ショウジョウバエ脳における原大脳前内側細胞クラスターのドーパミン作動性ニューロン数のグループ差を検出する半自動化方法

サマリー

このプロトコルは、大型ショ ウジョウバエ の原大脳前内側クラスターにおけるドーパミン作動性ニューロン数を定量化する半自動化手法を提示します。実験群と対照群の違いを検出・比較するために特別に設計されたこの手法は、手作業によるカウントへの依存を減らし、グループレベルの分析に実用的なツールを提供します。

要約

ショウジョウバエ・メラノガスター は、主にドーパミン作動性(DA)ニューロン変性およびそれに伴う運動障害の解析を通じて、パーキンソン病(PD)を含む神経変性疾患を研究する強力なモデル生物として機能しています。歴史的に、ハエの脳におけるDAニューロン喪失の定量化は、原大脳後方内側(PPM)クラスターや原大脳後方外側(PPL)クラスターなど、より小さく容易に計算可能なクラスターに限定されてきました。対照的に、100以上のニューロンからなるはるかに大きな原大脳前内側(PAM)クラスターは、手動計数に大きな課題をもたらし、定量的研究で過小評価されています。これまでのところ、報告された調査は依然として手間のかかる共焦点Zスタックによる手動カウントに依存しており、時間がかかり変動しやすいです。この方法論的なギャップを埋めるために、オープンソースツールLabkitを用いて半自動化画像解析パイプラインを開発しました。このプロトコルにより、同じ実験バッチ内のPAMクラスター内のチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性ニューロンの効率的な相対的定量化が可能となります。この方法は標準的な免疫蛍光染色と共焦点イメージングから始まり、その後、詳細な段階的なセグメンテーションと解析ガイドが提供されます。このアプローチはPAMクラスター定量のボトルネックを解決し、神経変性モデルにおけるDAニューロン脆弱性のグループ間差異を検出するための実用的なワークフローを提供します。PAMクラスターに関するPD研究の相対的な希少性は、生物学的関連性の欠如ではなく、歴史的な技術的障壁を反映しています。この障壁を克服することで、本手法はパーキンソン病におけるPAMニューロン脆弱性と非運動症状との潜在的な関連性を体系的に調査する扉を開きます。

概要

酢バエ(Drosophila melanogaster)は、神経変性疾患、特にパーキンソン病(^PD)1の遺伝的および分子的基盤を調査するための人気のあるモデル生物です。保存された神経シグナル伝達経路、高度な遺伝学ツールキット、短い寿命により、年齢依存的な神経脆弱性の研究や高スループットの遺伝学的・薬理学的スクリーニングの実施に非常に適しています ^2,3。これらの研究の中心は、^PD4の病理的特徴である選択的変性であるドーパミン作動性(DA)ニューロンの解析です。ショウジョウバエの脳では、DAニューロンは遺伝的に識別可能な^{クラスター5,6}に組織されています。特定のクラスター内でのDAニューロンの進行的喪失は、TH免疫染色で可視化され顕微鏡で定量化されており、^{実験モデルにおける}疾患進行評価や神経保護介入の主要な機能指標となります^7,8。したがって、ショウジョウバエ遺伝学の力を意味のあるPD研究成果に翻訳するためには、DAニューロン喪失の信頼できる定量化が不可欠です。

従来、DAニューロン喪失の定量的解析は、原大脳後内側(PPM)クラスターや前脳後側外側(PPL)クラスターを含む小さなクラスターのチロシンヒドロキシラーゼ(TH)免疫染色に焦点を当ててきました。これらのクラスターは、眼⁷で容易に数えられる細胞数が10未満です。共焦点Zスタックを用いた手動列挙は手間がかかりますが、ショウジョウバエ^9,10,11を用いた多くのPD研究でこれらのクラスターの確立された方法となっています。これに対し、ハエ脳で最大のDAニューロン群である原脳前内側(PAM)クラスターの手動カウントは、100以上の細胞からなるため、長年の方法論的ボトルネックとなり、PD研究の大多数(^9,10,11)での含めが妨げられています。PAMニューロンは学習、記憶、動機付け回路において重要な役割を果たしていますが、この限界により神経変性の定量的分析では相対的に過小代表されています(^12,13,14,15)。注目すべきは、最近の調査でさえこの非効率な手動カウント手法に依存し続けており^{、現場における}標準化された自動化されたソリューションの持続的かつ未充足の必要性を強調しています。

この重要なギャップを埋めるために、実験内でPAMクラスター内のTH正(TH⁺)ニューロンの効率的なグループ相対定量化を可能にする半自動化画像解析パイプラインを開発しました。このプロトコルは、Fiji/ImageJプラットフォーム内のオープンソースの機械学習ベースのプラグインLabkitと3D画像処理ソフトウェア^16,17を活用しています。コアワークフローでは、ユーザーが代表的な画像のサブセットに注釈を付けてピクセル分類モデルを訓練し、それを実験的なTH染色データセットにバッチ処理し、その後^TH+領域に対する核スポットの作成と分類を行います。このアプローチは自動化と専門家の監督のバランスを取っており、完全な手動カウントの負担や変動を軽減しつつ、研究者の意見をアルゴリズムの導きや結果のレビューに残します。

本記事の目的は、実験内でのグループ対比較のために効率的なPAMクラスターDAニューロン相対定量化のためのステップバイステッププロトコルを研究者に提供することです。脳の解離、免疫蛍光染色、共焦点イメージングから、セミオート方式を用いた詳細な画像解析パイプラインまで、完全なワークフローを実演します。この重要な定量的ステップを標準化することで、本プロトコルは研究コミュニティが大規模なPAMクラスターを一貫して分析に組み込むことを可能にすることを目指しています。この半自動化方法はPAMクラスター専用に設計されており、他のドーパミン作動性クラスターや視葉のTH陽性ニューロンには適用できません。この手法は、PAMクラスターDAニューロン脆弱性のバッチレベルの研究や、シナプス可塑性、神経変性、 ショウジョウバエ モデルを用いた治療スクリーニングのさらなる研究を促進する可能性があります。

プロトコル

1. サンプル調製および共焦点イメージング

1. フライの管理と採取
   1. 目的の遺伝子型の親バエを交差させて実験的な子孫を生み出します。脱出後は、1瓶あたり20〜30匹のハエを集めます。ユーザーの実験設計に従って、望ましい実験年齢に達するまでフライを維持します。
2. 解剖準備
   1. 30mmのペトリ皿の蓋をシルガードのシリコーンエラストマーで半分の高さまで満たして解剖皿を準備します。皿にリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を1個入れます。1xPBSと4%パラホルマルデヒド(PFA)を含む固定剤450μLを0.6mLのマイクロ遠心分離チューブに取り込み、チューブを氷の上に置きます。
   2. 10〜20枚のフライを5〜10秒のCO₂パルスで麻酔し、その後すぐに氷の上に置かれた60mmペトリ皿に移し、動けなく保ちます。
      注意:PFAは有毒で発がん性の疑いがあります。手袋、白衣、安全ゴーグルを着用してフルームフードに入れて持ち手を。機関の有害物質ガイドラインに従って廃棄物を処分すること。
3. ハエ脳の解剖と固定
   1. ピンセットでハエの翅根を掴み、腹側を上にしてPBS入りの解剖皿に浸します。細い解剖ピンで胸を貫き、フライをシルガードパッドに固定します。
   2. 体の向きを水平に(例:頭は左、腹部は右)。片方の鉗子で口吻の根元を握り、もう一方の鉗子で全口吻を除去し、複眼の間に開口部を作ります。
   3. 露出した目の縁を2本の鉗子で掴み、非常にゆっくりと左右対称に引き離し、脳を露出させつつ腹側神経との接続を保つ。
   4. 気管嚢や脳を囲む脂肪体を取り除きます。脳を解放するために腹側神経索を切断し、脳が皿の前方を上に向けて安定できるようにします。
      注意:落ち着いた脳が腹側半分が背側半分より高い位置にある場合は(図1B、C)、鉗子を使って浮き上がった部分を優しく押さえます。
   5. P10ピペットの先端に0.1%のトリトンX-100をプリウェットして、剥離された脳が先端の内壁に付着するのを防ぎます。この事前に湿らせた先端を使って、各脳を固定剤入りチューブに移し、次の解剖に進みます。すべての脳を移植した後、チューブを5回逆さにして氷の上に横置き30分間置きます。チューブを室温(RT)で1時間、攪拌しながら孵化させます。
   6. 脳が底に沈むのを1分間待ちます。脳を1x1xPBSと0.1%トリトンX-100(PBST)を含む洗浄液で3回10分間攪拌して洗浄します。脳を0.1%アジドナトリウムを含むPBSに4°Cで保存するか、免疫染色に進みます。
4. 免疫染色
   1. 脳を1xPBS、0.1%トリトンX-100、5%ノーマルゴート血清、0.1%アジドナトリウム、ウサギ抗TH抗体(1:500希釈)を含む一次抗体染色液300μLに2日間、4°Cで攪拌して染色します。脳はPBSTで3回10分洗います。
   2. 脳を2回目に、1xPBS、0.1%トリトンX-100、5%ノーマルゴート血清、0.1%アジドナトリウム、抗ウサギ用Alexa Fluor 635を含む二次抗体溶液で4°Cで2日間染色します。 脳は一度PBSTで洗い流してください。
   3. 脳をPBSTで4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)(1:1,000希釈)を補充して2時間RTで培養し、その後PBSTで2時間洗浄します。脳は4°Cで一晩保存するか、マウントに進みます。
5. 取り付け
   1. 細かいゲージの針を装着した1mLのシリンジに0.5 mLのマウントタントを注入します。ガラススライドに透明な接着テープの平行な2本を貼り付け、3mmの隙間を残して取り付け室を作成します(図1A,D参照)。
      注意:鋭い針は刺す危険があります。常に注意して取り扱い、必要に応じて片手ですくい上げて再処理し、使用済みの針はすぐに認可された鋭利器容器に捨ててください。
   2. 切断したP200チップを使って、脳をきれいなペトリ皿に移します。脳周りの余分な液体を取り除き、10μLのマウントタントを脳に投与します。脳とマウントを優しく混ぜます。
   3. スライドの隙間に沿ってマウントを3滴垂らし、隙間に均等に広げます。P10ピペットで脳をギャップの中心線に沿って移し位置を整えます(図1A)。
   4. 脳は隙間の中心線に沿って均等に配置し、前方は上向きにします。隙間をカバースリップでゆっくりと覆いましょう。カバースリップの縁を親指で3秒押して、しっかりと接触するようにしてください。
   5. スライドをスライドフォルダーに水平に入れて、暗闇のRTで一晩硬化させ、その後4°Cで長期保存します。
6. 共焦点イメージング
   1. 共焦点顕微鏡システムの電源を入れて、レーザー安定化のために15分待機してください。脳を明るい視野に10倍の対物レンズで配置し、その後100倍の油浸入レンズに切り替え、ライブビューでPAMクラスターに移動します。
   2. ステージXYを調整して、イメージングセンター内の1つのPAMクラスターを特定します。Zをプレビューして境界線と方向を確認してください。デジタルズームと向きを調整し、PAMクラスターが斜めにイメージングフレームに収まるまで調整します。
   3. スタックの上下の位置を設定します。Zステップサイズを0.34μmに、画像解像度を512 x 512に設定します。ピンホールを オートモードに設定してください。ディスプレイルックアップテーブル(LUT)を 飽和インジケーターに設定してください。
   4. THチャネルのレーザー出力と検出器利得を調整し、PAMニューロン内の散乱した離散的な点が最小限に飽和するまで調整します。DAPIチャンネルの設定を調整して、飽和のない明るくクリアな核信号を得ます。
      注意:最適なズーム係数は変動します。組織の収縮度の違いは、実験バッチ間や同じバッチ内の個々の脳間で起こり得ます。
   5. 画像をRAW形式で取得し、入力フォルダに12ビットまたは16ビット(例:D:\Confocal\images)で保存します。ライブビューに戻り、ズームをリセットし、低い倍率に切り替えずに次の脳を探しながら隙間を移動します。
      注意:この段階では、主要なデータファイルを処理済み.tif形式に保存、エクスポート、変換しないでください。元の生メタデータを保存することは、その後の画像処理に不可欠です。

2. 画像処理と定量化

1. 画像ファイル変換とTHチャンネル分割
   1. 入力フォルダ内の生画像を、関連するファイルコンバーター(材料表)を使って3D画像解析ソフトウェアと互換性のあるフォーマットに変換します。変換済みファイルを 変換済みフォルダ に入れます(例:D:\Confocal\converted)
   2. フィジーを開いてファイル|へ移動してください。新しい|台本。スクリプトエディターで「ファイル|」をクリックします。マクロファイルImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm(補足ファイル1)を読み込むために開いてください。エディターウィンドウの下部近くにある「実行」をクリックしてください(ボタンが隠れている場合は小さな三角形のアイコンをクリックすると表示されます)。
   3. 設定ダイアログで「 Browse 」をクリックし、変換済みフォルダを選択します。 命名規則でオプション 3を選択してください。 エクスポートするチャンネルの中から、THに対応するチャンネルインデックスを選択してください。THチャンネルをバッチスプリットするには OK をクリックしてください。エクスポートされたTHスタックは自動的に ChannelSplitOutで終わるフォルダに保存されます。
2. Labkit分類器のトレーニング
   1. トレーニングデータセットの準備
      1. THスタックフォルダからサンプルの信号強度や背景変動を捉える代表的な20スタックを選びます。選択したファイルを選択フォルダ(例:D:\Confocal\selection)にコピーします。
      2. フィジーのマクロ ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (補足ファイル2)を実行してください。指示が出たら、トレーニング画像が入っているフォルダを選択します。マクロは各スタックを同じ数のZスライスにトリミングし、それらをタイムラプスのTIFFファイルに連結してトレーニングします。
   2. ピクセル分類器のインタラクティブトレーニング
      1. Fijiプラグイン経由でLabkitを起動 |Labkit |Labkit(材料表)で現在の画像を開いてください。ツールバーで3D Boxボタンをクリックすると、Zスライス(右側のスライダー)やサンプル間(下部のスライダー)を移動するためのスライスビューモードに切り替えます。
      2. Sキーを押して明るさとコントラストパネルを開き、最大スライダーを調整してTH⁺ニューロンを最適に表示してください。適切なブラシサイズ(例:5ピクセル)を設定します。設定をクリックしてツールパネルを展開してください。デフォルトの表示モード(フューズ、ソース、最接近)を維持してください。
      3. 「 ドロー」をクリックします。 ラベル付けパネルで 「背景 」をハイライトし、いくつかの非細胞領域に描画します。 前景 をハイライトし、いくつかの^TH+ ニューロンの内部に描画します。
      4. Ctrl + Shift + Scrollでフィールドのズームイン・ズームアウトを行ってください。垂直スライダーで他のZスライスに移動し、下部スライダーで他のトレーニングサンプルに移動します。しっかりとした分類器トレーニングを確保するために、何度もドローイングを繰り返してください。
      5. ピクセル分類をクリックしてください。トレーニング開始三角形をクリックするとトレーニングとレイジー予測を開始し、サンプル、スライス、位置を移動しながらリアルタイムのセグメンテーションフィードバック(右クリック・ドラッグ)をいつでも行えます。
      6. 予測が不正確な場合は「 描画 」をクリックして修正注釈を追加し、予測とラベルの可視性をソース パネルで切り替えて再学習できます。分類器がTH⁺ ニューロンとバックグラウンドを確実に区別できるまで反復し、その後 Segmentation | Labkitを閉じる前に分類器を保存してください。
3. バッチLabkitセグメンテーション
   1. フィジーの TH stackフォルダ からランダムな画像を開いてみてください。Labkitを起動し「 すべて削除」をクリックし、 Segmentation | 画像を分割するためにClassifierを開きます。分類器の一般化可能性を視覚的に確認して品質を確認し、ウィンドウを閉じます。
   2. 2.3.1を他のいくつかのランダムな画像にも繰り返します。最終点検以外は、すべての検査後にウィンドウを閉めてください。
   3. Labkitの出力フォルダ(例:D:\Confocal\LabkitOut)を作成します。バッチ処理をOthers>バッチセグメント画像から開始。Input DirectoryをTHスタックフォルダに設定し、Output DirectoryをLabkitのoutputフォルダに設定し、OKをクリックしてバッチ処理を開始します。
   4. 今後同じTH抗体と同等の共焦点設定を用いた実験では、2.2を飛ばして前の分類器を再利用してください。
      注:テスト目的で事前学習済みの分類器も提供しています(補足ファイル3)。
4. DAPIスポット生成とTH⁺ ニューロン定量化
   1. スクリプトフォルダ(例:D:\scripts)にXT_Jove_Labkit_TH.m(補足ファイル4)を配置します。3Dソフトウェアを開き、ファイル|へ移動します。設定を選んでからカスタムツールを選択します。XTensionフォルダパネルで「追加...」をクリックします。スクリプトフォルダを選択してOKをクリックします。
   2. 変換された各ファイルごとに、スクリプトは自動的に以下の逐次操作を実行します。
      注意:この説明セクションにはユーザー向けのアクションは含まれていませんが、次のステップに進むために不可欠です。
      1. DAPIチャネルは バックグラウンド・サブトラクション および ガウスフィルタ によって処理され、最適化されたDAPIスポット識別を促進します。
      2. Labkitのセグメンテーションマスクはノイズ除去と穴埋めによって改良され、データセットにマスクチャネルとして付加されます。洗練されたTH表面オブジェクトはマスクチャネルから構築されます。TH表面オブジェクトはさらに、マスクチャネルを上書きするための精緻なマスクを生成します。
      3. TH曲面から距離変換チャネルが作成され、表面内のボクセルは0に、表面外のボクセルは浮動小数点値で最寄りTH面までのユークリッド距離を割り当てます。
      4. 距離変換チャネル内の各DAPIスポットの強度プロファイルを^TH+ ニューロン識別の指標として用いてください。TH⁺ 領域内またはその近くにあるDAPIスポットは距離値が低いです。この基準は、Labkitが予測した不完全な前景領域のすぐ外側かつすぐ隣接する実際のDAニューロン核のような偽陰性を救うのに役立ちます。
   3. DAPIスポット作成のための 品質 の手動最適化
      1. 変換済みフォルダからランダムなサンプルを3Dソフトで開いてください。編集へナビゲーション |画像特性と座標パネルのボクセルサイズZが0.340μmかどうかを確認しましょう。もしなければ、手動で0.340μmに変更してください。
      2. 画像処理 |しきい値 |背景:減算。ダイアログでDAPIチャンネルのみをチェックし、フィルター幅を3に設定し、OKをクリックします。このステップをもう一度繰り返し、フィルター幅1で3回目の繰り返しを行います。
      3. 画像処理 | をクリックしてガウス平滑化を適用します |平滑化 |ガウスフィルター。 DAPIチャンネル だけをチェックし、 フィルター幅 を 0.2に設定し、 OKをクリックします。
      4. Surpass Sceneで「新しいスポットを追加」をクリックすると、スポット作成ウィザードが起動します。 DAPIチャンネルを選択し、推定XY直径1.2μmを入力してください。ウィザードに従い、「品質上」フィルターを追加し、閾値を微調整して各核に対して正確な単一のスポットを確実に得られるまで調整します。
      5. 複数のランダムに選ばれたサンプルでステップ2.4.3.1–2.4.3.4を繰り返し、サンプル間で確実に動作する閾値を設定します。
   4. テキストエディタでスクリプトXT_Jove_Labkit_TH.m(補足ファイル4)を開き、以下のユーザー定義パラメータを変更できます。
      1. ims_Folderを変換済みフォルダの経路に設定します。LabkitOut_FolderをLabkitの出力フォルダのパスに設定します。変換済みフォルダ内のすべてのファイルに対してCh_DAPIをDAPIチャンネルインデックスに設定します(例:DAPIが第一チャンネルなら1、DAPIが第二チャンネルなら2)。
      2. Set reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. 画像プロパティ でボクセルサイズが正しい場合(ステップ2.4.3.1参照)、答えは空白のかっこ書きのまま[]で締め付けてください。それ以外の場合は、変換 済みフォルダ内のすべてのファイルに適用される適切な値(例:0.130、0.130、0.340)を手動で入力してください。
   5. スポット作成の条件を最終決定します。
      1. SpotsParameterAssセル配列でパラメータの複数バージョンをカスタマイズし、各行が1つのバージョンを指定します。これには、各行の左側にDAPIスポット検出用の推定XY直径(μm)を定義し、各行の右側に基準フィルターで構成されるフィルターストリングを定義し、ステップ2.4.3.4の品質閾値や、ステップ2.4.2.2の洗練されたマスクチャネルの強度閾値、またはステップ2.4.2.3の距離変換チャネルの閾値を含みます。
      2. 「Intensity Center Ch=aSizeC+1」を0.5より上に設定し、2.4.2.2の精製THマスクチャンネル内に幾何学的中心が位置するスポットのみを保持します(ボクセル値は0.5>)。これはTH⁺ DAPIスポットフィルタリングにおける最も直接的かつ厳格な基準です。
      3. 「 Intensity Mean Ch=aSizeC+2」を[閾値]以下 に設定し、ステップ2.4.2.3の距離変換チャネルの平均強度が指定された閾値を下回るスポットを保持します。低い閾値はTH表面の内側または非常に近い位置を選びます。より高い閾値は、徐々に遠くに位置するスポットも含まれます。これにより、^TH+ 割り当ての許容される近接性を経験的に較正することが可能になります。
      4. 事前設定された例:
         SpotsParameterAss = {
         1.2、["質"94.5以上、"強度中心Ch=aサイズC+1""0.5'以上];
         1.2、["品質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2""0.0001'未満];
         1.2、["品質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2"が0.001'未満];
         1.2、["質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2""0.01'未満];
         ...スクリプトではさらに多くのフィルターの組み合わせが提供されています。
         };
      5. 今後同じTH抗体と共焦点設定を用いた実験では、前述のパラメータの組み合わせを再利用してください。実際の数値から大きく逸脱するスポットカウントの悪い組み合わせを削除し、不要な計算負荷を軽減します。
   6. バッチスポット作成
      1. 上記のすべての修正をスクリプトに保存してください。XT_Jove_Labkit_TH.m.。新しい3Dソフトウェアウィンドウを開きます。クリック メニュー 画像処理 | スクリプトをバッチで実行するPAM_TH_processing。
      2. 最初に数分間観察すると、各フィルターの組み合わせごとにスクリプトはパラメータを反映したSpotsオブジェクトを作成し、 変換されたフォルダ のファイルは処理されて「processed」という接尾辞の新しい出力フォルダにコピーとして保存されます。その後、パソコンを放置しておく。
      3. 完了後、スプレッドシートが作成されます。最初の列にはファイル名があり、その後の列には各フィルターの組み合わせに対応するDAPIスポット数が記載されており、列のヘッダーには 推定XY直径 と使用された フィルター文字列 が示されています。
   7. 後処理検証
      1. ステップ2.4.6が完了したら、「processed」フォルダからランダムに数ファイルずつ手動で開き、元のTHチャンネルと重ね合わせた異なるSpotsオブジェクトを調べます。目視検査に基づき、真の^TH+ ニューロン数を最も忠実に表現できる最適なフィルターを1つか2つ選びます。スプレッドシートから対応する列をエクスポートし、下流の統計分析や図の作成に使います。
      2. 好みのフィルターの組み合わせでスポットカウントの誤りを修正するには、Surpassシーンで対応するSpotsオブジェクトを選択し、「 編集 」タブをクリックしてください。 Shift キーを押して画面をクリックして、誤った部分を手動で削除したり、見落とした部分を追加したりできます。更新を「 Store as/export as/save as 」で保存し、「processed」フォルダ内の対応ファイルを同じファイル名で上書きしてください。
         注意:スポットオブジェクトを削除、追加、名前変更、ドラッグや位置変更はせず、推奨するスポットのみを編集してください。文字の修正は不要です。スクリプトを再度実行するだけで、手動の修正を反映した更新されたスプレッドシートが即座に生成されます。一貫性を保つために、編集を残さないか、実験内のすべてのサンプルで好むSpotsオブジェクトを編集してください。

結果

ソフトウェアから収集された生データは公開リポジトリに保存されており、以下のDOI(10.5281/zenodo.19814348)でアクセス可能です。この半自動化定量パイプラインの使用を実証するため、ヒトαシヌクレイン(nSyb-QF2>QUAS-SNCA)の汎神経発現を用いた確立されたショウジョウバエモデルに適用しました。制御フライはnSyb-QF2ドライバーのみを抱えていました。両遺伝子型は29°Cで3週間熟成させた後、脳を解離し、THの免疫染色、PAMクラスターの画像化を行いました。図3Eに示されているように、半自動化パイプラインはαシヌクレイン発現バエにおいて対照群と比較してPAM TH⁺ニューロン数の有意な減少を検出しました(Studentのt検定、p < 0.0001)。これは、同じ実験バッチ内で遺伝子型依存的な差異を捉えられることを示しました。以下のセクションでは、この定量化を可能にするマウント構成(図1)、Labkitトレーニングインターフェース(図2)、および画像処理ステップ(図3)について説明します。

図1は、解剖されたショウジョウバエの脳の増大する構成と、それがPAMクラスターイメージングに与える影響を示しています。解離後、切断された腹側神経索の隣接組織が時折曲げられたり傾いたりすることがあります。この脳腹側の持ち上げは、立体鏡下での視点を変え、背側輪郭の典型的な溝の投影が変化し、腹側のランドマークの相次元にも違いが生じます。(図1B、C)この変形は、脳が体から切り離された瞬間に起こることが多いです。このような変形は、取り付け時のPAMクラスターの向きに影響を与え、その結果、必要なZスタックの深さに影響を与えます(図1C,D)。最適な取り付け条件下では、単層スコッチテープスペーサーが脳中心領域に十分な圧縮を生み出し、背面に位置するPAMクラスターがカバースリップのすぐ隣で水平な位置を取る。この構成により、0.34μm間隔で15〜25枚のZスライスが生成されます(図1D)。もう一つの条件では、PAMクラスターは傾いた位置を保ち、より深いZスタックが必要となります(図1D)。同様に、二層テープスペーサーの使用は十分な圧縮を提供できず、PAMクラスターは本来の傾斜した構造のまま残り、同様にZスタックの深さが増加します(図1D)。図1Eは、最適位置および傾き条件の両方でTH染色されたZスタックの代表的な横投影図を示しています。

図2 はLabkitのユーザーインターフェースと代表的なトレーニングワークフローを示しています。単一のサンプルにわずかな走り書き注釈が付くだけで(図2A)、初期のピクセル分類器は非常に合理的なセグメンテーションをすでに生成しています(図2B)。しかし、このような最小限の注釈では、データセット全体にわたる堅牢で汎用可能な性能には不十分であることを強調することが重要です。^TH+ ニューロンを全データセットで確実に分割する分類器を生成するには、複数のZスライス、サンプル、染色バリエーションをまたぐ、はるかに反復的なラベリングが必要です。特筆すべきは、複数の訓練画像がZ軸に沿って積み重ねるのではなく、時間(フレーム)次元に沿って連結されていることです。この設計により、各脳体積の空間的整合性が保たれ、3Dフィルターの核が生物標本の内部でのみ動作するようになっています。もしサンプルを垂直に積み重ねて厚いZスタックにすると、隣接するサンプル間の境界にあるZスライスが空間的に連続し、異なる脳のボクセルが隣接する構造として扱われ、不要な手動修正のリスクが高まります(図2C)。時間軸に連結することで、このようなクロスサンプル汚染を避けつつ、単一のLabkitセッションで効率的なマルチサンプルトレーニングが可能になります。

図3は後処理パイプラインと最終定量を示しています。生のLabkit分割マスク(図3A)には多数の小さな偽陽性スペックルや内部穴が含まれています。形態学的ノイズ除去および穴埋め処理を適用した後(図3B)、平滑化されたTH面を構築し、精錬された二値マスクを生成します(図3C)。この改良によって得られた改善は、初期と最終マスクを比較したオーバーレイとして可視化されています(図3D、上部)。特に、THを豊富に含む神経突起領域が時折最終マスクに残されることがあります。しかし、これらの領域はほぼ例外なくDAPI染色核が存在せず、最終的なニューロン数にほとんど寄与しません。高度なユーザーは、提供されたバッチ処理スクリプトの形態パラメータをさらに調整し、残留アーティファクトの除去を微調整することができます。図3D(下)は最大強度投影からTHチャンネル(緑)に重ねられた最終DAPIスポット(マゼンタ)を示しています。図3Dはまた、当社のパイプラインで時折観察されるまれな偽陽性の一種を示しています。TH豊富なニューライト領域内に位置するDAPI染色核が、神経突シグナルが核と強く重なっている場合、誤ってTH⁺スポットと分類されることがあります。しかし、図3Cに示されているように、ニューライト付近のDAPI陽性核は一般的にまばらです。さらに、そのような神経突起領域の近くに存在するわずかなDAPI信号は、パイプラインによって誤認されないため、正しく真の負(すなわちTH⁺としてカウントされない)として正しく分類されることが多いです。図3Eはこの手法の実用的な有用性を示しています。生後3週間のnSyb-QF2>SNCAバエは、複数のフィルターでnSyb-QF2対照群と比較してPAM TH⁺ニューロン数が有意に減少しています(Student's t検定、p < 0.0001)。絶対スポットカウントはフィルターの組み合わせによって異なることがあり、この方法は完璧な単一スポット精度を達成できませんが、実験群と対照群の相対的な差は依然として強固です。複数のフィルターをテストした場合、グループ比較の統計結果は同一実験バッチ内のフィルター間でほぼ保持されます。したがって、出力は誤りのないPAMニューロンの絶対カウントではなく、バッチ内の比較読み出しとして解釈されるべきです。

図1。ショウジョウバエの脳解離と取り付け配置。(A) 脳搭載アセンブリの回路図。黄色いバーはスコッチテープのスペーサーを表しています。拡大した脳の図はPAMクラスター(紫色)のおおよその位置を示しています。 (B) Aの破線面に対応する横断面図で、解剖後の脳の2つの共通形態、最適位置(上)と傾いた(下)を描写。(C)立体鏡で観察した2匹のハエの脳:最適位置(左)と傾いた(右)。黄色い矢印は背側の輪郭に沿った典型的な溝を示しています。青い線は、腹側の左右にある2つの対応するランドマークをつなげています。青い矢印は、これらの腹側のランドマークの相対的な遠近感の変化を強調しています。スケールバー = 500μm(D) 脳の形態やテープスペーサーの厚さ(単層か二層か)がPAMクラスターの垂直位置、そしてそれに伴うZスタック深度にどのように影響するかを示す概説図。 (E) 最適位置(上部)および変形(下部)取り付け条件からのTH染色共焦点Zスタックの代表的な横方向図(Y投影)。スケールバー=5μm。略称:PAM=前脳前内側。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2。Labkitのトレーニングとインタラクティブなセグメンテーション。(A) Labkit グラフィカルユーザーインターフェース。注釈(落書き)は前景(赤)と背景(青)の2つのクラスで表示されます。 (B) Aに示された走り書きの訓練直後に生成されたセグメンテーション結果。赤は前景色を示します。青は背景色を示します。スケールバー=5μm。(C) 隣接するZスライス間のクロストーク。異なるハエの脳から採取した蛍光タンパク質標識ミトコンドリアの単一スライス画像をZ軸に沿って連結しました。スライス1とスライス3は同じ画像の同一コピーであり、スライス2とスライス4は異なる脳から来ています。黄色い矢印、予測がスライス2からスライス1にまで及んでいます。緑の矢印、予測がスライス4からスライス3にまで及んでいます。スケールバー=3μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3。Labkit分割マスクおよびTH⁺ニューロン定量の後処理。(A) Raw Labkitのバイナリマスク(シアン、上部)と元のTHチャンネル(下部)を重ね合わせる。小さな斑点が多く、神経細胞体の充填が不完全であることに注目してください。 (B) 形態学的ノイズ除去と穴埋め(マゼンタ、上部)後のマスク;THチャンネル(下部)で重ね合わせます。 (C) Bに対して滑らかにされたTH曲面から精錬された二値マスク(赤、上部)と再マスキング;THチャンネル(下部)で重ね合わせます。 (D) アッパー:生(シアン)と洗練された(赤)マスクの重ね合わせで、後処理で補正された領域を強調します。下部:THチャネル(緑)に重ねられた最終DAPIスポット(マゼンタ)を示す最大強度投影。右上隅の2つの斑点は対側のPAMクラスターから発生していることに注意してください。イラストにはフィルター4が使われました。 (E) 複数のフィルターの組み合わせを用いたパーキンソン病モデルにおける定量的検証。生後3週間のnSyb-QF2>SNCA(PDモデル)バエは、複数のフィルターでnSyb-QF2対照群と比較してPAM TH⁺ニューロン数の有意な減少を示しています(上)。生データはスプレッドシート(下部)で提供されています。フィルター1: 1.2、['"品質"94.5以上、"強度平均Ch=aSizeC+2""0.0001'未満];フィルター2: 1.2、['"品質"94.5'以上、「強度平均Ch=aサイズC+2」"0.001'未満];フィルター3: 1.2、['"品質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2""0.01'未満];フィルター4: 1.2、['""品質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2""0.05'未満]];フィルター5: 0.6、['""品質"94.5以上、"強度平均Ch=aSizeC+2""が0.001'未満];フィルター6: 0.6、['""品質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2""が0.01'未満];フィルター7:0.9、[""品質"94.5以上、"強度平均Ch=aサイズC+2""0.01'未満];n = 57脳(対照)、n = 65脳(PD);学生のt検定、p < 0.0001(****)。ハエは29°Cで培養されました。 スケールバー=5μm(A–D)。データは平均標準標準±として示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

補足ファイル1。変換された画像ファイルからTHチャンネルを分割し、出力スタックを保存するためのFijiマクロ。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2。フィジーマクロは、Zスタックを共通のZスライス深度にトリミングし、Labkit分類器トレーニング用のタイムラプスTIFFファイルに連結します。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル3。PAM THセグメンテーションワークフローのテストに使用される事前学習済みのLabkit分類器。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル4。Labkitマスクのバッチ処理、DAPIスポットの生成、フィルターの組み合わせ適用、TH⁺ ニューロンカウントのエクスポートのためのMATLABスクリプト。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ショウジョウバエPAMクラスターにおけるDAニューロンの定量化は、歴史的に非常に困難な課題でした。ここでは、機械学習に基づくピクセル分類と画像解析ソフトウェアを統合した半自動化ワークフローを紹介し、この長年の課題に取り組みます。この手法により、同一実験内のグループ間のPAMクラスター内の^TH+ニューロンの変異をバッチレベルで検出でき、パーキンソン病モデル¹⁸での比較研究を支援します。

特定の実験に最適なフィルターを選ぶ際、ユーザーは生画像の視覚的検査に最も合うフィルターを選ぶか、文献に記載されている野生型PAMニューロン数の範囲や平均を参照することができます(^12,13)。ただし注意が必要です。PAMクラスターカウントを報告した研究は2件だけで、いずれもPD関連ではなく、報告された値はかなりの不整合を示しています。さらに、標準偏差は年齢とともに増加することがあり、研究間比較をさらに複雑にします。したがって、文献に基づく参考はあくまで大まかな指針として使用すべきであり、絶対的な基準としては用いるべきではありません。このパイプラインでは誤りのない絶対カウントが得られないことは認識しています(図3D)。しかし、比較が同一実験バッチ内のグループに限定され(すなわち、異なるバッチ間のデータを1つのプロットにまとめない)、この手法はバッチ内の遺伝子型や処理条件間の相対的な違いを検出するために使用できます。

私たちの経験では、AF488結合の二次抗体は背景が多いため避けるべきであり、AF546はZ軸に沿った信号減衰が高いため避けるべきです。また、高度なDAPIインキュベーションと洗浄が、高い信号対雑音比とクリアな核信号の達成に不可欠であり、これが自動セグメンテーションの性能に直接影響することを発見しました。DAPIはヘクストよりも好まれており、ヘテロクロマチンを優先染色することでより明るく鮮明な核斑点を生成し、より正確な検出を可能にします。

よくある故障モードのトラブルシューティングについての議論

染色に関連した故障。解剖技術はデータの質を大きく左右する要素です。PAMクラスターは浅い位置にあり、この領域の背側にある2つの気管嚢と脂肪体を取り除くと簡単に損傷します。鉗子はPAM部位を刺したり圧迫したりしないように注意して扱うべきです。腹側変形はしばしば腹側神経索が切断された瞬間に起こり、ガラススライドに置かれた際に脳が傾いたり巻きついたりします。この変形はPFA培養後に恒久的に固定されることがあります。切断時に鉗子の角度を試して最適な方法を見つけることをお勧めします。解剖後に傾斜が観察された場合、高くなった部分に優しい圧力をかけることで変形が逆転することがあります(圧縮部分が関心の領域でない場合は許容範囲です)。

セグメンテーションの失敗。セグメンテーションの不十分なセグメンテーションは通常、学習データの多様性が不足していることから生じます。Labkit分類器は、バッチ内の染色品質の全範囲にわたる代表的な画像セット(最良、平均、最悪)で訓練されなければなりません。反復的修正では、自信のある偽陽性と偽陰性に注釈を優先してください。曖昧または不確かな領域を修正するのは避けてください。これは分類器を誤導し、性能を低下させる恐れがあります。

スポット検知の失敗。パラメータ最適化には、代表的なサンプルのごく一部を体系的に探求する必要があります。異なる推定スポット直径や品質フィルターの閾値、あるいはこのプロトコルで使われている「品質上」フィルターを超えるフィルタータイプをテストしてください。スポット作成ウィザードは様々なフィルタリングオプション(例:強度)を提供しています。ユーザーはフィルターの閾値やタイプを自分のデータセットに合わせて調整し、バッチ処理前に経験的調整を行うことが推奨されています。

なぜPAMクラスターニューロンの手動カウントは依然として非常に難しいのでしょうか?PAMクラスターは、従来の手動計数方法では不十分である独特の解剖学的および染色特性を示します。まず、 ショウジョウバエ のドーパミン作動性ニューロンの細胞質中のTH免疫蛍光は、大きく染色されていない核空洞を囲む薄い細胞質リングを主に標識します。その結果、DAPI染色された核と^TH+ 細胞質区画は空間的重複が最小限となります。この根本的な共局在の欠如は、「THマスク内のDAPIスポット」という直接的な分類戦略を排除しています。第二に、PAMクラスターは100個以上のニューロンが三次元でブドウのような構造で密集して配置されています。共焦点Zスタックを進むと、ニューロンは徐々に現れたり消えたりします。一部は平面に入り、他は出ていきます。これにより、高い認知負荷と観測者間での大きな変動が生じます。PAM DAニューロンを定量化した最新の研究は、ImageJの細胞計数プラグインを用いた手動カウントに依存していました。PPM1/2やPPL1のような小規模なクラスターには全く適していますが、特に数十から数百サンプルを必要とする研究ではPAMクラスターに適用すると、非常に手間がかかります。

なぜLabkitのランダムフォレストアーキテクチャはTHニューロンのセグメンテーションに特に適しているのでしょうか?Labkitは、TH染色されたPAMクラスタ画像の特有の課題に非常に適したランダムフォレストベースのピクセル分類器を実装しています。このアルゴリズムは、ガウスのぼかし、ガウスの差分、ガウスの大きさ、ガウスのラプラシアン、ヘッセ固有値などの変換フィルターをカスケード的に適用し、各ピクセルに対して包括的な特徴ベクトルを計算します。これらはそれぞれシグマスケール(1, 2, 4, 8)で評価されます。この多スケール特徴抽出は、核内側と細胞外背景を区別するテクスチャー的およびエッジ的特徴を効果的に捉えます。重要なのは、ランダムフォレストはディープラーニング手法に比べて桁違いに少ない訓練データを必要とするため、ユーザーは20〜40枚程度の代表画像に対してまばらな走り書き注釈を付けて分類器を反復的に洗練できることです。各反復ごとにアンサンブルに新しい意思決定木が追加され、それらが集合的に各ピクセルの分類を投票で決定します。このプロセスは、染色やイメージング条件のバッチごとのばらつきを本質的に考慮しており、ショ ウジョウバエ の遺伝子交配や老化研究に内在する生物学的変動性を考慮すると、非常に重要な利点です。この手法を用いることで、αシヌクレイン発現型パーキンソン病モデルにおける^TH+ ニューロンの喪失を検出でき、遺伝子強化剤および抑制剤がPAMクラスターニューロン数に与える影響を実験バッチ内で比較できます。

重要なのは、訓練の目的でクロップスタックがZ軸に沿って積み重ねるのではなく、時間次元に沿って連結されていることです。この設計の選択は、最適な分類器訓練のために非常に重要です。Labkitの3Dピクセル分類は、連続するZスライスにまたがるボクセル情報を考慮し、PAMニューロンの形態を定義する薄い細胞質状THリングを正確に解読するために不可欠です。もし個々のサンプルを垂直に積み重ねて単一の超厚Zスタックにすると、隣接するサンプル間の境界にあるZスライスはスタック内で空間的に連続するようになります。したがって、異なる生物学的サンプルに属するボクセルは、同じ三次元体積内の隣接する構造として扱われます。インタラクティブトレーニング中、そのような境界付近に描かれた落書きは、異なる2つのサンプルから同時に特徴を誤って捉え、分類器を混乱させることがあります(図2B、 矢印)。さらに、あるサンプルから発信される偽陽性信号が隣接サンプルの体積に投影され、誤った修正的な走り書きが後続の訓練反復を通じて伝播し、生物学的に意味のないルールを符号化した決定木を生成する可能性があります。時間軸に沿ってサンプルを連結することで、各個別のボリュームの空間的整合性を保ち、3Dフィルターカーネルが生物学的標本の内部のみで動作できるようになりつつ、単一のLabkitセッションで効率的なマルチサンプルトレーニングが可能になります。

方法論的考慮と限界

いくつかの重要な注意点は議論に値します。まず、このプロトコルはPAMクラスターに特化して最適化されており、他のDAクラスター(例:PPM1/2/3、PPL1)や視葉のTH⁺ ニューロンには一般化できない場合があります。PAM領域は比較的DAPI密度が低いこと、核が三次元空間でよく分離されていることで、堅牢で明確なDAPIスポット検出を可能にします。対照的に、このワークフローはPPL1やPPM1/2など他のDAクラスターには容易に移行できません。これらの領域では、神経ライトがDAPI染色された非DA細胞の核と並置または重なりやすい傾向があります。これらの小さなクラスターにおけるDAニューロンのベースライン数が非常に少なく(しばしば10細胞未満)、わずかな誤分類でも比例的に大きな誤差が生じ、この手法はこのような用途では信頼性が低下します。第二に、TH免疫染色は神経線内の神経筋や軸索突起にも標識します。訓練中の補正注釈にもかかわらず、これらの繊維路は時折強いTH信号を発生させ、分類器によって前景と誤分類されることがあります。しかし、PAMクラスターのこれらの領域はほぼ例外なくDAPI染色された核が存在しません。したがって、PAMクラスターの神経質領域における偽陽性ボクセルは、最終的なニューロン数にほとんど寄与しません。第三に、Labkitのピクセル分類は有限近傍内の局所テクスチャ特徴に基づいて動作します(デフォルトのフィルターカーネルは約16×16ピクセルのウィンドウに応答します)。この設計は計算効率を確保し、リアルタイムのインタラクティブセグメンテーションを可能にしますが、分類器がグローバルな解剖学的文脈を活用できないことも意味します。そのため、訓練セットから大きく逸脱する稀なアーティファクトや染色の異常はケースバイケースのキュレーションが必要になることがあります。最後に、ここで説明するバッチ処理パイプラインは、LabkitのセグメンテーションとDAPIスポット検出および距離変換を統合し、複数の出力チャネルとフィルターの組み合わせを生成します。ユーザーは、このプロトコルで提示されたデフォルトの閾値を無批判に採用するのではなく、自分の特定の実験条件に最適なフィルターパラメータを体系的に検証すべきです。

今後の応用

ここで示したPDモデルに加え、この半自動化パイプラインは、学習や記憶、動機付け、睡眠調整、加年神経変性に関する研究を含む、PAMクラスターDAニューロン定量を含むあらゆる ショウジョウバエ モデルに直接適用可能です。具体的には、この方法のバッチ処理能力により、以下に適している可能性があります:(1) 中〜高スループットの薬物スクリーニング:複数の神経保護化合物を用量で試験することが、手作業のカウント作業が比例して増加することなくより実現可能になります。(2) 遺伝修飾因子スクリーニング:数百の遺伝子交配(例:RNAi系統、過剰発現線)におけるPAMニューロン数を定量化し、αシヌクレイン毒性の増強剤または抑制因子を特定すること。(3) 縦断的加齢研究:複数の時間点にわたるPAMニューロンの喪失を手作業で計数負担を軽減しながら追跡すること。さらに、LabkitベースのセグメンテーションワークフローはTH染色に限定されません。適切な再訓練により、PAMクラスターと共通する2つの重要な特徴、すなわちDAPI染色核の密度が比較的低く、神経突起染色による干渉が最小限であれば、ショ ウジョウバエ 脳内の他の神経集団の定量化にも適応可能です。Labkitとここで使用されている3Dソフトウェアを超えて、このパイプラインの全体的なロジック――機械学習に基づくピクセル分類、その後のスポット検出および距離変換――は、他の対応する3D画像解析プラットフォームでも実装可能であり、より広範な研究コミュニティにとってアクセスしやすさと柔軟性を高めています。

まとめると、PAMクラスターのTH⁺ニューロン数におけるグループ差異を検出するための半自動化ワークフローを提示します。Labkitベースのピクセル分類とスポット検出および距離変換を組み合わせることで、同じバッチ内で実験群と対照群間のTH⁺ニューロン数を比較でき、サンプル数が増えるにつれて手作業によるカウントの負担を軽減します。数十サンプルから数百サンプルにスケールすると計算時間は比例して増加しますが、追加の手作業は主にファイルの整理や質の高いスポットチェックに限られています。PAMクラスターはこれまでPD研究でほとんど注目されていませんが、これは生物学的無関係というよりも技術的な制約によるものです。実用的な定量化ツールを提供することで、当プロトコルは将来的にPDモデルにおけるPAMニューロンの退化の有無およびどのように変性するかの調査を促進し、嗅覚欠損や動機付け低下などの非運動症状への潜在的な寄与の可能性を探ることを目指します。本プロトコルは、ショ ウジョウバエ モデルシステムにおけるドーパミン作動性神経変性、シナプス可塑性、神経保護薬スクリーニングのバッチレベルの比較研究を促進すると期待しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3D画像処理ソフトウェア - Bitplane Imaris 8.0+	オックスフォード・インストゥルメンツ	http://www.bitplane.com/	本研究で使用された3D画像解析ソフトウェア
4'6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	600605
ドウシル・シルガード 184	タット・リー・エンジニアリング株式会社	https://www.tatlee.com.sg/
デュモントピンセット スティプル 3C デュモクセル、0.04/0.08 mm	電子顕微鏡科学	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 共焦点	オリンポス	https://www.olympus-global.com/
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa fluor 647	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A-21244
ImageJ/フィジー(1.53q)	フィジー/イメージJ	https://imagej.net/software/fiji/
ラボキット	フィジー/イメージJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
ミニュティアンピン、ステンレス鋼、直径0.15mm	アウステルリッツ	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
通常のヤギ血清、凍乾燥固体	シグマ・オルドリッチ	566380
数値計算ソフトウェア - Python	パイソン	3.8+
数値計算ソフトウェア - Matlab	数学	R2016a+	本研究で使用される数値計算ソフトウェア
オクチルフェノール・エトキシレート(Triton X-100)	バイオラッド	1610407
PBS中のパラホルムアルデヒド溶液4%	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC-281692
ポリスチレン細胞培養皿	ネスト・サイエンティフィック	706001
プロロング ゴールド アンチフェイド マウント	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	P36934
ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)	ペルフリーズ	P40101-0
アジ化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S2002
ステレオスコープ	オリンポス	SZ51
ステリカン・アインマルカン、レン 27 G グラウ 0.40 x 12 mm	ステリカン	D-34209
注射器、1 mL	照も	DVR-5175
透明接着テープ	3Mスコッチ600、クリア	600