トウモロコシ減数細胞における三次元免疫局在化

サマリー

このオスのトウモロコシ減数子細胞における免疫局在プロトコルは、減数分裂中に細胞の三次元的な完全性を維持します。これは、DNA染色剤であるDAPIに加えて、保存されたパラホルムアルデヒド固定物質中の最大3つの独立した抗体の細胞内局在を動的に追跡することを可能にします。

要約

減数分裂前期Iでは、染色体の物理的配置は発生段階ごとに大きく異なりますが、幸いにもこれらの段階特異的な構成により、それぞれレプトテン(例:「細い糸」)、接合体(例:「結合糸」)、パキテン(例:「太い糸」)、ディプロテネ(例:「二重糸」)、および二重動(例:「反発運動」)として知られる古典的な減数分裂段階の適切な同定が可能となります。前期Iで起こる組換え、ペアリング、シナプシスなど複数の細胞遺伝学的現象の視覚解析には、非常に信頼性の高い免疫局在技術が必要です。従来の拡散・潰し技術が細胞内および核下情報を抑制するのに対し、ここで述べる3D保存手法により、主要な減数分裂タンパク質を細胞内細胞内位置部位(細胞質、核、亜核:ユークロマチン、ヘテロクロマチン、核髄)に保存できます。したがって、このプロトコルは減数分裂葯を効率的に固定し、葯から減数細胞を解剖・放出し、トウモロコシ雄の減数細胞における3つの主要タンパク質を同時に免疫局在化する方法を説明します。

概要

減数分裂はモデル植物や作物における形跡の伝達を調節する重要なプロセスです。したがって、タンパク質局在を一貫して正確に可視化できるシンプルな顕微鏡法が、これらの形質をより効率的に伝達する方法の理解を助けます。残念ながら、減数細胞内のタンパク質の局在の可視化は、使用される技術によって大きく異なっています ^1,2。したがって、このプロトコルの目的は、減数子細胞の観察中に発生するアーティファクトを除去する、シンプルで再現可能な方法を提供することです。例えば、減数分裂染色体の観察は繊細なプロセスであり、単純な潰しやさらに破壊的な拡^{散技術によって}促進されることが長らく認められ^{てきました。}シロイヌズナでは、研究者がカルノイ固定剤(エタノールと酢酸の3:1混合液)と、Lipsol、Tween-20、TritonX-100などの洗剤、さらにセルラーゼ、ペクチナーゼ、サイトヘリカーゼを含む酵素混合物を用いて細胞を分解し、その小さな染色体上で効果的な免疫局在化を可能にする拡散法を用いています ^1,2.これらの技術は3D染色体構造を2次元に変換し、人工的に分散した染色体全体を1枚の画像で迅速に観察できるようにします。これらの過酷な処分に耐える染色体の特定の特徴が明らかになることがあります。しかし、これらはしばしばvivo⁶における細胞や染色体の典型的な挙動を表現していません。ト^ウモロコシ7,8,9,10,11を含む様々な植物種で、最大2種類の抗体を迅速かつ非常に広範囲に検出することが可能です。

それにもかかわらず、従来の2D技術の利便性にもかかわらず、特定の現象は破壊的手法に敏感であり、細胞、核、染色体が拡散や押しつぶしの際に損傷した場合は観察できないことが現在では認められています。例えば、レプトテン期やセントロメア結合期(レプトネーマ/接合球)中にRAD50タンパク質が細胞質から核へ移動することは、完全な3D減数細胞でのみ検出されています¹²。ここでは、4%のパラホルムアルデヒドに固定された葯を用いて、トウモロコシ雄性減数細胞の3つの主要なタンパク質を免疫局在化し、構造的な完全性を保持する詳細な4日間の3Dプロトコルを読者に提供します。類似のトウモロコシ3D免疫局在化手法8^{と比較して、研究者}向けの実用的なノートやトラブルシューティングのヒントを追加しました。このプロトコルは、シナプトン複合体による減数分裂再組換えの制御など、さまざまな減数分裂過程の研究に関心を持つ植物生物学者や育種家の研究に役立ちます。

プロトコル

注意:適切な個人用防護具と化学フードを使用してホルムアルデヒドとアクリルアミドを扱う。どちらも有毒です(アクリルアミドも重合前は神経毒性があります)。研究で使用されたすべての材料は 材料表に記載されています。

1. トウモロコシ葯の固定により、減数細胞の完全な構造を保つ

1. 茎の中にまだ花序が成長しているV13段階のトウモロコシを使いましょう。減数分裂アックス固定の週には手袋を着用し、腫れ上がった茎を優しく押して、切り開けるほど柔らかいかどうかを確認しましょう。
   注:この固定および免疫局在化プロトコルは、トウモロコシとシ ロイナ の減数分裂花芽(400μm未満)の両方に適用可能です。しかしトウモロコシの場合、使用される品種や季節によって(春は成長が早いため)、近親交配系統B73は植え付けから約8週間かかりますが、早期開花の近親交配系統A344はわずか6週間です。
2. 緩衝材の準備。
   注意:化学固定の前日には、以下の作業用溶液を慎重に準備し、すべてのボトルに正しくラベルを貼ってください。
   1. 100 mLのバッファーA(BA)塩を100 mLに、4.53 g PIPES(ピペラジン-N, N′-bis(2-エスタンスルフォン酸)最終濃度150 mM)、5.96 g KCl(最終濃度800 mM)、1.17 g NaCl(最終濃度200 mM)、0.74 g EDTA(最終濃度20 mM)、0.19 g EGTA(最終濃度5 mM)、および90 mL H₂Oを加えて準備します。 まずKOHでpHを6.8–7に調整し、次に体積を100 mLに調整します。
   2. 最後に、PES孔径0.45μmの使い捨てRapid-Flow無菌フィルターユニットで消毒します(4°Cで保温、凍結はせず、数ヶ月間保存可能です)。
   3. 準備:
      -50 mMパイプ(KOH付きでpHを7に調整)。
      - 0.4 M濃度の精子のストック(以前に50 mMのパイプに溶解し、KOHでpHを7に調整し、50 μLのアリコットを-20°Cで保持)
      - スパーミジン濃度0.4 Mのストック(50 mMのパイプに溶解し、KOHでpHを7に調整、125 μLの冷凍アリコートを-20°Cで保管)。
      - ジチオスレイトール(DTT)1 Mのストック(0.01 M酢酸ナトリウムに溶解し、pH 5.2に、100 μLの冷凍アリコットを-20°Cで保管)
      - ソルビトール2 M、4°Cで維持。
3. 氷上で2xバッファーA(BA)50mLを、10mLの10xバッファーA塩(4°Cで保持)、50μLの精液(50 mM PIPESで0.4 M、KOHでpHを7に調整)、125 μLのスパーミジン(0.4 M、50 mM PIPESで、KOHでpHを7に調整)を用いて準備します。 100μLのDTT(0.01 M酢酸ナトリウムに1 M、pH 5.2)が激しく渦を巻き起こして溶解します。そして加熱しないでください。
   1. 次に、2Mソルビトール16mLを加えます。最終的な量を滅菌水で50mLに調整してください。使い捨てのラピッドフロー無菌フィルターでフィルターを滅菌し、4°Cで保存します。
4. 5〜10枚の加湿ペーパータオルをプラスチック箱に入れて作った湿気のあるチャンバーを用意します。蓋がしっかり密閉されているか確認してください。余分な水分は取り除きましょう。
5. 次に、トレイに以下の物品を入れます:湿気チャンバー、カミソリの刃、細かい鉗子(70%エタノールで事前に滅菌)、小さな滅菌水のボトル、マスキングテープ。トレイとその中身をステップ1.1で確認したトウモロコシの植物に持っていきましょう。
6. カミソリの刃で、花序の高さでこぼこした茎を切り開きます。主な房の枝や花序の側枝は減数分裂花の収穫に利用できます。
   注:これらの房の枝には、減数分裂葯を集めるための目的の花蕾が含まれています。各花は6本の葯を持ち、通常は上部の3本の大きい葯が分析に使用されます。葯のおおよその大きさと色は各減数分裂段階に対応しています。ほぼ透明な葯は長さ約1mmで、半透明の葯は長さ1.5mmで接合期、白っぽい葯は長さ2mmでパキテン期にあり、黄色がかった葯は長さ>2mmに分かれ、二分体、四角子、花粉粒が配偶子形成を終える可能性がある。トウモロコシの遺伝的背景によって、別の長さ-段階相関は異なることがあり、環境要因(例えば高温)が減数分裂の進行を加速させ、この関係を変えることがあることに注意してください。研究者は、各トウモロコシ遺伝子型および成長条件に対するサイズ段階の相関を検証することが推奨されます(アセトカルミン潰し、cf 1.6)。
7. 細かい鉗子を使って花序の側枝を解剖し、慎重に集めて湿った部屋のペーパータオルで包みます。
   注:ある程度の練習を重ねれば、減数分裂房の枝を抜くには茎に3〜4cmの短い直線的な切開だけで十分です。この切開部を標準的なマスキングテープで3〜4回巻いて閉じることができ、後で残った未解開の花序で同じ植物を収穫できます。組織は成長を続け、後に受粉に利用されることがあります。
8. チャンバーは常温のまま保ちます。減数分裂段階で葯を持つ花蕾を含む花序の枝のみを使用してください。枝は湿ったタオルの半分で覆い、水に浸さないようにしてください。
9. タオルが乾いたら再度加湿してください。葯の解剖が終わるまで箱を閉じ、できれば花薬採取開始の30分前まで閉めてください。
10. 比正済みスケールを備えた双眼立体顕微鏡を用いて、花蕾から新鮮な葯を2mLの1倍BAに35mmペトリ皿に入れて採取し、葯の大きさと色の代理指標を用いて減数分裂段階の正確な同定を確保します。
    注:採取した葯の減数細胞期を正確に特定するために、1つの小花につき3つの同期された葯のうち1つを3:1のエタノール-酢酸固定、アセトカルミン染色、従来のスクワッシュ顕微鏡¹³を用いて迅速に解析します。
11. 4%ホルムアルデヒド固定剤を1xBAと0.0025%トゥイーン-20で準備します
    注:3 mLの場合、ホルムアルデヒド750 μL 16%、750 μL H_2O、1.5 mL 2x BA、7.5 μL Tween-20 1%を加えます。
12. 初期のBAバッファーを取り出し、この新鮮な固定液3mLを段階化された葯に加え、新しい35mmペトリ皿内で45分間固定します。その皿はパラフィルムで密封され、ホルムアルデヒドの蒸発防止のために保管されています。その後、回転シェーカー(40〜60rpmに設定)に置かれた大きなペトリ皿に置きます。 または0.2 × g)。室温でやってください。葯は少し渦巻いて固定しやすいです。彼らは通常、水面に浮かんでいます。
13. 1×BAを3mLですすぎ、サンプルを小さなペトリ皿に移し、室温の回転シェーカー(40〜60rpm)に45分間置きます。
14. 清潔な鉗子を使い、葯を新鮮な35mmのペトリ皿に移し、1Xバリアバチを新鮮な3mL入り液に入れます。ペトリ皿をパラフィルムでしっかり密封してください。その後、小さなペトリ皿をペトリ皿の中に保管し、アルミホイルで覆って暗闇に保ち、使用まで4°Cの温度で置きます。必要に応じて数ヶ月間保管しても構いません。

2. トウモロコシ減数子細胞をポリアクリルアミドサンドイッチパッド内に埋め込む

1日目:3Dスライドの準備

1. アクリルアミド溶液2mLを、アクリルアミドの1:1の同等量と2×バリアミドを混ぜて準備します。亜硫酸ナトリウム(NaS)と過硫酸アンモニウム(APS)を加える前に、アクリルアミド溶液を真空下で5〜10分間脱ガスします。
2. アクリルアミドと2×BA 1:1比率の混合物を1.5 mLのチューブにピペッティングしてアリコートします。
   準備するチューブの数は、準備するスライドの数によって異なります。
3. 1mLを1回BAにしてください。
4. 2cm×2cmのパラフィルムをペトリ皿の上に置き、解剖顕微鏡で照射します。葯付きBA溶液50μLをパラフィルムにピペットで注ぎます。ピペットの先端をハサミで切り、投与を楽にします。
   1. 25μLのBA溶液を別の場所のパラフィルムにピペットで注ぎます。
5. 鉗子で葯を保持し、葯の先端をメスで切り取り、減数細胞を優しく絞り出します。ピペットで減数子細胞を25μLのBA滴に優しく移し、優しく混合します。
6. 減数細胞混合物から10μLを別のカバースリップにピペットで抽出します。
7. 迅速にピペットを20%(0.2g/1mL)NaS5μLと20%(0.2g/1mL)APS5μLを1.5mLのチューブにアクリルアミド/バッファーA2倍で充填します。
8. 上記の混合物を5μLピペットでカバースリップに移し、減数子細胞と混合します。その上にポリL-リジンキャップのカバースリップを置き、45度回転させます。ポリL-リジンカバースリップを1枚だけ(市販または、ポリL-リジン溶液に数分間浸して乾燥させ、新しく清潔なペトリ皿の縁で作る方法)を使うと、重合後に完全なパッドが解放されます。カバースリップは素早く溶液から取り上げ、使用前に乾燥させます。超分解能顕微鏡では、標準化された厚さ(≤170 nm)の高性能カバース^{リップを使用しなければなりません}。
9. 室温でサンプルが完全に重合できるように、カバースリップに30〜50分間触れないでください(重合プロセスが速くなるとパッドの乾燥期間が短くなり、品質が最適とは言えません)。
10. 準備したいスライドごとに「2.6–2.9」のステップを繰り返します。
11. カバースリップはカミソリの刃で慎重に分けてください。すべてのカバースリップをパッド側を上にして、ポリアクリルアミドパッド(またはパッドの大部分)の上に、6ウェルプレートに置きます。
12. 各カバースリップを、1xリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)2mLのパッドで10分間洗います。この洗浄を一度繰り返し、室温で合計20分の洗濯時間が得られます。
13. 50 mLは、49.4 mL PBS 1x、100 μL EDTA 0.5 M、500 μL Tritonを混合して調製します。
14. 各カバースリップを、室温で2時間、1mLの1x PBSに1 mM EDTAと1%トリトンを補足してすすぎます。
15. 新しいブロッキングバッファーを1xPBS、1mMEDTA、0.1%Tween-20、3%BSA(1枚1mL)を準備します。ブロッキングバッファー50 mLを用い、PBS 1x 44 mL、EDTA 0.5 M 100 μL、1% Tween-20 溶液 5 mL、BSA 1.5 g を混合します。BSAは複数の一次抗体および二次抗体を使用する際に非特異的シグナルを最小限に抑えるため、ブロッキング剤として好まれます。

3. 免疫局在化

1. 目的の希釈でブロッキングバッファーを用いて一次抗体(または抗体)を準備します。一次抗体を組み合わせて、それぞれ異なるシグナルを発揮できる能力に基づいて組み合わせます。ウサギ、ラット、モルモット、鶏など、特定の蛍光標識された二次抗体で識別できる異なる生物から来るべきです。ロバやヤギの抗体の使用は避けられています。なぜなら、これらは二次抗体として使われることを意図しているからです。二次抗体の一種(例: 図1の実験におけるヤギ)を単一種で使用することを推奨します。
2. この希釈した一次抗体を各カバースリップの中心にパッドとともに50μL加えます。
   井戸の間に水を加えて蒸発を遅らせます。プレートを湿ったチャンバー(蓋付きのプラスチック箱)に入れます。一晩中出て行け。

2日目:洗濯

3. ウォッシュバッファー500mL(PBS1+0.1% Tween-20+1mM EDTA)を準備します。
4. ピペットで吸引してウェルから一晩かけた溶液を除去します。
5. 各カバースリップをパッドで1mLの洗浄バッファーで素早く2回洗い、その後ウェルから取り出します。
6. カバースリップにパッド付きでさらに1mLをピペットで移し、室温で1時間置いてください。
   さらに7回繰り返します。(合計8時間)
7. 最終洗浄後、井戸間に水を加え、プレートに蓋をして湿ったチャンバーで一晩置きます。

3日目:二次抗体、洗浄、マウントスライド

8. 二次抗体はブロッキングバッファーで1:50の比率で希釈して準備します。
   洗浄液を吸引してください。ピペットを使って各パッドの中心に希釈した二次抗体50μLを分散します。
   注意:すべての二次抗体は、放射波長が重なり合わない異なる蛍光染料と併用されるべきです。例えば、1つの二次抗体はAlexaFluor488(緑)、次にAlexaFluor555(オレンジ)、3つ目はAlexaFluor647(遠赤)で標識し、DAPI(461 nMの励起、青色)と組み合わせることができます。DyLight(Dyomics GmbH社製)など、他の蛍光染料も使用可能です。さらに、これらすべての二次抗体は一次抗体の混合物に使われる他の種と交差反応してはなりません。例えば、抗ウサギの二次抗体はウサギ抗体に選択的に適応し、ラット抗体やモルモットのどちらの抗体も認識しないよう交差適応すべきです。これはすべての二次抗体にも当てはまります。共免疫局在化を行う際には、これらすべての要件を同時に検証するために、よく設計された実験を用いるべきです。
9. 井戸の間に水を加え、湿ったチャンバーに皿を置き、室温で2時間放置します。
10. 井戸から溶液を吸引してください。
11. 1枚の井戸に1mLを使い、室温で各1時間(合計4時間)洗浄を行います。
12. 各ウェルを1mLの1xPBSで室温で10分間洗浄し、このプロセスをさらに2回繰り返します。(合計30分)
13. DAPIを1xPBSで希釈します。
14. 最終濃度1 μg/mLのDAPI(水に溶けたDAPI粉末)を室温で30分間染色し、500 μL/ウェルを置きます。
15. 4°Cの冷凍庫からProLong™ Goldのアンチフェードを取り出し、解凍して室温に戻してください。
16. スライドを1xPBSで室温で30分間、1mL/ウェルで洗います。もう一度やってみて。(合計1時間30分)
17. 最後の洗濯物を落とします。
18. 次に、各パッドの中央にProLong™ Goldのアンチフェードを2滴ずつ加えます。
19. 各スライドにカバースリップを取り付け、ラベルを貼り、細かい鉗子でカバースリップをウェルから持ち上げ、ゆっくりとスライドに置きます。細かい鉗子を使って、ゆっくりと2つ目のカバースリップを1つ目の上に下ろします。真空を使ってカバースリップの端から余分なグリセロールを取り除きます。カバースリップの縁はネイルポリッシュを2回塗ってシールします。
20. スライドをすぐに蛍光顕微鏡で検査しない場合。観察するまで、光から守られた-20°Cの冷凍庫に保管してください。その後、スライドを室温でスライドボックスに横向き、暗闇で1時間置いて結露を防ぎます。

4日目:顕微鏡観察

21. 適切な励起波長とフィルターの下でスライドを観察します。標準的な共焦点顕微鏡で十分ですが、60倍対物レンズを持つ顕微鏡を使用して、0.2μmごとにZスタックを用いて細胞全体の三次元イメージングを行い、Applied Precision SoftWoRx^® ソフトウェアを使った逐次画像取得とデコンボリューション処理を行うことが望ましいです。

結果

このプロトコルを用いることで、トウモロコシ中の3つの主要な減数分裂タンパク質の局在パターンを同時に観察できます(図1)。減数分裂タンパク質ABSENCE OF FIRST DIVISION 1(AFD1)は、減数分裂コヘシン複合体のα-Kleisin REC8サブユニットの相同体です。ASYNAPTIC 1(ASY1)は重要な軸方向要素であり、一方ZYPPER1(ZYP1)はシナプストーン複合体¹⁵の横断要素です。DAPI染色は核とクロマチン染色が明確で、減数分裂の下段を認識することを可能にしますが、また質体およびミトコンドリアのDNAの原生細胞質染色もより淡く示します(図1AおよびC、DAPIチャネルの第2列、矢じり)。同様に、このプロトコルは染色体上だけでなく、前レプトンマ期に細胞質内でもAFD1、A...

ディスカッション

このプロトコルは、減数分裂染色体タンパク質のローディングに関する重要な三次元データを保持するという重要な利点があります。これらの特徴は、通常の拡^{散技術では}保持できません^。しかしながら、このプロトコルには2つの制限があります。1日以内に行う通常の広げ技術と比べて、時間が遅く技術的に要求が高いことです。対照的に、私たちのプロトコルは4日間の作業を必要とします。これは主に一次抗体と二次抗体の洗車作業と一晩のインキュベートが行われ、短期間にすると良好な信号対背景抗体比が失われるためです。

技術的面では、従来の3Dプロトコル8^、12、15の改善は、2つだけでなく3つのタンパク質を同時に可視化できる能力に依存しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum