肝腫瘍細胞における有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を視覚化する蛍光ベースの方法

サマリー

このプロトコルにより、同期肝腫細胞を用いて有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を再現可能にします。

要約

細胞内脂滴(LDs)は、いくつかの細胞タイプに広く存在します。LDはトリアシルグリセロールやコレステリルエステルなどの中性脂質を蓄え、エネルギー代謝、シグナル伝達、ストレス応答において重要な役割を果たします。LDは細胞内小器官として認識されていますが、細胞周期進行中の挙動は依然として不明です。有糸分裂の過程で、ミトコンドリアやゴルジ体を含む複数の小器官が大規模な再編成と再構成を受け、LDも細胞周期依存的な変化を経験する可能性があるという疑問が浮かび上がる。LDはエネルギー源やシグナル伝達の拠点として機能するため、有糸分裂中のその動態を明確にすることが特に重要です。これに対処するため、肝炎細胞における細胞周期同期と蛍光LD染色を組み合わせたプロトコルを提案します。細胞はサイクリン依存性キナーゼ1阻害剤ベースのアプローチを用いてG2/M境界で同期され、細胞周期内に放出され、特定の時間点で収集されます。LDsは中性脂質染料で標識され、蛍光顕微鏡で観察されます。この方法は有糸分裂中のLD再分布を調べる再現性のあるアプローチを提供し、オルガネル生物学、代謝調節、がん細胞生理学の研究に広く応用可能です。

概要

細胞周期は、染色^体DNAの正確な重複と分離を保証する高度に組織された出来事であり、その間に細胞内小器官が動的に再編成されます^。3。このプログラムは、G1、S、G2、M^1、2の4つの主要なフェーズで構成されています。有糸分裂中、重複染色体は双極紡錘体の赤道面に整列し、その後2つの^娘細胞に移されます。ミトコンドリアやゴルジ体などの小器官は、有糸分裂^{5、6、7、8}の際に大規模な再構築を受けます。これらの小器官は小さな小胞に分裂し、その後2つの娘細胞に分散され、その後の^{細胞周期を}経て再構成されます。

脂質滴(LDs)は、中性脂質の核とリン脂質単一層からなる中性脂質を含む小器官です。これらは多様なタンパク質群と関連しており、増^{殖細胞を含む}多くの種類の細胞に広く存在^します。LDsのタンパク質および脂質組成は細胞および^{組織タイプによって異なります}。これらのタンパク質の中で、ペリリピン(PLIN)ファミリーは広く研究されており、PLIN2は肝細胞のLDを安定化させます^12,13。構造安定化に加え、PLINファミリーのタンパク質はLDダイナミクスの調節や他の細胞成分との相互作用にも関与していることが示唆されています¹⁴。LDはトリアシルグリセロールやコレステリルエステルの貯蔵拠点であるだけでなく、エネルギー代謝¹⁵、シグナル伝達経路¹⁶、ストレス適応¹⁷のハブとしても機能します。代謝機能障害関連脂肪肝炎(MASH、以前はNASHと呼ばれていた)などの病理的状態では、LDの蓄積が健康^な対照群と比べて著しく増加^し、疾患生物学におけるその重要性が強調されています。しかし、有糸分裂中のミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体器官の動態に関する広範な研究にもかかわらず、分裂細胞におけるLDの空間的局在性の観察は限定的でした。ここで示した方法を用いて有糸分裂中のLD局在を解析しました。以前に、LDは他の細胞内小器官とは異なる空間分布パターンを示すことを報告しています²⁰。

ここでは、肝腫細胞における有糸分裂中のLDおよびその他の細胞内小器官の分布を調査するための詳細なプロトコルを提供します。この手法には細胞周期同期と蛍光染色が含まれ、有糸分裂中のLD動態の再現可能な可視化を可能にします。代表的な結果は、LDが間期と有糸分裂の間で細胞周期依存的な空間分布の変化を示すことを示し、細胞分裂時のLD局在の比較解析を容易にしています。このアプローチは、生理学的および病理学的文脈における小器官の局在、動態、代謝調節の研究に広く応用できます。

プロトコル

1. このプロトコルに必要な標準解

1. 24%(w/v)脂肪酸を含まない牛血清アルブミン(BSA)溶液を150 mM NaClに溶かして調製します。
2. 無菌条件下でDMSOに溶解した10 mM RO-3306(選択的サイクリン依存性キナーゼ1(CDK1)阻害剤)ストック溶液を準備します。
   注:NaOH、NaCl、リン酸塩緩衝生塩水(PBS)など、他の一般的な溶液は標準的な実験室の手順に従って調製されました。PBSは、蒸留水中でNaH₂PO₄·2H₂O2.6g、Na₂HPO₄·12H₂O29g、NaCl 80g、KCl2.0gを蒸留水に溶解し、最終体積を1Lに調整することで製製されました。

2. BSAと共役したオレイン酸の製剤

1. 50mLのビーカーにオレイン酸90mgを入れ、エタノール2mL(99.5%)を加えて溶かします。
2. 溶液に5N NaOHを100 μL加え、完全に混ぜるまでかき混ぜます。
3. 窒素ガスの流れの下でエタノールを蒸発させます。
4. 150 mM NaClを10 mL加え、60°Cで5分間培養します。
5. 24%(w/v)BSAストック溶液12.5 mLをオレイン酸溶液(2.4)にゆっくりと滴ごとに加え、10分間連続して優しくかき混ぜて室温で徐々に均一に混ぜます。
6. pHを7.4に調整し、最終体積を150 mM NaClで25 mLにします。最終的なオレイン酸濃度は12.8 mMとなります。
7. 0.22μmのフィルターで無菌条件下で溶液をろ過し、4°Cで最大2週間、長期間保存する場合は-20°Cで保存します。

3. セルのG2/M境界同期

1. 必要な操作装置を準備しろ。
   1. RO-3306処理なしの未処理非同期細胞を基準制御として準備します。
   2. オレイン酸処理の条件では、同期を基線として基線として同期せずにオレイン酸のみで処理した細胞を準備します。
   3. 蛍光染色の場合は、各蛍光色素に対して単一染色制御を行い、信号特異性を検証しチャネル間のスペクトル重なりを排除します(補足図1)。
   4. スペクトルの重なりやチャネルクロストークを最小限に抑えるために、逐次取得設定や適切なフィルタ構成で画像を取得します。
      注:これらの対照は、細胞周期依存の変化と基線細胞小器官分布を区別し、蛍光特異性を検証するために不可欠です。
2. Dulbecco改良イーグル培地にHuH7細胞を、10%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを37°Cで5% CO₂インキュベーターで維持します。
3. ガラスのカバースリップを35mmの培養皿に入れます。上記の培地に35mm皿あたり10個×⁵ 細胞を種付けし、5%CO₂インキュベーターで37°Cで一晩培養します。
4. 細胞をPBSで2回洗浄し、その後、9μM RO-3306および0.5mOleic acidを含む新鮮培地で培養します。
5. 標準的な培養条件下で細胞を20時間培養します。

4. 同期細胞からRO-3306試薬を除去し、有糸分裂期に入る

1. PBSで3〜5回の洗浄セル(ステップ3.4)。
2. 細胞を新鮮な培地で一度洗い流します。
3. 細胞を新鮮培地、37°Cの5%CO₂インキュベーターで1時間培養し、有糸分裂への侵入を可能にします。
   注:RO-3306の除去により、同期細胞はG2/M境界から有密分離期に入ることができます。試薬を洗い流した後、かなりの割合の細胞が約1時間以内に有糸分裂期に入り、その間に細胞の円形化や染色体縮合によって有糸分裂細胞を識別できます。有糸分裂の特定の段階を観察する最適なタイミングは、細胞の種類や培養条件によって異なります。

5. 有糸分裂細胞のサンプル調製

1. 4%パラホルムアルデヒドを室温で10分間PBSに固定します。
   注意:有糸分裂細胞は皿から離れやすいです。固定前の洗髪は避けましょう。
   注:PLIN3染色では、細胞を2%のパラホルムアルデヒドと2%グルターアルデヒドの組み合わせで固定しました。
2. 0.1%(w/v)トリトンX-100を室温で10分間PBSで固定細胞を透過させます。
3. 室温で1%(w/v)BSAをPBSに1時間ブロックします。

6. LDやその他の細胞小器官の染色

1. 細かい鉗子を使って培養皿からガラスカバースリップを慎重に取り出し、乾燥を防ぐために細胞面を上にして加湿チャンバーに入れます。
   注意:蛍光信号を保存するため、以降のすべての染色工程は加湿かつ光が遮られた環境で行ってください。
2. 細胞をPBSで2回洗浄し、PBSで希釈した一次抗体で室温で1時間インキュベートします。
3. 細胞をPBSで2回洗浄し、PBSで希釈した二次抗体を室温で1時間インキュベートします。
4. 細胞をPBSで2回洗い、中性脂質蛍光染料で室温で10分間染色します。
   注:多様なスペクトル特性を持つ染料は、柔軟な多色イメージングを可能にし、他のオルガネルマーカーとのスペクトル重なりを最小限に抑えるために選ばれました。
5. PBSで2回洗浄セルを使い、核をDNA結合蛍光染料(DAPI:励起、350–410 nm、放出、420–450 nm)で染色し、PBSで1:1,000を5分間希釈しました。
6. PBSでセルを2回洗浄し、その後、表紙をアンチフェードマウントメディウムでガラススライドに取り付けて、イメージング中の蛍光を保ちます。
7. カバースリップの縁は透明なネイルポリッシュで密封し、撮影中の乾燥や動きを防ぎます。
   注意:蛍光信号は徐々に薄れていくため、染色後1週間以内に画像を取得してください。

7. 細胞内小器官とその細胞内局在の観察

1. 広視野蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を取得し、複数の細胞を迅速にスクリーニングし、代表的な間期および有糸分裂細胞を選択できます。低い励起強度と迅速な取得設定で光漂白を最小限に抑えます。
2. 蛍光染色解析のために、適切な倍率で選定細胞の画像を取得します。
   注:間期細胞は通常、細胞質の中央に位置する完全な単一核を示します。対照的に、有糸分裂細胞は両極紡錘体の赤道面に整列した凝縮染色体を示します。これらの形態的特徴は、間期細胞と有糸分裂細胞を区別するための視覚的基準として機能します。
3. 広視野蛍光顕微鏡で、中性脂質蛍光染料とDNA結合蛍光染料用の適切なフィルターセットを用いて、LDおよび核の形態を可視化します。
   注意:使用する顕微鏡システムの仕様に従ってフィルターセットを選択してください。
4. 高解像度の検証のために、高口径対物レンズ(例:60× NA ≥1.2)を備えた共焦点顕微鏡で蛍光画像を取得します。適切な励起レーザーと発光フィルター設定を用いて、中性脂質蛍光染料およびDNA結合蛍光染料の蛍光シグナルを検出します。一般的に入手可能な画像取得および解析ソフトウェアを用いて画像を処理します。
   注意:顕微鏡システムによっては、水浸式または油浸式対物レンズのいずれかが使用されることがあります。浸漬媒体の選択は、メーカーの推奨事項と実験目的に従うべきです。広視野蛍光顕微鏡は間期細胞と有糸分裂細胞間のLD分布の日常的な観察や比較に適していますが、より高い空間分解能が必要な場合には共焦点顕微鏡が推奨されます。

8. LDの数とサイズの量化

1. すべての条件下で同一イメージング設定下の細胞の蛍光画像を取得します。
2. 画像解析ソフトで取得した画像を開きます。
3. 適切な閾値を設定してLDを特定し、脂質滴の数と面積を定量化するために粒子解析を行います。
   注意:画像パラメータは、LD数と面積の正確な比較を確実にするために、すべての条件下で一定に保つべきです。

結果

RO-3306を用いたG2/M境界における肝細胞の同期

有糸分裂中の細胞小器官の動態を調べるために、選択的CDK1阻害剤RO-3306を用いてG2/M境界^20,21で細胞を同期させました。CDK1阻害剤で20時間処理した後、さらに新鮮培地で1時間処理した細胞では、50%以上の細胞がG2/M境界で同期しました(図1)。RO-3306を除去することで、細胞は細胞周期に入ることが許されます。試薬を洗い流す前、HuH7細胞は上皮細胞のような形態を示しました(図2)。RO-3306を洗い流してから1時間後、有糸分裂細胞は円形の形態を示し、部分的に皿から切り離されていたため、後の解析で同定が容易になりました(図2)。

ディスカッション

有糸分裂中のLDの再分布は、その位置がランダムではなく、細胞骨格の再編成や細胞周期の進行と協調していることを示唆しています。特に、LDがスピンドル領域から除外されることは、有糸分裂紡錘体アセンブリによる空間的制約や細胞分裂時に細胞小器官の分離を維持する能動的な輸送機構による制約を反映している可能性があります。本研究では、細胞分裂中のLDを可視化しながら、有糸分裂細胞を免疫蛍光染色のために準備する簡潔かつ再現性の高いアプローチを提案します。LDの可視化には、スペクトル的に異なる中性脂質染料(緑蛍光と赤蛍光)を2種類使用しました。既存の用途に加え、これらのプローブの選択はスペクトル特性に基づいており、他の蛍光マーカーとの柔軟な組み合わせが可能でした。具体的には、これらの染料は緑または赤チャネルのいずれかのLDの標識を可能にし、多色イメージング実験における他のオルガネルマーカーとのスペクトル重なりを最小限に抑えます。

このアプローチには注目すべき2つの重要な特徴があります。まず、G2/M境界での同期とその後の細胞周期の放...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% Trypsin/EDTA	Wako	201-16945	細胞解離
10 cm ディッシュ	Corning	430167	細胞培養
35 mm 組織培養ディッシュ	IWAKI	3000-035	細胞培養
6 cm 組織培養ディッシュ	IWAKI	3010-060	細胞培養
Anti-PLIN2 (ADRP) 抗体	Proteintech	15294-1-AP	脂滴マーカー
Anti-PLIN3 (TIP47) 抗体	Proteintech	10694-1-AP	脂滴マーカー
Anti-α-チューブリン抗体	Sigma-Aldrich	T6199	有糸分裂紡錘マーカー
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	中性脂質染色
ボトルトップフィルター（0.22 μm）	NEST	WNB343001	OA–BSA溶液の滅菌濾過
ウシ血清アルブミン（BSA）	Sigma-Aldrich	A8022	ブロッキング試薬
クリアネイルポリッシュ	市販	該当なし	カバースリップのシーリング
コンフォカル顕微鏡	オリンパス	FV1200	高解像度イメージング
DAPI	ドジンド	340-07971	核染色
D-PBS（–）	Wako	049-29793	細胞培養
Dulbeccoの改良Eagle培地（DMEM）	Wako	041-30081	細胞培養培地
エタノール（99.5%）	Wako	057-00456	オレイン酸の溶媒
脂肪酸フリーBSA	Sigma-Aldrich	A7030	オレイン酸のキャリアタンパク質
胎児ウシ血清	Gibco	10270-106	培地サプリメント
蛍光二次抗体（Alexa Fluor結合）	市販	該当なし	種特異的な蛍光免疫染色用二次抗体
FV10-ASWソフトウェア	オリンパス	該当なし	画像取得と処理
ガラスカバースリップ（φ15 mm）	松波	2-176-03	顕微鏡用細胞播種
ガラス顕微鏡スライド	松波	SFF-001	カバースリップを載せるためのガラススライド
グルタルアルデヒド（25%溶液）	Wako	073-00536	PLIN3の代替固定
HuH7細胞	JCRB細胞バンク	JCRB0403	ヒト肝腫瘍細胞株
LipidTOX Red中性脂質染色	Invitrogen	H34476	代替脂滴染色
窒素ガス（N2）	市販	該当なし	エタノールの蒸発
オレイン酸	Sigma-Aldrich	O1383	オレイン酸-BSA複合体の調製に
パラホルムアルデヒド、PBSに4%	中外テスク	09154-85	固定
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	抗生物質
リン酸緩衝生理食塩水（×10）	該当なし	該当なし	任意のベンダーに置き換え可能
RO-3306	Sigma-Aldrich	SML0569	G2/M同期のためのCDK1阻害剤
SlowFade Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	S36963	実装媒体
塩化ナトリウム（NaCl）	Wako	191-01665	150 mM NaClの調製に
水酸化ナトリウム（NaOH）	Wako	080-01061	オレイン酸の石鹸化に使用
Tali細胞分析スライド	Thermo	T10794	細胞周期分析に使用
Taliイメージベースサイトメーター	Thermo	該当なし	細胞周期分析に使用
トリトンX-100	Sigma-Aldrich	T8787	細胞透過
ワイドフィールド蛍光顕微鏡	KEYENCE	BZ-9000	有糸分裂細胞の迅速なスクリーニング