラーゲン沈着が最小限であり、線維化性肺気道(F)および実質(H)ではコラーゲン沈着(青色)が増加していることが示されています。(I,J)コラーゲン陽性面積の定量化により、線維化性肺におけるコラーゲン沈着が正常肺と比較して気道領域(I)および肺実質(J)の両方で有意に増加していることが示されました。P < 0.0001。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

本研究は、フェレットにおける気管内ブレオマイシン投与と高解像度の体外マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)を組み合わせ、肺線維症の構造的および機械的特徴を特徴づけるプロトコルを説明しています。マイクロCTは0.2mm程度の小さな気道を検出し、体積、気道の厚さ、密度、形態を測定できます。組織密度の増加、体積減少、地域的な異質性は組織病理学と密接に一致しています。主な目的は、この大型動物モデルと高度な画像解析を組み合わせて、ヒト肺線維症に似た放射線学的特徴、気道学的特徴、組織病理学的特徴を捉えられることを実証し、実現可能性を確立することでした。プロトコルのいくつかのステップは再現性と解釈可能性のために重要です。まず、気管支鏡下誘導による気管内ブレオマイシン注入により、びまん性肺曝露を可能にしつつ、近位気道のたまりを最小限に抑えることが小動物モデル^4,7,11の既知の制限となっています。このアプローチは、特により複雑な気道分岐を持つ大きな肺で重要な地域損傷分布の変動を減らすと考えられます。次に、点滴後8週間の時期を選ぶことで、急性炎症よりも線維症の確立が有利になります。マウスモデルでは、ブレオマイシン誘発性線維症は時間とともに部分的に解決することが多いため、翻訳関連性は制限されます ^4,8,11。対照的に、本研究のフェレット肺は持続的な放射線および組織学的な線維化的特徴を示しました。

体外画像診断中の制御された肺膨張も重要な要素です。標準化された気道圧力(0 cmH₂Oおよび25 cmH₂O)での画像診断により、気道の橈骨膨張と縦方向の伸ばしを定量化でき、変動する肺容積やコンプライアンスによる交絡影響を軽減しました。これらの気道機械的バイオマーカーは、自動生成された世代マッチングアルゴリズムを用いて導き、従来の組織学だけでは評価が難しい気道機能障害の客観的な指標を提供します(^15,21)。

いくつかのプロトコル修正により、さらに堅牢性が強化される可能性があります。ブレオマイシンの投与量は、慢性上皮損傷をよりよくモデル化するために、調整または繰り返し低用量で投与することができ、これは肺線維症病因の現行パラダイムの中心である^1,3。節節的挿入戦略により、線維化領域と比較的保存された領域の動物内比較が可能です。画像診断の観点からは、体外スキャン中の組織変形を最小限に抑えるために、気道圧、固定条件、温度の慎重な標準化が不可欠です。重度の線維化は、気道の閉塞や高い組織密度により自動気道分節を複雑にすることがあります。したがって、適応型しきい値付けと手動品質管理は、自動化パイプラインの不可欠な補助的な手段であり^{続けます。}

この方法にはいくつかの制限があります。特に、マイクロCTで撮影された動物の数が少ないため、統計的推論が制限されており、この結果は記述的なものとして解釈されるべきです。本研究は、定量的マイクロCTを用いてブレオマイシン誘発フェレットモデルの肺線維症の特徴付けの実現可能性を明らかにするためのパイロット研究として設計されました。これらの発見を検証し、統計的検密力を高めるためには、より大規模なコホートを用いた今後の研究が必要です。しかし、画像のバイオマーカーや測定値に顕著な違いが見られます。

さらに、広く使われているものの、ブレオマイシン誘発性線維症は毒素駆動の損傷モデルであり、特発性肺線維症の多因子病因(加齢、遺伝的感受性、環境曝露など)を完全には再現していません(^3,6,11)。画像検査は体外で行われ、ガス交換、血管寄与、縦断疾患進行の直接評価は認められなかった。それにもかかわらず、エクスビブマイクロCTは優れた空間分解能を提供し、フェレットの臨床マルチディテクターCTでは現在達成できない小さな気道の詳細な三次元解析を可能にします。

これらの制約にもかかわらず、このプロトコルは既存のモデルに比べていくつかの利点を持っています。フェレットは呼吸細管支や気道分岐パターンを持ち、齧歯類よりも人間に近いものであり、線維症の気道中心の側面の研究に特に適しています ^6,12。人間に関連する気道解剖学とマイクロCTに基づく定量画像診断の組み合わせにより、実質密度、気道壁厚、気道損失、気道力学の障害を同時に評価することが可能になります。これらの特徴は、ヒト線維化性肺疾患で観察されるハニカム状、中隔肥厚、地域的異質性など、放射線学的パターンを反映しています^1,2。

高解像度コンピュータ断層撮影(HRCT)は、臨床現場における特発性肺線維症(IPF)の診断および縦断モニタリングのための基盤的な画像診断手法です。HRCTはマイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)に類似した原理に基づいており^{、患者の放射線}被曝を最小限に抑えつ実質肺の異常を検出するよう最適化されています。重要なのは、HRCTの進歩により診断精度が向上し、特徴的な画像特徴がある場合、IPF診断に外科的肺生検が不要になる^{ことが多いという点}です。IPFの特徴的な放射線学的所見、例えば構造的歪み、牽引性気管支拡張症、ハニカム状、嚢胞性気道などは、HRCTによって患者の中に識別できます。これらの臨床観察と一致して、我々のフェレットモデルはマイクロCTで検出可能な気道歪みと嚢胞性空域形成を示し、人間の疾患と非常に類似した画像表現型を提供します。

HRCTに加え、気管支内光コヒーレンス断層撮影(EB-OCT)はIPF評価のための有用な画像診断手法として登場^{しています。}EB-OCTは、標準的な気管支鏡²⁶を通じて、光波を利用して生体内で末梢肺の高解像度三次元画像を生成する低侵襲技術です。HRCTと同様に、EB-OCTは外科的生検を必要とせずに線維化性再構築を特定する可能性を示しています。当社のフェレットモデルがCT画像で検出可能な構造異常を発見できることから、EB-OCTなどの新興臨床画像診断手法を用いた将来の評価にも適している可能性があります。

重要なのは、齧歯類モデルにおける線維症を減緩する多くの治療法が、人間において同様の有効性を示さなかったことです¹¹。ここで述べるアプローチは、構造と機能の両方を反映した感度が高く空間的に分解された画像バイオマーカーを提供することで、この翻訳ギャップを埋める助けとなる可能性があります。このようなバイオマーカーは、全コラーゲン負荷を超えた治療反応の評価に用いられ、気道力学や実質のリモデリングにおける局所的な改善を捉えることができます。

結論として、本研究はフェレットの肺線維症のモデル化およびマイクロCTを用いた疾患関連の構造的および機械的変化を定量的に評価するための実現可能なプロトコルを確立します。予備的ながら、このアプローチは大型動物モデルと高度な画像解析を組み合わせることで、翻訳関連性を高め、肺線維症の機序的理解を深め、新規治療戦略の前臨床評価を支援する可能性を強調しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	目薬
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI