レニン—アンジオテンシン系関連候補バイオマーカーのトランスクリプトム同定および高血圧診断モデルの外部検査

サマリー

公開された血液トランスクリプトームデータセットを用いて、本研究は高血圧の候補であるレニン-アンジオテンシン系(RAS)関連バイオマーカーを特定しました。バイオインフォマティクスと機械学習により、独立した血液ベースのコホートで8つの遺伝子署名が検出され、RASのトランスクリプトム変化が免疫および炎症の署名と関連していることが明らかになり、さらなる検証が必要となりました。

要約

本研究は、高血圧に関連するレニン-アンジオテンシン系(RAS)関連の候補血液トランスクリプトミックバイオマーカーの特定、外部検証による候補診断モデルの構築、およびAng II誘導内皮細胞モデルにおける選択遺伝子の検証を目的としました。公開されたマイクロアレイデータセット、GSE75360とGSE74144が解析されました。リマを用いた差分発現解析、その後GO/KEGG濃縮、プレランクされたGSEA、CIBERSORT免疫浸透解析、タンパク質間相互作用および調節ネットワーク構築、そしてロジスティック回帰およびランダムフォレストを用いた機械学習ベースの特徴選択が行われました。選定された遺伝子に基づくロジスティック回帰モデルはGSE75360年に開発され、GSE74144年に外部で検証されました。実験的検証は、qRT-PCR、ウェスタンブロッティング、ELISA、CST3/FURIN機能喪失および増強アッセイを用いたAng II誘導HUVECsで行われ、その後CCK-8、Transwell、炎症性、酸化ストレス、内皮機能解析が行われました。GSE75360 年には173の差異発現遺伝子が同定され、そのうち18はRAS関連の差異発現遺伝子でした。LRP1、CTSD、MTHFR、AUTS2、FURIN、CST3、FCER1G、TBXAS1の8つの候補遺伝子が、機械学習分析を組み合わせて選定されました。濃縮および免疫浸潤解析により、これらの遺伝子は主に免疫および炎症のシグネチャーに関連していることが示されました。8遺伝子モデルはGSE75360で高い識別力を示し、GSE74144でも中程度の性能を維持しました。Ang II処理HUVECでは、ほとんどの候補遺伝子がmRNAレベルでアップレギュレーションされ、CST3、FURIN、TBXAS1はタンパク質レベルでさらに検証されました。CST3およびFURINの調節は、Ang II誘発性の内皮生存率、移動、炎症性・癒着マーカーの発現、ROS蓄積、およびeNOS/NO関連の機能指標を変化させました。 本研究では、高血圧におけるRAS関連バイオマーカーおよび免疫関連シグネチャー候補を特定し、外部で検証された候補診断モデルを開発しました。in vitroの所見は、Ang II誘導内皮反応におけるCST3およびFurinの機能的関連性を支持し、さらなる臨床的および機構的検証を支持しています。

概要

本研究は世界的に有病している慢性心血管疾患である高血圧に焦点を当て^{ています。}高血圧は心血管や脳血管の出来事、さらには腎障害を含む深刻な健康合併症のリスクを大幅に増加させます。これは患者の生活の質と長寿に重大な脅威をもたらし、社会的・経済的負担も大きい^2,3。現在、高血圧の診断と治療は主に血圧のモニタリングと降圧薬に依存しています。しかし、高血圧の原因が複雑かつ多様であるため、多くの患者は現在の治療に十分に反応せず、分子情報を得た層化^{も限られています4,5}。したがって、高血圧に関連する候補バイオマーカーやトランスクリプトミック署名を特定する必要があり、血液ベースの所見を組織レベルの決定的なメカニズムとして過剰に解釈することを避ける必要があります。

近年、レニン-アンジオテンシン系(RAS)は高血圧の発症機序と進行において大きな注目を集め^{ています。}既存の研究では、RAS関連遺伝子の異常発現が血圧調節障害や標的臓器損傷と密接に関連していることが示されていますが、正確な分子ネットワークや主要な調節因子は完全には解明^{されていません。}高血圧は血管、免疫、炎症の調節障害としてますます認識されているため、末梢血の単核細胞や白血球は、RASに関連する全身性転写体変異を捉える可能性のあるアクセス可能な代替組織を提供します。本研究では、RAS関連遺伝子セットをGeneCardsおよびPubMedの検索から選別し、標準的なRAS経路遺伝子と文献でRASシグナル伝達に機能的関連があると報告された遺伝子の両方を含みました。

本研究は、バイオインフォマティクスおよび機械学習手法を用いてトランスクリプトム解析を行う2つの公開マイクロアレイデータセット(GSE75360およびGSE74144)を用いています。具体的な手法には、リマ差異解析、GO/KEGG/GSEA濃縮解析、CIBERSORT免疫浸透解析、PPIネットワーク構築、機械学習を用いたキー遺伝子選択およびロジスティック回帰診断モデルの構築・評価が含まれます。これらの手法の利点は、大規模なトランスクリプトミクスデータを解析し、データセットをまたいで外部から結果を検証し、候補モデル構築のための補完的な分析手法を統合できる点にあります。私たちは、血液細胞トランスクリプトミックプロファイルが高血圧および関連する免疫シグネチャーに関連する候補RAS関連バイオマーカーを同定できると仮説を立てました。したがって、私たちの目的は、決定的な分子メカニズムや臨床的に準備可能な精密診断ツールを確立するのではなく、RAS関連遺伝子候補を特定し、その機能的文脈を特徴づけ、外部で検証された候補診断モデルを構築することでした。

プロトコル

解析ワークフローの概要

本研究のトランスクリプトミクスおよび機械学習に基づく分析の全体設計は 図1に示されており、主要なステップを含んでいます:レニン-アンジオテンシン系関連遺伝子(RASRGs)の収集;高血圧データセットからのRAS関連差異発現遺伝子(RASRDEGs)のスクリーニング;機能的濃縮分析(GO/KEGG/GSEA);免疫浸透解析(CIBERSORT);タンパク質間相互作用(PPI)および調節ネットワークの構築、機械学習に基づく鍵遺伝子選択(ロジスティック回帰、ランダムフォレスト[RF]);および高血圧診断モデルの評価。本研究で使用されるソフトウェア、データベース、オンラインツールの完全なリストは 、材料表に掲載されています。

データダウンロード

高血圧データセットGSE75360⁸およびGSE74144(ホモ・サピエンス)は、GEOデータベース¹⁰のRパッケージGEOquery⁹を通じて取得されました。末梢血単核細胞から得られたGSE75360(プラットフォーム:GPL10558)には、高血圧10件と対照11件のサンプルが含まれていました。白血球から得られたGSE74144(プラットフォーム:GPL13497)には、14件の高血圧と8件の対照サンプルが含まれていました(表1)。タンパク質コードを持つRASRG(1,264)は、GeneCards¹¹(キーワード:「レニン-アンジオテンシン系」)およびPubMed(キーワード:「レニン-アンジオテンシン系」)^12,13によって最初に同定されました。これらのRASRGとGSE75360/GSE74144遺伝子の交差により、最終的なRASRGは1,159件生まれました¹⁴。これら2つのデータセットは異なるマイクロアレイプラットフォーム上で生成されたため、別々に処理されました。プローブ注釈は対応するGPLプラットフォームの注釈ファイルに従って行われ、下流解析には正規化された遺伝子発現行列が使用されました。ボックスプロットを用いて、正規化前後の表現分布を比較しました。

高血圧関連レニン-アンジオテンシン関連の差異発現遺伝子

GSE75360データセットのサンプルは高血圧群と対照群に分類されました。limmaソフトウェアは、2群間の差分遺伝子発現解析を行うために用いられました。^差分発現遺伝子(DEGs)は|logFC|>0.45、p値は0.05<。この差分解析の結果は、Rパッケージのggplot2で生成された火山プロットによって可視化されました。

RASRDEGを得るために、上記の閾値(|logFC| > 0.45、p値< 0.05)を満たすDEGをRAS関連遺伝子(RASRGs)と照合し、交差結果をベン図で提示しました。その後、同定されたRASRDEGの発現パターンはRパッケージのヒートマップを用いてヒートマップとして可視化し、RASRDEGの染色体局在はRパッケージRCircos¹⁵で生成された染色体マップで示されました。

差異発現遺伝子検証およびROC曲線解析

グループ間プロットを作成し、GSE75360¹⁶における高血圧/対照群間のRASRDEG発現差異を分析し、RパッケージpROCを用いてROC曲線をプロットし、RASRDEGの診断効果に関するAUC(0.5–0.7:低精度、0.7–0.9:中等度、>0.9:高)を算出しました。

相関解析

スピアマンの相関解析はGSE75360におけるRASRDEG発現に対して行われました。結果はヒートマップ(Rパッケージggplot2)で可視化されました(|r| < 0.3:無相関/弱相関;0.3–0.5:弱相関;0.5–0.8:中等;>0.8:強い相関)。

GOおよびKEGGの濃縮解析

GO(Gene Ontology、2024年リリース、http://geneontology.org/ 年)は、生物学的プロセス(BP)、細胞構成要素(CC)、分子機能(MF)の3つの領域をカバーする、大規模な機能的強化のための広く使われているリソースです¹⁷。KEGG(京都遺伝子・ゲノム百科事典、Release 109.0, 2024年、https://www.genome.jp/kegg/ 年)は、ゲノム、バイオパスウェイ、疾患、薬剤に関するデータを保存^{しています。}

RASRDEGは、RパッケージclusterProfiler¹⁹を用いてGOアノテーションおよびKEGG経路濃縮解析を受けました。濃縮試験法:超幾何学的検定;多重試験補正法:ベンヤミニ・ホッホバーグ(BH)法。スクリーニング基準:調整p値<0.05。

遺伝子セット濃縮解析(GSEA)

コホートレベルのGSEAでは、差別発現解析で検査されたすべての遺伝子GSE75360 logFCで降順にランク付けされ、clusterProfiler¹⁹の入力遺伝子リストとして使用されました。GSEA以前はDEGの前ろ過は適用されていませんでした。MSigDB²⁰のc2遺伝子セットコレクション。パラメータ:シード=2022、1セットあたり10〜500個の遺伝子;スクリーニング基準:修正P < 0.05(ベンジャミニ・ホッホバーグ、BH法)、FDR < 0.25²¹.

高血圧診断モデルの構築

高血圧に関連する主要な遺伝子を特定するために、私たちはロジスティック回帰とランダムフォレスト(RF)という2種類の機械学習アルゴリズムを用いました。ロジスティック回帰(二値従属変数:高血圧/対照群)でp<0.05のRASRDEGをスクリーニングしました。ランダムフォレスト(RF、R パッケージ randomForest):パラメータ set.seed(520), ntree = 1000;MeanDecreaseGini(変数重要度指標)を抽出し、上位15のRASRDEGを選定しました。RASRDEGは標準としてp値0.05<スクリーニングされました。

RF(ランダムフォレスト)アルゴリズムは、バギングカテゴリ(多重決定木の積分)に属するアンサンブル学習手法で、RパッケージrandomForest²² (パラメータ:set.seed(520)、ntree=1000)を通じて適用されました。特徴遺伝子のMeanDecreaseGini(ノード分割時の平均純度低下による変数重要度を反映)を抽出し、上位15のRASRDEGを選定しました。最後に、ロジスティック回帰とRFでスクリーニングされた遺伝子のベン図を作成し、高血圧関連の主要遺伝子を特定しました。

高血圧診断モデルの検証

主要な遺伝子に基づいてロジスティック回帰モデルを構築しました。線形予測値(η)は次のように計算されました。

RパッケージpROC¹⁶ を用いてROC曲線をプロットし、高血圧リスク予測におけるモデルの有効性を評価しました。Rパッケージrms²³ を通じて、各主要遺伝子のロジスティック回帰モデルへの寄与(主要遺伝子と高血圧リスクとの関連を反映)を可視化するノモグラムが構築されました。予測値と実際の高血圧確率の整合性を評価するために校正曲線を作成し、意思決定曲線解析(DCA、R パッケージ ggDCA²⁴)は、モデルの臨床的有用性(純利益)を評価するために実施されました。GSE75360および GSE74144

単一遺伝子GSEA

GSEAは、特定の遺伝子に関連する遺伝子が生物学的プロセス・経路・疾患に果たす役割を、その発現を解析することで、その遺伝子の機能的役割の理解を助けます。GSE75360の各焦点遺伝子について、サンプルは中央値で高発現群と低発現群に分割されました。その後、すべての検査遺伝子で差異発現解析を行い、clusterProfiler¹⁹を用いてGSEA前にゲノム全体のlogFC値を高いから低い順にランク付けしました。GSEA以前はDEGの前ろ過は適用されていませんでした。パラメータ:seed = 2020、1セットあたり10〜500遺伝子(MSigDB²¹からのc2遺伝子セットコレクション)。スクリーニング基準:p < 0.05(bh法で補正したp)。

免疫浸透解析(CIBERSORT)

CIBERSORTアルゴリズム²⁵ (線形支持ベクター回帰に基づく)は、トランススクリプトームマトリックスをデコンボリュート化し、混合サンプルの免疫細胞組成を推定しました(免疫細胞濃縮スコア>0のデータを選択)。GSE75360の最終免疫細胞浸潤マトリックスは比率棒グラフで可視化されました。スピアマン相関は免疫細胞間および主要な遺伝子-免疫細胞の関連解析に用いられ、結果は相関ヒートマップ(R パッケージ pheatmap)と相関バブルプロット(R package ggplot2)として示されました。

タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク

PPIネットワークは、相互作用を通じて生物学的プロセスを調節する相互接続されたタンパク質のシステムです。STRINGデータベース²⁶を用いて、主要遺伝子のPPIネットワークを構築しました(最小相互作用スコア:0.150、信頼度は低い)。レニン-アンジオテンシン関連のハブ遺伝子は相互作用遺伝子のスクリーニングによって選択されました。GeneMANIAデータベース²⁷は、ゲノムおよびプロテオミクスのデータセットを用いて機能的に類似した遺伝子を特定し、主要なRAS遺伝子の機能的に類似した遺伝子を予測し、タンパク質相互作用ネットワークを構築するために利用されました。

規制ネットワークの構築

mRNA-TFネットワーク:転写因子(TFs)は標的遺伝子との転写後相互作用を通じて遺伝子発現を調節します。ハブ遺伝子とその調節関係を標的としたTFはChIPBase^{データベースから}取得され、mRNA-TFネットワークはCytoscape²⁹を用いて可視化されました。

mRNA-miRNAネットワーク:miRNAは複数の標的遺伝子を調節します(単一の標的は複数のmiRNAによって共調節されることがあります)。StarBase v3.0³⁰ はRASRDEGに関連するmiRNAの同定に用いられ、mRNA-miRNAネットワークはCytoscapeで可視化されました。

mRNA薬物ネットワーク:毒性ゲノミクスデータベース³¹ を用いてハブ遺伝子の直接的・間接的薬物標的を予測しました。mRNA薬物ネットワーク(遺伝子-薬物相互作用を示す)をサイトスケープで可視化し、ネットワーク構築を完了しました。

Ang II誘導HUVECモデル

ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)は、5%_CO2を含んだ加湿インキュベーターで37°Cで維持されました。細胞は供給者の指示に従い、胎児用牛血清と抗生物質を補足した完全な内皮細胞培養培地で維持されました。in vitro高血圧関連内皮損傷モデルを確立するために、HUVECsはアンジオテンシンII(Ang II;100 nM)で48時間治療されました。対照群として車両処理細胞が使用されました。

遺伝子介入実験では、CST3またはFURIN(si-CST3およびsi-FURIN)を標的とした小型干渉RNA(si-CST3およびsi-FURIN)、対応するネガティブコントロールsiRNA(si-NC)、CST3またはFurinの過発現プラスミド(oe-CST3およびoe-FURIN)、および対応する空ベクター対照群(oe-NC)を、製造元のプロトコルに従い市販のトランスフェクション試薬を用いてHUVECにトランスフェクトしました。トランスフェクション後、細胞はAng IIに曝露され、発現検証および機能的アッセイのために採取されました。qRT-PCRおよびウェスタンブロッティングによりノックダウンおよび過剰発現効率が確認されました。

qRT-PCR

標準RNA抽出試薬を用いてHUVECから総RNAを単離し、逆転写キットを用いて補完的なDNAを生成しました。qRT-PCRにはSYBRグリーン化学が用いられました。LRP1、CTSD、MTHFR、AUTS2、FURIN、CST3、FCER1G、TBXAS1、IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1、eNOSの発現レベルはGAPDHに正規化され、2^−ΔΔCt法で計算されました。

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロット解析では、RIPA溶解バッファーでタンパク質を抽出し、BCAアッセイで定量しました。同じ量のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に移しました。ブロッキング後、膜はCST3、FURIN、TBXAS1、またはGAPDHに対する一次抗体でインキュベートされ、その後適切な二次抗体で投与されました。バンドは化学発光法で検出され、密度測定はGAPDHに正規化されました。培養上清液中の分泌CST3は、製造元のプロトコルに従いELISAキットで定量化されました。

細胞生存率

細胞生存率はCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイを用いて評価されました。簡単に、トランスフェクトおよびAng II処理済みHUVECを96ウェルプレートにシードし、CCK-8試薬添加後0、24、48、72時間で450 nmでの吸収を測定しました。細胞移動はトランスウェルチャンバーを用いて評価されました。指示された介入の後、細胞は上部チャンバーにシードされ、下膜表面に移動した細胞は固定・染色され、ランダムに選ばれたフィールドで顕微鏡で数えられました。

炎症検査

炎症活性化、酸化ストレス、内皮機能を評価するために、IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1、 eNOSを対象としています。mRNAレベルはqRT-PCRで検出されました。培養上清液中の一酸化窒素(NO)レベルは市販のNOアッセイキットで測定され、製造元の指示に従いDCF蛍光法を用いて細胞内活性酸素(ROS)レベルを検出しました。

統計解析

Rではトランスクリプトミクス処理およびモデリングが行われ、連続変数の正常性はShapiro-Wilk検定で評価されました。2群比較では、正規分布変数には独立標本t検定が用いられ、非正規変数にはウィルコクソン順位和検定が用いられました。3群以上では、分散の正則性と均質性が満たされた場合、適切な事後検定を用いた分散の一方向解析が用いられました。それ以外の場合は、クラスカル・ウォリス検定が適用されました。CCK-8の時間経過データは分散の双方向解析を用いて解析されました。関連解析のためにスピアマン相関係係数を計算しました。特に明記がない限り、実験結果は平均標準差±示され、両側p<0.05は有意とみなされます。

結果

高血圧データセットのクリーニング

その後の解析の信頼性を確保するため、まずGSE75360およびGSE74144データセットにRパッケージLimmaを用いたプローブ注釈とデータ正規化が行われました。正規化前後の遺伝子発現値の分布は補 足ファイル1—補足図S1A-Dに示されており、オレンジは高血圧サンプル、青は対照サンプルを表しています。

GSE75360の場合:正規化前(補足ファイル1—補足図S1A)、高血圧および対照サンプルの発現値範囲に明らかな不一致が見られ、サンプル間の中央値および四分位分布が一貫せず、著しいバッチ効果や技術的ばらつきが示唆されていました。正規化後(補足ファイル1—補足図S1B)、すべてのサンプルの発現値分布は非常に一致しており、高血圧群と対照群の中央値および四分位数の範...

ディスカッション

高血圧は、RASの調節障害、免疫炎症活性化、血管損傷、内皮機能障害を含む複雑な心血管疾患です³²。本研究では、まず公開された血液トランスクリプトミックデータセットと機械学習手法を用いてRAS関連の候補バイオマーカーを特定し、外部で検証された候補診断モデルを構築しました。その後、これらのバイオインフォマティクスの成果をAng II誘導HUVECモデルでの実験的検証を通じて拡張しました。この複合戦略は、血液由来のRAS関連シグネチャーをAng II刺激下の内皮応答に結びつけることで、トランスクリプトム候補の生物学的妥当性を強化します。特に、追加の細胞実験により、トランスクリプトム解析および機械学習解析で特定された主要遺伝子が高血圧の内皮微小環境に応答するかどうか、また選択された遺伝子が内皮増殖、移動、炎症、酸化ストレス、内皮機能マーカーに影響を与えるかどうかを検証できました。

我々の分析では、高血圧と対照群のサンプル間で18のRASRDEGが特定されました。その後、2つの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル細胞培養プレート			CCK-8細胞生存率アッセイに使用
アンジオテンシンII（Ang II）			HUVECの内皮障害を誘導するために100 nMで48時間使用
抗生物質溶液			サプライヤーの指示に従って内皮細胞培養培地に添加
BCAタンパク質アッセイキット			ウェスタンブロッティング用にタンパク質濃度を測定するために使用
Cell Counting Kit-8（CCK-8）			HUVECの生存率/増殖を評価するために使用
化学発光検出試薬			ウェスタンブロットのタンパク質バンドを可視化するために使用
ChIPBase v2.0	Sun Lab / 研究資源	N/A	ハブ遺伝子の転写因子-ターゲット関係を取得するために使用するデータベース
CIBERSORT	スタンフォード大学 / Newman Lab	N/A	22種類の免疫細胞の存在量を推定するために使用される免疫細胞解析アルゴリズム
clusterProfiler（Rパッケージ）	Bioconductor	N/A	GO、KEGG、GSEA解析に使用されるRパッケージ
CO2細胞培養インキュベーター			HUVECを37℃、5% CO2で培養するために使用
Comparative Toxicogenomics Database（CTD）	NC州立大学 / マウントデザートアイランド生物学研究所	N/A	遺伝子-薬物相互作用を予測するために使用するデータベース
完全な内皮細胞培養培地			HUVEC培養に使用
インターネットアクセス可能なコンピューターワークステーション	任意の標準研究コンピューティングプラットフォーム	N/A	データダウンロード、前処理、統計解析、可視化に使用
CST3 ELISAキット			細胞培養上清中の分泌型CST3を検出するために使用
CST3過剰発現プラスミド（oe-CST3）			HUVECにおけるCST3の機能獲得実験に使用
Cytoscape	Cytoscapeコンソーシアム	N/A	mRNA-miRNA、mRNA-TF、mRNA-薬物調節ネットワークを可視化するために使用するソフトウェア
DCF蛍光プローブ/ROSアッセイレアジェント			細胞内ROSレベルを検出するために使用
空ベクターコントロールプラスミド（oe-NC）			過剰発現コントロールとして使用
胎児ウシ血清			内皮細胞培養培地に添加するサプリメント
FURIN過剰発現プラスミド（oe-FURIN）			HUVECにおけるFURINの機能獲得実験に使用
GeneCards	ワイツマン科学研究所	N/A	RAS関連遺伝子をキュレーションするために使用するデータベース
GeneMANIA	トロント大学	N/A	機能的に関連する遺伝子を特定するために使用するWebベースのツール
GEOデータベース	NCBI	N/A	GSE75360およびGSE74144データセットにアクセスするために使用する公開データベース
GEOquery（Rパッケージ）	Bioconductor	N/A	GEOデータセットをダウンロードするために使用するRパッケージ
ggDCA（Rパッケージ）	著者によって使用されるCRAN / GitHubソース	N/A	決定曲線解析に使用されるRパッケージ
ggplot2（Rパッケージ）	CRAN	N/A	データ可視化に使用されるRパッケージ
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）			Ang II誘導された内皮障害実験に使用される細胞モデル
limma（Rパッケージ）	Bioconductor	N/A	正規化および差異発現解析に使用されるRパッケージ
MSigDB	ブロード研究所	N/A	GSEAに使用される遺伝子セットデータベース
ネガティブコントロールsiRNA（si-NC）			ノックダウンコントロールとして使用
一酸化窒素アッセイキット			培養上清中のNOレベルを測定するために使用
pheatmap（Rパッケージ）	CRAN	N/A	ヒートマップを生成するために使用するRパッケージ
CST3に対する一次抗体			ウェスタンブロッティングに使用
FURINに対する一次抗体			ウェスタンブロッティングに使用
GAPDHに対する一次抗体			ウェスタンブロットのローディングコントロールとして使用
TBXAS1に対する一次抗体			ウェスタンブロッティングに使用
pROC（Rパッケージ）	CRAN	N/A	ROC曲線を生成し、AUCを計算するために使用するRパッケージ
PubMed	米国国立医学図書館	N/A	RAS関連遺伝子のキュレーションを補完するために使用する文献データベース
PVDF膜			ウェスタンブロットタンパク質転移に使用
qRT-PCRプライマー			候補遺伝子と炎症/内皮マーカーを検出するために使用
Rソフトウェア	R財団統計計算	N/A	すべての解析に使用される統計計算環境
randomForest（Rパッケージ）	CRAN	N/A	ランダムフォレストによる特徴選択に使用されるRパッケージ
RCircos（Rパッケージ）	CRAN / Bioconductor関連リソース	N/A	RASRDEGの染色体局在を可視化するために使用するRパッケージ
逆転写キット			補完的DNAを合成するために使用
RIPA溶解バッファー			総タンパク質抽出に使用
rms（Rパッケージ）	CRAN	N/A	ノモグラムを構築するために使用するRパッケージ
RNA抽出試薬			HUVECから総RNAを抽出するために使用
二次抗体			ウェスタンブロッティングに使用
CST3をターゲットとするsiRNA（si-CST3）			CST3ノックダウン実験に使用
FURINをターゲットとするsiRNA（si-FURIN）			FURINノックダウン実験に使用
starBase v3.0	Sun Lab / 研究資源	N/A	miRNA-ターゲット相互作用を特定するために使用するデータベース
STRING	STRINGコンソーシアム	N/A	タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークを構築するために使用するデータベース
SYBR Green qPCR試薬			qRT-PCR検出に使用
トランスフェクション試薬			siRNAと過剰発現プラスミドをHUVECに導入するために使用
トランスウェルチャンバー			HUVEC移動アッセイに使用