研究記事

NETs関連の炎症特性と2型糖尿病およびその合併症に関するメンデルランダム化解析

DOI：

10.3791/71230

⸱

2026年8月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Zhongshan People's Hospital, 2Department of Advanced Diagnostic and Clinical Medicine, Zhongshan People's Hospital

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この2サンプルメンデルランダム化（MR）解析により、遺伝的に予測されたNETs関連炎症特性とT2DM合併症との潜在的な関連性が明らかになりました。遺伝的に予測されたIL-6は糖尿病性CADと逆相関しており、一方でNETsはT2DMにおける腎および末梢循環合併症に関連していました。感度分析の結果、これらの有意な関連性は概して安定していることが支持されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球細胞外トラップ（NETs）に関連する炎症特性は、2型糖尿病（T2DM）およびその合併症において重要な役割を果たしています。特に、主要な炎症性サイトカインであるIL-6は、NETsの形成ならびにT2DMおよびその合併症の病態生理と密接に関連しています。本研究は、メンデルランダム化（MR）法を用いて、NETs関連炎症特性とT2DMおよびその合併症との間の因果関係を探索することを目的としました。本研究では、T2DMおよびその合併症に関する大規模な欧州集団ベースのメタ解析を含むゲノムワイド関連解析（GWAS）のデータを用いた2サンプルMR設計を採用しました。主要な解析手法として逆分散加重（IVW）法を用い、MR-Egger回帰、加重中央値法、および加重最頻値法でこれを補完しました。感度分析には、結果の堅牢性を評価するためにMR-Egger、MR-PRESSO、Cochran's Q、およびleave-one-out法を用いました。解析の結果、遺伝的に予測されたinterleukin-6（IL-6）レベルは、糖尿病性冠動脈疾患（CAD）と逆相関していることが示されました（OR = 0.8997, 95% CI: 0.8257–0.9803, P = 0.0158）。さらに、NETsは、腎合併症を伴うT2DM（OR=0.97, 95% CI 0.9428–0.998, P = 0.0358）および末梢循環合併症を伴うT2DM（OR = 1.0342, 95% CI 1.002–1.0673, P = 0.037）と有意な関連を示しました。有意なIVW関連において、不均一性や水平的多面性の証拠は認められませんでした。本研究は、遺伝的に予測されたNETs関連炎症特性が、特定のT2DM合併症に関連していることを示唆しています。遺伝的に予測されたIL-6は糖尿病性CADと逆相関し、一方でNETsはT2DMにおける腎合併症および末梢循環合併症に関連していました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

インスリン抵抗性を特徴とし、しばしば進行性のベータ細胞機能不全を伴う2型糖尿病（T2DM）は、世界的に流行レベルに達しています1,2。心血管疾患、腎不全、ニューロパチー、およびレチノパチーを含むこれらのT2DM合併症は、個人の健康やクオリティ・オブ・ライフだけでなく、世界中のヘルスケアシステムにリソースの逼迫とコスト増大をもたらし、経済にも大きな負担を与えています3,4。T2DMの多面的な性質を考慮すると、その病因因子の詳細な探索が必要です。蓄積されたエビデンスにより、好中球細胞外トラップ（NETs）がさまざまな代謝異常、特にT2DMに関連する病態生理に関与していることが示唆されています。

好中球細胞外トラップ（NETs）は、脱凝縮したDNAと顆粒タンパク質からなる細胞外ネットワークであり、強力な殺菌能を有している5,6。遊離DNAやシトルリン化ヒストンH3などのマーカーは、NETosisの重要な指標として機能し、さまざまな疾患における炎症活性を反映する7,8。蓄積されたエビデンスは、糖尿病がNETsの形成を促進し、それによって炎症と組織損傷を伝播させることを示唆している9,10。臨床的には、NETsマーカーの上昇は、複数の糖尿病合併症において高血糖および不良な転帰と相関している。例えば、dsDNAレベルの上昇はSTEMI患者における血糖調節不全に関連しており11、NETs構成成分は糖尿病網膜症の進行に関連し12、糖尿病性足潰瘍における切断リスクを予測する13。これらの関連性があるにもかかわらず、NETsとT2DMおよびその合併症の発症との正確な因果関係は、まだ完全には解明されていない。蓄積されたエビデンスは、代謝性炎症におけるIL-6とNETsの双方向的な相互作用を強調している。高血糖は好中球をNETosisへとプライミングし、IL-6はこのエネルギー依存的なプロセスの強力な誘導因子として機能する14。臨床的に、IL-6は2型糖尿病におけるNETsマーカー（例：H3Citおよび遊離DNA）の上昇を独立して予測し、これらは血栓形成傾向や糖尿病網膜症などの微小血管合併症と強く相関している15,16。さらに、感染誘導性のNETosisはIL-6のトランスシグナリングを増強させ、相互調節ループを形成することがある17。総じて、これらの知見は、特に糖尿病環境におけるIL-6とNETsの密接に結びついた病態生理を強調している。

メンデルランダム化（MR）は、自然に発生する遺伝的バリアントを操作変数として利用し、修正可能な曝露が健康アウトカムに及ぼす因果効果を推定する強力な統計的手法であり、複雑な疾患経路に関する知見を提供します18。メンデルの遺伝法則に基づいたこのアプローチでは、減数分裂時におけるアレル（対立遺伝子）のランダムな分配を利用することで、観察研究における因果関係の推論が可能となり、因果関係を立証する際の従来の疫学的手法における制限の一部を回避することができます19。

現在まで、遺伝的に予測されるNETs関連の炎症特性とT2DMおよびその合併症との因果関係を調査したMR研究の報告は限られています。したがって、本研究では、2標本MR解析法を用いて、NETs関連の炎症特性とT2DMおよびその合併症との間の潜在的な因果関係を探索することを目的とします。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究デザイン

本研究では、NETsに関連する炎症特性とT2DMおよびその合併症との間の因果関係を探索するために、2サンプルMRアプローチを用いた。MRフレームワークは、次の3つの主要な仮定に基づいている20：1) 遺伝的バリアントが暴露と強固に関連していること、2) 遺伝的バリアントが暴露を通じてのみアウトカムに影響を与えること（多面的影響の排除）、3) 遺伝的バリアントがいかなる交絡因子とも関連していないこと。本研究のプロセスの詳細な概要については、図1を参照されたい。本原稿は、MR研究の報告に関するMR-STROBEガイドラインに準拠しており、透明性と再現性の厳格な基準を確保している21。

データソース

本MR解析に使用したゲノムワイド関連解析（GWAS）データは、GWAS公開データベースから取得した。T2DMに関するサマリーレベルのGWASについては、74,124例のケースと824,006例のコントロールからなる欧州集団の最大規模のメタ解析と、9,978例のケースと12,348例のコントロールを含む欧州で実施された前向きネステッドケースコホート研究を組み合わせて使用した22。腎合併症を伴うT2DMおよび末梢循環合併症を伴うT2DMを含む糖尿病合併症については、ケースを特定の合併症を有するT2DM患者、コントロールをT2DMのない個体とした研究からGWASサマリー統計量を抽出した。データソースの詳細については、付録表1を参照されたい。

NETs関連の炎症特性に関するGWASデータは、GWASカタログから取得した（Supplementary Table 2を参照）。生物学的特異性の不均一性に対処するため、本研究では、好中球生物学における機能的役割に基づき、組み込まれた曝露因子を2つの異なるグループに分類した。(1) コアNETosis関連因子：このカテゴリーには、NETsの構造形成またはクロマチン脱凝集の酵素的プロセスに直接関与するマーカーが含まれる。具体的に、本研究ではNETs自体、Myeloperoxidase (MPO)、Neutrophil Elastase (NE)、およびMPO-DNA複合体を含めた。MPOとNEはヒストン分解およびクロマチン脱凝集に不可欠な酵素であり、MPO-DNA複合体はNETsの特異的な代用マーカーである23。(2) NETs関連炎症メディエーター：このカテゴリーは、NETosisに密接に関連する上流の調節因子または下流のエフェクターとして作用し、かつより広範な炎症経路にも関与するサイトカインおよびメディエーターで構成される。このグループには、Interleukin-6 (IL-6)24、Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α)25、Neutrophil gelatinase-associated lipocalinレベル (NGAL)26、およびCellular Communication Network Factor 1 (CCN1)27が含まれる。

本研究で使用したデータは、オープンアクセスデータベースまたは先行研究で公表されたGWASから取得したものであるため、本研究において倫理的承認は不要であった。

NETs関連遺伝学的指標の選択

NETsの形成は、従来のGWASでは直接的に測定できない動的な生物学的プロセスであるため、本研究では遺伝子ベースのアプローチを用いて、NETsに関連する炎症形質に対する遺伝的指標を同定しました。MPOなど、NETsの形成および調節に極めて重要な関与をすることが知られている257個の遺伝子の包括的なセットを、ヒストンや好中球顆粒タンパク質をコードする遺伝子とともに、確立されたメカニズム研究および既報の文献28から精選しました。

操作変数の選択

NETs関連の炎症形質に対する堅牢な遺伝的指標を特定するため、本研究ではGWASサマリー統計量を用いた逐次フィルタリングワークフローを実施しました。具体的な操作手順は以下の通りです。

初期スクリーニング：曝露形質と有意に関連する遺伝的バリアントを、有意水準 P < 5 × 10⁻6に基づいて抽出した29。

マイナーアレル頻度（MAF）フィルタリング：統計学的パワーを確保するため、MAF ≤ 0.01 の一塩基多型（SNPs）を除外した30。

連鎖不平衡（LD）クランピング：連鎖不平衡（LD）による混同を軽減するため、10,000 kbのウィンドウ内でr2 < 0.001に設定したパラメータを用いてクランピング関数により独立したSNPを選出しました31。

操作変数の強度評価：各残存IVの強度は、F = R2 × (N-2) / (1-R2)として算出されるF統計量を用いて定量化した。弱操作変数バイアスを最小限に抑えるため、F統計量が 10 > のSNPのみを保持した32。

プロキシSNPの同定とデータのハーモナイゼーション

アウトカムデータセットにおける欠損SNPに対処するため、本研究ではプロキシ検索およびデータハーモナイゼーションプロセスを実施した：

プロキシ置換：曝露GWASのターゲットSNPがアウトカムGWASで利用できなかった場合、本研究では1,000 Genomes Projectの欧州リファレンスパネルに基づくLDproxy()関数を利用した。元のSNPと高いLD（r2> 0.8）を示した場合にのみ、候補となるプロキシSNPを選択した。適切なプロキシが見つからなかった場合、そのSNPは除外した。

ハーモナイゼーション：TwoSampleMRパッケージ（R version 4.0.5）のharmonise_data()関数を用いて、曝露データセットとアウトカムデータセットを整合させた。本研究では、パラメータを action = 2 に設定し、すべてのSNPを自動的にフォワードストランドに合わせ、ストランド方向が曖昧なパリンドロミックSNPを削除した。

検証：ハーモナイゼーション後、本研究ではハーモナイズされたデータセットを手作業で検査し、曝露データとアウトカムデータの間でエフェクトアレル頻度が一致していることを確認した。

MR解析および感度分析

因果推論は、TwoSampleMRパッケージ（R version 4.0.5）を用いて実施した。

主要分析および二次分析：本研究では、主要なアプローチとして逆分散加重（IVW）法を適用した33。また、頑健性を確保するため、MR-Egger法34、加重中央値法、および加重モード法を用いて補完的な分析を行った35。

感度分析：IV間の不均一性は、mr_heterogeneity()関数を用いたCochranのQ検定36により評価した。水平多面発現性は、MR-Egger34切片検定（mr_pleiotropy_test()）を用いて評価した。

外れ値検出：本研究では、潜在的な外れ値を検出するためにMR-PRESSOパッケージを用いた37。mr_presso()関数を1,000回のシミュレーションで実行した。特定された外れ値SNP（P < 0.05）を除去し、結果の安定性を検証するために因果推定値を再計算した。さらに、因果関係が単一のSNPによって主導されていないことを確認するため、leave-one-out解析を実施した38。

統計学的補正

多重検定を考慮し、メンデルランダム化（MR）分析から得られたP値は、偽発見率（FDR）法を用いて補正した。これは、以下の方法で実施した。 PRにおけるparameter method = を指定した .adjust() 関数 "偽発見率"補正後のP値で有意な関連（P偽発見率) < 0.05未満を統計学的に有意であるとみなした。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

選択された操作変数

本研究では、NETsに関連する炎症特性を曝露因子としてMR解析を実施しました。この目的のために計106個のIVが特定され、詳細はSupplementary Table 3に記載されています。これらのIVのF統計量の平均値は26.46であり、最小値20.6から最大値250.4の範囲でした。

T2DMおよびその多様な合併症（糖尿病性ケトアシドーシス、腎合併症、眼合併症、神経合併症、および末梢循環合併症）をアウトカムとして採用した際、サマリーデータにおいて3つのSNPの情報が一致しませんでした。本研究では、プロキシSNPを利用しました（付表4).

NETsに関連する炎症特性とT2DMおよびその合併症との因果関係

IVW法による主要な解析結果を以下に示します。 表1 ～の間、～しつつ 補足表5 MR-Egger法、加重中央値法、および加重モード法を用いて導出された補完的なMR推定値を詳述する。特筆すべき点として、IVWの結果では、インターロイキン-6（IL-6）値と糖尿病合併CADとの間に統計的に有意な関連が認められた（OR = 0.8997, 95% CI 0.8257–0.9803, P = 0.0158)であり、加重中央値法（weighted median method）の結果と一致していた。これらの知見は、IL-6が糖尿病の心血管合併症と遺伝的に関連していることを示唆していた。加えて、IVW解析の結果、NETsは腎合併症を伴うT2DMと有意に関連していることが示された（OR = 0.97, 95% CI 0.9428–0.998, P=0.0358) および末梢循環障害を伴う2型糖尿病（T2DM）（OR = 1.0342, 95% CI 1.002–1.0673, P = 0.037）。上述の陽性結果に関する散布図およびフォレストプロットを〜に示します。 図2.

MR Egger回帰分析の結果は、分析において水平多面発現の証拠がないことを示しており、詳細は以下に記載されている。 表2CochranのQ検定で示された不均一性の結果に基づき（表2) および ファンネルプロット（図3A–C）、いずれの〜も認められないことが観察された。 P Q統計量の値が従来の閾値である0.05を下回っており、本研究の主要関心アウトカムにおける独立変数（IV）間に有意な異質性は認められないことを示している。

さらに、MR-PRESSO解析（表 3）において、CCN1を曝露、T2DMをアウトカムとした場合に外れ値（rs139237904）が特定されましたが、これを除外した後も結果は非有意のままでした。同様に、MPOを曝露、T2DMをアウトカムとした場合には、2つの外れ値（rs10916508およびrs6544660）が検出されましたが、除去後も非有意な結果が持続しました。NGALを曝露、T2DMをアウトカムとした場合は、1つの外れ値（rs10497219）が見つかり、除外後も負の結果が維持されました。TNF-αを曝露、ケトアシドーシスを伴うT2DMをアウトカムとした場合は、単一の外れ値（rs10103048）が存在しましたが、除外しても非有意であるという結果に変わりはありませんでした。しかし、NGALをT2DMおよび神経学的合併症に関連付けた場合には、2つの外れ値（rs10497219およびrs1287048）が特定され、これらを除去したところ、結果は陽性に転じ、有意な関連が示されました。「leave-one-out」解析（図 3D–F）により、得られた知見の堅牢性がさらに裏付けられました。要約すると、このMR解析は、糖尿病合併症の発症機序においてIL-6およびNETsが潜在的な役割を果たしていることを示唆しており、さらなる調査が正当化されます。

データの可用性：

本研究で生成または分析されたすべてのデータは、本論文および補足表1、補足表2、補足表3、補足表4、補足表5に含まれています。

figure-results-1
図1: 本MR研究の研究デザイン。 (A) MR解析は3つの核心的な仮定に基づいている。 (B) 研究デザインの概略。 NETs：好中球細胞外トラップ； T2DM：2型糖尿病； SNP：一塩基多型； MR：メンデルランダム化； IVW：逆分散加重法； MR-PRESSO：Mendelian Randomization Pleiotropy RESidual Sum and Outlier こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-2
図2NETs関連炎症形質と2型糖尿病およびその合併症との因果関係. (A) IL-6レベルと糖尿病性CADとの関連を示す散布図。 (B) NETsと腎合併症を伴う2型糖尿病（T2D）との関連を示す散布図。（C) 末梢循環合併症を伴うNETsとT2Dの関連を示す散布図。 (D糖尿病性CADにおけるIL-6レベルのフォレストプロット。E) 腎合併症を伴う2型糖尿病におけるNETsのフォレストプロット。F: 末梢循環器合併症を伴う2型糖尿病におけるNETsのフォレストプロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3感度分析の結果. (A) 糖尿病性CADにおけるIL-6レベルのファンネルプロット (B) 腎合併症を伴う2型糖尿病におけるNETsのファンネルプロット。 (C) 末梢循環合併症を伴う2型糖尿病におけるNETsのファンネルプロット (D糖尿病性CADにおけるIL-6レベルのleave-one-out感度分析。E) 腎合併症を伴う2型糖尿病におけるNETsのleave-one-out感度分析（F) 末梢循環障害を伴う2型糖尿病におけるNETsのleave-one-out感度分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1：T2DMおよびその合併症におけるNETs関連炎症形質との主な因果関係 こちらのリンクからこの表をダウンロードしてください。

表2：操作変数の不均一性と多面性の結果 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3：MR-PRESSOの結果 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 1：T2DMおよびその合併症のデータソース こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表2：NETs関連炎症特性のデータソース こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表3：操作変数（IV）の選択 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表4：MR解析に使用したプロキシSNPの一覧 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表5：NETs関連の炎症形質とT2DM合併症の間の因果関係に関する相補的MR推定値 こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、2サンプルMRアプローチを用いて、NETsに関連する炎症特性とT2DMおよびその合併症との関連性を調査しています。主な知見として、遺伝的に予測されたIL-6レベルと糖尿病性CADとの間に統計的に有意な逆相関があることが示唆されました。この結果は、血中のIL-6が糖尿病の心血管合併症に対して直接的な保護効果を持つというよりも、IL-6シグナル伝達経路の複雑な遺伝的構造を反映している可能性があります。さらに、本研究では、T2DM患者における腎合併症や末梢循環合併症を含む、NETsとさまざまな糖尿病合併症との関連性が明らかになりました。これらの関連性は、糖尿病関連合併症の病態におけるNETsの重要性を強調するものであり、これらの炎症経路を標的とした将来的な治療戦略に寄与する可能性があります。

IL-6と糖尿病性CADとの関連については、IL-6の役割に関して様々な視点から研究が行われており、大きな議論の対象となってきました。本研究は、IL-6が糖尿病に関連する心血管合併症に対して、複雑で負の相関を持つ可能性を示唆しています。Cupido et al.39はこれらの知見を裏付けており、IL-6シグナルの変動が心代謝疾患リスクの低下に関連しているとしています。対照的に、Indumathi et al.40は、糖尿病患者においてIL-6の低メチル化と過剰発現を観察し、CADにおける病原性役割を示唆しました。これは、IL-6レベルの上昇を前炎症性の要因および糖尿病性CADの予後マーカーとして同定したShrivastav et al.41およびChittaragi et al.42の結果と一致しています。しかし、Liu et al.43は、アテローム動脈硬化におけるIL-6のようなアディポカインの二面性を強調しており、この状況依存的な二面性が、研究間での相反する証拠の説明になると考えられます。これらの知見の不一致は、いくつかの要因に起因すると考えられます。第一に、研究デザイン、患者集団、およびIL-6レベルの測定方法の不均一性が、結論の相違につながった可能性があります44。第二に、IL-6とCAD発症との時間的関係は複雑であり、因果的成分と反応的成分の両方が関与している可能性があり、それは横断的研究や一部の縦断的研究では完全には捉えきれない可能性があります45。

本研究およびその他のいくつかの研究は、IL-6と糖尿病性CADとの間に有意な関連があることを示唆していますが、この関係の正確な性質は依然として複雑であり、さまざまな生物学的および方法論的要因に影響される可能性があります。今回のMR解析では、遺伝的に予測されたIL-6レベルと糖尿病関連CADとの間に統計的に有意な負の関連（OR=0.8997）が示されており、これはIL-6が心血管病理を促進するという従来の見解とは対照的であることは注目に値します。この不一致は、炎症と組織修復におけるIL-6の複雑な二面性46に起因するか、あるいはMR解析で使用された遺伝的手段が、全身的な総効果とは異なるIL-6シグナル伝達の特定の生物学的経路を反映している可能性が考えられます。本研究で観察された負の関連を、単にIL-6に心保護作用があることを示すと解釈すべきではありません。むしろ、それはIL-6受容体シグナル伝達の背後にある複雑な遺伝的メカニズムを反映している可能性が高いと考えられます。あるいは、観察された負の関連は、従来の観察研究では十分に捉えられていない、炎症ネットワーク内の代償機構や負のフィードバックループの影響を受けている可能性もあります。今後の研究では、適切に設計された縦断的研究を通じて、またCAD発症の多因子的な性質を考慮することで、これらの複雑性を解明することを目指すべきです。

糖尿病合併症、特に腎疾患の文脈におけるNETsの役割は、炎症と組織損傷の重要な媒介因子としてますます認識されるようになっています。Magaña-Guerrero et al.12は、糖尿病網膜症におけるNETsを高血糖および腎不全に関連付け、それらを疾患進行のマーカーとして位置づけています。糖尿病性腎臓病（DKD）の文脈では、Liu et al.47が、midkineのアップレギュレーションがNETsの形成を促進することで腎障害を促進することを実証しており、一方でZheng et al.48は、NETsが糸球体内皮機能不全とパイロトーシスを誘導し、これらの効果がDNase I処理によって減弱することを示しています。これらの実験的知見に加え、最近のMRおよびトランスクリプトーム解析により、特定のNETs関連遺伝子（例：CLIC3、GBP2）が増殖性糖尿病網膜症の因果的リスク因子であることが特定されました28。興味深いことに、この遺伝学的根拠は、腎合併症との負の相関を示すこれらの知見とは対照的であり、NETsの組織特異的なメカニズムを浮き彫りにしています。総じて、本研究は、T2DMにおけるNETsと末梢循環合併症との間に有意な因果関係があることを実証することで、この状況を補完するものです。糖尿病性腎症におけるNETsの役割に影響を及ぼし得る要因の複雑な相互作用を解明するためには、さらなる研究が不可欠です。

本研究では、IL-6と糖尿病性CADとの潜在的な関連性に加え、NETsと他の糖尿病合併症との間に有意な相関があることが明らかになったが、これら2つの炎症性メディエーター間の相互作用についてはさらなる調査が必要である。本研究では、IL-6からNETsへの因果経路を検証するための専用のMR解析は実施していないが、多くの実験的根拠により、IL-6がNETsに関連する炎症性形質のアップストリームドライバーとして機能する可能性が示唆されている。

生物学的に、IL-6は急性相反応における中心的なサイトカインである。49 そして、好中球を刺激してNETsの形成を誘導することが示されている。50糖尿病の高血糖微小環境においてしばしば観察されるIL-6レベルの上昇51、好中球内のJAK/STAT3シグナル伝達経路を活性化させることができる52この活性化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）の転写レベルでの発現上昇における重要なステップである。53ヒストンのシトルリン化とクロマチンの脱凝集を担う酵素である54, NETosisの特徴54したがって、全身性のIL-6の上昇がNETsの過剰な形成を促進し、それがさらに血管内皮障害と血栓症を悪化させ、糖尿病性CADや腎病変を含む多様な糖尿病合併症を引き起こすという、一連の病理学的軸を想定することは生物学的に妥当である。IL-6による有害な影響がどの程度NETsを介して起こっているかを正式に定量化するには、多変数MR（メンデルランダム化）または媒介分析を用いた今後の研究が必要である。

ここで提示した分析フレームワークは、今後の応用に大きな可能性を秘めています。方法論的には、このワークフローを多変数メンデルランダム化解析（MVMR）に拡張することで、相関のある暴露因子の独立した因果効果を分析でき、より包括的に複雑な生物学的経路に対処することが可能です。さらに、今後の反復的な解析に共局在化分析を統合することで、暴露因子とアウトカムが同一の因果変異を共有していることを検証でき、連鎖不平衡によるバイアスのリスクをさらに低減できます。臨床的には、このアプローチは薬物標的バリデーションのための堅牢な設計図を提供します。水平多面発現性を系統的にフィルタリングし、操作変数の妥当性を確保することで、本フレームワークは臨床的成功の確率が高い治療標的を優先順位付けすることができます。最終的に、これらの遺伝学的知見をリスク予測モデルに変換することで、精密医療戦略を促進し、早期介入から最大の利益を得られる高リスクサブグループを特定できる可能性があります。

本研究では、遺伝的バリアントを操作変数（IV）として活用し因果関係を立証する2サンプルMRアプローチを採用しており、これによりNETs関連の炎症特性とT2DMおよびその合併症との関係を探索するための強固なフレームワークを提供します。このアプローチは、MRを用いて交絡や逆因果関係を軽減することで、観察研究よりも精度を向上させています。IVW推定のみに依存する標準的なMR実装とは異なり、本研究では堅牢な感度分析（加重中央値法、MR-Egger法）と多面的作用（プレオトロピー）のチェックを統合しました。このマルチメソッド・フレームワークにより、因果推定値が無効な操作変数によって左右されないことが保証され、単一手法による分析よりも高い妥当性が得られます。さらに、データの調和と品質管理のための標準化された透明性の高いプロトコルを通じて、本アプローチの再現性が確保されており、複雑な遺伝学的解析でしばしば見られる「再現性の危機」に対処しています。効率性と適用性の点では、この合理化されたパイプラインにより、手動のデータキュレーションに伴う計算負荷が軽減され、複数の表現型の迅速なスクリーニングが可能になります。この拡張性により、本フレームワークは一般的な解析のみならず、ハイスループットなフェノームワイド関連スキャンにも幅広く適用でき、硬直的な単一ステップの観察的アプローチよりも、複雑な生物学的ネットワークを探索するためのより汎用性の高いツールとなります。

しかしながら、本研究には限界もあります。まず、遺伝的操作変数の使用は、選択されたバリアントが関心のある曝露およびアウトカムと単一の経路を通じて関連しているという仮定に基づいており、生物学的システムの複雑さを完全には捉えきれていない可能性があります。第二に、本研究のMR解析は主に欧州集団のデータに基づいているため、他の民族的または地理的な集団に対する結果の汎用性は限定的である可能性があります。第三に、本研究ではNETsに関連する炎症形質とT2DMおよびその合併症との間の潜在的な関連性を明らかにしましたが、具体的な分子調節ネットワークおよび基礎となる生物学的メカニズムについては、今後の実験的研究によるさらなる解明が必要です。重要な点として、有意な因果関係は糖尿病性CAD、腎合併症、および末梢循環合併症などの特定の合併症に限定されており、テストしたすべての糖尿病アウトカムにおいて一様に観察されたわけではないことに留意する必要があります。さらに、MRは交絡を低減させることができますが、測定されていない環境要因や集団層別化などのあらゆる潜在的なバイアスの要因を排除できるわけではありません。

さらに、本知見の汎用性は、遺伝データが由来する特定の集団によって制限される可能性があり、これらの結果を確認するには多様な集団での再現性が不可欠である。本研究では大規模なGWASサマリー統計量を利用しているが、臨床コホートや実験モデルからの補完的なマルチオミクスシーケンシングデータがないため、観察された因果関係の根底にある分子メカニズムや転写変化を検証する能力には限界がある。本MRワークフローでは、分析上の課題、特にアレル調和（allele harmonization）と多面発現（pleiotropy）に対処するための特定の調整が必要であった。回文構造を持つSNPによるストランドの曖昧さを軽減するため、本研究では中間アレル頻度（>0.42）を持つバリアントを厳格に除外するようにパイプラインを変更した。さらに、潜在的な水平多面発現をトラブルシューティングするため、本ワークフローにMR-PRESSO外れ値検定を統合した。これにより、不適切な操作変数の反復的な除去が可能となり、最終的な因果推定値が堅牢であり、多面発現的な外れ値によって駆動されていないことが保証された。

MRの結果の妥当性は、いくつかの重要な解析ステップに大きく依存しています。第一に、IVの厳格な選択が極めて重要です。厳格なゲノムワイドな有意性の閾値（P<5×10-6）および連鎖不平衡（r2<0.001）に基づくクランピングを遵守することで、本研究では弱操作変数バイアスのリスクを最小限に抑え、選択されたSNPが曝露と強く関連していることを確実にしました。第二に、因果推定の堅牢性は、水平多面発現への対処に依存します。本研究では、MR-Egger、加重中央値法、およびMR-PRESSOという複数の相補的な手法を用いて必要な安全策を講じました。これらの手法間での一貫性と、MR-Eggerの切片が有意でなかったことは、IVが曝露のみを通じてアウトカムに影響を及ぼすという仮定を支持しています。遺伝的変異はNET関連の炎症特性のプロキシとして機能し得ますが、生殖細胞系列の遺伝型から転写活性化、そしてタンパク質放出に至る調節経路には厳密に線形ではない複雑な生物学的プロセスが含まれるため、in vivoにおけるNETosisの動的かつリアルタイムな変動を完全に反映しているとは限りません。再現性に関しては、大規模で公開されているGWASサマリー統計量を使用しているため、本解析は独立して検証することが可能です。ハーモナイゼーションや外れ値除去の具体的なパラメータを含む解析パイプラインの透明性により、これらの結果を正確に再現することができます。これらのステップが総合的に本研究の内部妥当性を高め、今後の研究に向けた再現可能な枠組みを提供しています。

結論として、本研究では2サンプルMR法を用いて、NET関連炎症特性とT2DMおよびその合併症との関連を調査した。その結果、IL-6レベルと糖尿病性CADとの間に有意な関連が認められ、糖尿病の心血管合併症におけるIL-6の潜在的な役割が浮き彫りとなった。さらに、本研究ではNETsと、腎不全や末梢循環不全を含むさまざまな糖尿病合併症との関連が明らかになり、糖尿病関連疾患の病態形成におけるNET関連炎症特性の重要性が強調された。これらの知見は、T2DMにおける炎症、糖代謝、および血管健康状態の間の複雑な相互作用の理解に寄与するものである。本研究は糖尿病合併症におけるNETsの役割について貴重な証拠を提供する一方で、関与する生物学的メカニズムの複雑さを認め、正確な経路と潜在的な治療標的を解明するためのさらなる研究が必要であるとしている。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、中山社会科学・技術研究重点プロジェクト（助成番号：2021B3013）および中山社会科学・技術研究プロジェクト（助成番号：2022B1080）の支援を受けて行われました。助成者は、研究デザイン、データ収集および解析、出版の決定、または原稿の作成において一切の役割を担っておりません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CCN1GWASカタログGCST90277805http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90277001-GCST90278000/GCST90277805/harmonised/GCST90277805.h.tsv.gz
糖尿病性冠動脈疾患GWASカタログGCST006405http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST006001-GCST007000/GCST006405/Fall_gwas_results_any_chd_tab.txt.gz
IL-6GWASカタログGCST90010146http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90010001-GCST90011000/GCST90010146/harmonised/33303764-GCST90010146-EFO_0007937.h.tsv.gz
ミエロペルオキシダーゼGWASカタログGCST90087967http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90087001-GCST90088000/GCST90087967/harmonised/35078996-GCST90087967-EFO_0011039.h.tsv.gz
MPO-DNAGWASカタログGCST90013658http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90013001-GCST90014000/GCST90013658/harmonised/33717105-GCST90013658-EFO_0005243.h.tsv.gz
MR-PRESSOパッケージGitHub (rondolab)バージョン 1.0多面的効果（pleiotropy）を検出し、多面的効果を補正した因果推論値を算出するために使用されるRパッケージ。
NEGWASカタログGCST90162366http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90162001-GCST90163000/GCST90162366/harmonised/GCST90162366.h.tsv.gz
好中球細胞外トラップ（NETs）GWASカタログGCST90137414http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90137001-GCST90138000/GCST90137414/harmonised/GCST90137414.h.tsv.gz
NGALGWASカタログGCST90161504http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90161001-GCST90162000/GCST90161504/harmonised/GCST90161504.h.tsv.gz
R ソフトウェアR Foundation for Statistical Computingバージョン 4.0.5すべての解析に使用した主要な統計計算環境。
2型糖尿病FINN R92型糖尿病https://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_T2D.gz
ケトアシドーシスを伴う2型糖尿病FINN R9E4_DM2KETOhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2KETO.gz
神経学的合併症を伴う2型糖尿病FINN R9E4_DM2NEUhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2NEU.gz
眼合併症を伴う2型糖尿病FINN R9E4_DM2OPTHhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2OPTH.gz
末梢循環障害を伴う2型糖尿病FINN R9E4_DM2PERIPHhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2PERIPH.gz
腎合併症を伴う2型糖尿病FINN R9E4_DM2RENhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2REN.gz
TNF-αGWASカタログGCST004426http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST004001-GCST005000/GCST004426/harmonised/27989323-GCST004426-EFO_0004684.h.tsv.gz
TwoSampleMRパッケージGitHub (MRCIEU)バージョン 0.6.22メンデルランダム化分析に使用したRパッケージ。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanase DM, et al. The intricate relationship between type 2 diabetes mellitus (T2DM), insulin resistance (IR), and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). J Diabetes Res. 2020;2020:3920196.
  2. Yan Y, et al. Prevalence, awareness and control of type 2 diabetes mellitus and risk factors in Chinese elderly population. BMC Public Health. 2022;22(1):1382.
  3. Dugani SB, Mielke MM, Vella A. Burden and management of type 2 diabetes in rural United States. Diabetes Metab Res Rev. 2021;37(5):e3410.
  4. Rodriquez IM, O'Sullivan KL. Youth-onset type 2 diabetes: Burden of complications and socioeconomic cost. Curr Diab Rep. 2023;23(5):59-67.
  5. Zhang H, et al. Neutrophil, neutrophil extracellular traps and endothelial cell dysfunction in sepsis. Clin Transl Med. 2023;13(1):e1170.
  6. Hidalgo A, et al. Neutrophil extracellular traps: From physiology to pathology. Cardiovasc Res. 2022;118(13):2737-53.
  7. Goggs R, Jeffery U, Levine DN, Li RHL. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA, and immunothrombosis in companion animals: A review. Vet Pathol. 2020;57(1):6-23.
  8. Tilley DO, et al. Histone H3 clipping is a novel signature of human neutrophil extracellular traps. Elife. 2022;11.
  9. Shafqat A, et al. Emerging role of neutrophil extracellular traps in the complications of diabetes mellitus. Front Med (Lausanne). 2022;9:995993.
  10. Njeim R, et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 2020;65(4):R65-76.
  11. Helseth R, et al. Glucose associated NETosis in patients with ST-elevation myocardial infarction: An observational study. BMC Cardiovasc Disord. 2019;19(1):221.
  12. Magana-Guerrero FS, et al. Spontaneous neutrophil extracellular traps release are inflammatory markers associated with hyperglycemia and renal failure on diabetic retinopathy. Biomedicines. 2023;11(7).
  13. Ibrahim I, et al. Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with type 2 diabetes and diabetic foot ulcer related amputation: A prospective cohort study. Diabetes Ther. 2024;15(6):1333-48.
  14. Joshi MB, et al. High glucose modulates IL-6 mediated immune homeostasis through impeding neutrophil extracellular trap formation. FEBS Lett. 2013;587(14):2241-6.
  15. Bryk AH, et al. Predictors of neutrophil extracellular traps markers in type 2 diabetes mellitus: Associations with a prothrombotic state and hypofibrinolysis. Cardiovasc Diabetol. 2019;18(1):49.
  16. Park JH, et al. Evaluation of circulating markers of neutrophil extracellular trap (NET) formation as risk factors for diabetic retinopathy in a case-control association study. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2016;124(9):557-61.
  17. Winslow S, et al. Multi-omics links IL-6 trans-signalling with neutrophil extracellular trap formation and Haemophilus infection in COPD. Eur Respir J. 2021;58(4).
  18. Bowden J, Holmes MV. Meta-analysis and Mendelian randomization: A review. Res Synth Methods. 2019;10(4):486-96.
  19. Birney E. Mendelian randomization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2022;12(4).
  20. Sanderson E, et al. Mendelian randomization. Nat Rev Methods Primers. 2022;2.
  21. Skrivankova VW, et al. Strengthening the reporting of observational studies in epidemiology using Mendelian randomization: The STROBE-MR statement. JAMA. 2021;326(16):1614-21.
  22. Liang YC, et al. Association of circulating inflammatory proteins with type 2 diabetes mellitus and its complications: A bidirectional Mendelian randomization study. Front Endocrinol (Lausanne). 2024;15:1358311.
  23. Papayannopoulos V, Metzler KD, Hakkim A, Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 2010;191(3):677-91.
  24. Kindberg KM, et al. IL-6R signaling is associated with PAD4 and neutrophil extracellular trap formation in patients with STEMI. Int J Mol Sci. 2025;26(11).
  25. Mao CL, et al. Neutrophil extracellular traps in rheumatoid arthritis: Pathogenic mechanisms and therapeutic potential. Front Immunol. 2025;16:1717671.
  26. Li H, et al. Hepatocytes and neutrophils cooperatively suppress bacterial infection by differentially regulating lipocalin-2 and neutrophil extracellular traps. Hepatology. 2018;68(4):1604-20.
  27. Li T, et al. Cellular communication network factor 1 promotes retinal leakage in diabetic retinopathy via inducing neutrophil stasis and neutrophil extracellular traps extrusion. Cell Commun Signal. 2024;22(1):275.
  28. Hao L, et al. Transcriptome sequencing and Mendelian randomization analysis identified biomarkers related to neutrophil extracellular traps in diabetic retinopathy. Front Immunol. 2024;15:1408974.
  29. Wang S, et al. Association between periodontitis and temporomandibular joint disorders. Arthritis Res Ther. 2023;25(1):143.
  30. Yin KJ, et al. No genetic causal association between periodontitis and arthritis: A bidirectional two-sample Mendelian randomization analysis. Front Immunol. 2022;13:808832.
  31. Genomes Project C, et al. A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature. 2010;467(7319):1061-73.
  32. Burgess S, Thompson SG, Collaboration CCG. Avoiding bias from weak instruments in Mendelian randomization studies. Int J Epidemiol. 2011;40(3):755-64.
  33. Burgess S, Butterworth A, Thompson SG. Mendelian randomization analysis with multiple genetic variants using summarized data. Genet Epidemiol. 2013;37(7):658-65.
  34. Burgess S, Thompson SG. Interpreting findings from Mendelian randomization using the MR-Egger method. Eur J Epidemiol. 2017;32(5):377-89.
  35. Bowden J, Davey Smith G, Haycock PC, Burgess S. Consistent estimation in Mendelian randomization with some invalid instruments using a weighted median estimator. Genet Epidemiol. 2016;40(4):304-14.
  36. Greco MF, Minelli C, Sheehan NA, Thompson JR. Detecting pleiotropy in Mendelian randomisation studies with summary data and a continuous outcome. Stat Med. 2015;34(21):2926-40.
  37. Verbanck M, Chen CY, Neale B, Do R. Publisher correction: Detection of widespread horizontal pleiotropy in causal relationships inferred from Mendelian randomization between complex traits and diseases. Nat Genet. 2018;50(8):1196.
  38. Cheng H, Garrick DJ, Fernando RL. Efficient strategies for leave-one-out cross validation for genomic best linear unbiased prediction. J Anim Sci Biotechnol. 2017;8:38.
  39. Cupido AJ, et al. Dissecting the IL-6 pathway in cardiometabolic disease: A Mendelian randomization study on both IL6 and IL6R. Br J Clin Pharmacol. 2022;88(6):2875-84.
  40. Indumathi B, Oruganti SS, Sreenu B, Kutala VK. Association of promoter methylation and expression of inflammatory genes IL-6 and TNF-alpha with the risk of coronary artery disease in diabetic and obese subjects among Asian Indians. Indian J Clin Biochem. 2022;37(1):29-39.
  41. Shrivastav D, et al. Comparative analysis of Nε-carboxymethyl-lysine and inflammatory markers in diabetic and non-diabetic coronary artery disease patients. World J Diabetes. 2023;14(12):1754-65.
  42. Chittaragi GH, Ambali AP, Honnutagi R, Ganesh V. Interleukin-6 and uric acid among type 2 diabetes mellitus patients with coronary artery disease. Bioinformation. 2023;19(12):1134-8.
  43. Liu L, et al. Adipokines, adiposity, and atherosclerosis. Cell Mol Life Sci. 2022;79(5):272.
  44. Hua MJ, Butera G, Akinyemi O, Porterfield D. Biases and limitations in observational studies of long COVID prevalence and risk factors: A rapid systematic umbrella review. PLoS One. 2024;19(5):e0302408.
  45. Savitz DA, Wellenius GA. Can cross-sectional studies contribute to causal inference? It depends. Am J Epidemiol. 2023;192(4):514-6.
  46. Hirano T. IL-6 in inflammation, autoimmunity and cancer. Int Immunol. 2021;33(3):127-48.
  47. Liu G, Ren X, Li Y, Li H. Midkine promotes kidney injury in diabetic kidney disease by increasing neutrophil extracellular traps formation. Ann Transl Med. 2022;10(12):693.
  48. Zheng F, et al. Neutrophil extracellular traps induce glomerular endothelial cell dysfunction and pyroptosis in diabetic kidney disease. Diabetes. 2022;71(12):2739-50.
  49. Schmidt-Arras D, Rose-John S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 2016;64(6):1403-15.
  50. Xiao Y, et al. Cathepsin C promotes breast cancer lung metastasis by modulating neutrophil infiltration and neutrophil extracellular trap formation. Cancer Cell. 2021;39(3):423-37.e427.
  51. Sater MS, et al. Plasma IL-6, TREM1, uPAR, and IL6/IL8 biomarkers increment further witnessing the chronic inflammation in type 2 diabetes. Horm Mol Biol Clin Investig. 2023;44(3):259-69.
  52. Martino N, et al. Endothelial SOCS3 maintains homeostasis and promotes survival in endotoxemic mice. JCI Insight. 2021;6(14).
  53. Akboua H, Eghbalzadeh K, Keser U, Wahlers T, et al. Impaired non-canonical transforming growth factor-β signalling prevents profibrotic phenotypes in cultured peptidylarginine deiminase 4-deficient murine cardiac fibroblasts. J Cell Mol Med. 2021;25(20):9674-84.
  54. Thiam HR, et al. NETosis proceeds by cytoskeleton and endomembrane disassembly and PAD4-mediated chromatin decondensation and nuclear envelope rupture. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(13):7326-37.

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

6

関連記事