プロトペリテシア発生を用いた Neurospora crassa の光周期応答を定量化するためのプレートイメージングアッセイ

サマリー

プロトペリテシアアッセイは、定義された明暗サイクル下でのプロトペリテシア形成を測定することで、 Neurospora crassa における光周期的応答を定量化します。このプレートベースの手法は、実験条件を超えた光周期依存の発生反応を比較するためのシンプルかつ拡張可能なアプローチを提供します。

要約

Neurospora crassa は、生物学的タイミングや光制御発生の研究に確立されたモデル生物です。 プロトペリテシアアッセイ(PPA)は、プロトペリテシアの形成を発生的出力として測定することで光周期的応答を定量化するためのプレートベースのイメージング手法です。このプロトコルの目的は、明確な明暗サイクルが真菌の有性発生にどのように影響するかを評価するための再現可能かつ拡張可能なワークフローを提供することです。このアッセイでは、合成交差培地上で制御された光周期条件下で菌類培養を行い、その後、表面分生子の標準化除去を行って可視化を改善します。原腹膜は手動画像に基づくカウントで定量化され、プレートごとの平均カウントは光周期条件を比較するために用いられます。従来の手法とは異なり、PPAは標準化された培養条件、制御された光周期曝露、象限ベースのイメージングを統合し、株間での再現性のある定量的比較を可能にします。このワークフローは基本的なプロトコルを超え、定義された実験条件下で光周期依存の発生出力を測定するための一貫性があり拡張可能な枠組みを確立します。この方法は接種から分析まで約1週間かかり、特定の環境条件下で複数の株に適用可能です。PPAは、制御された実験室条件下で真菌の光周期依存発生の比較解析を簡単かつ利用しやすいプラットフォームを提供します。

概要

プロトペリテシアアッセイ(PPA)は、キノウスポラ・クラッサの光周期的応答を定量化します。多くの生物は昼夜の長さを測定し、生物学的プロセスを調整する現象として光周期現象(^{1,2,3,4,5,6,7,8})として知られています。このアッセイでは、女性の性構造であるプロトペリテシウムの発達が、光周期反応の測定可能な光依存の代理指標として機能します。光周期現象は夜間実験によって植物でよく特徴付けられ^{ていますが、}真菌のような非光合成真核生物における光周期応答を定量化する標準化された手法は少ないです。N. crassaは明確な遺伝学と光応答性の発生経路により、この目的に適したモデルシステムを提供します。光周期依存的な生殖タイミングの調節は、生物1,2,3,4,5,6,7,8で観察されており、光による生理的反応の関連性を支持しています。しかし、菌類における機構的研究は再現可能なアッセイの不足により制限されています。

プロトペリテシアは N. crassaにおける早期の雌性構造です。これらはアスコゴニアに由来し、アスコゴニアは螺旋状のトリコギンを発達させ、逆交配タイプ⁹の菌糸や分生子と融合します。融合後、「男性」パートナーの核がプロトペリテシウムに入ります。プロトペリシアの数は季節によって調整され、強い光誘発で¹⁰個です。光周期的調節は生態学、クロノバイオロジー、菌類生理学において中心的であり、多くの時計制御プロセスが光に依存しているためです。光は光受容体、キナーゼ、性の発達に関連する光伝達機構など、多くの遺伝経路に影響を与えます¹¹。プロトペリテシアは顕微鏡で容易に観察でき、光に敏感に反応するため、光周期的な出力の測定に適しています。

菌類における光周期性の重要性にもかかわらず、制御された光サイクル下でのプロトペリセシア産生を定量化する標準化かつ再現可能なアッセイはほとんど存在しません。中スループットのプレートベースアッセイは、菌類が安価で維持しやすいモデル生物であるため、光誘導の有性発生や遺伝子機能の体系的解析を可能にするため価値があります。光周期現象の研究の多くは植物に焦点を当ててきましたが、真菌系に関する同等の定量的枠組みは依然として限られています。昆虫を含む他の生物では、休眠などの光依存現象が^{よく特徴付けられ}ています7が、菌類では同様のアプローチが不足しています。このギャップは、ひずみや実験条件を超えた光周期応答の再現性比較を制限します。

PPAは、2004年の研究に基づいています。この研究は、帯(bd)変異体(ras-1^bd)において、日数が増加するにつれて持続的な暗闇から光まで、プロトペリテシア産生を測定したものです。この研究は概日^{リズム研究4,12}で使用されています。この背景下で、プロトペリテシア産生の光周期依存的な変化が観察されました。現在のワークフローは、全ゲノムシーケンシングおよびノック^{アウトリソースに関連する}参照株FGSC 2489を用いてこのアプローチを適応・拡張^{しています。}このアッセイは、1週間にわたり定義された光周期下で生成される原ペリテシアの平均数を定量化し、光周期反応の代理指標として用いています。このアプローチは培養条件、イメージング、定量を標準化し、実験条件や株間での再現可能な比較を可能にします。主な方法論的進歩には、標準化されたプレートベースの培養条件、定義された光周期曝露パラメータ、象限ベースのイメージング、再現性のある定量化ワークフローが含まれます。

このプロトコルは、N . crassa の光周期的応答を定量化し、明確な明暗サイクル曝露後のプロトペリテシア形成を測定します。各光周期条件に対して、4つの生物学的複製が用いられ、それぞれ独立に接種された合成交差(SC)プレートが1枚構成されます。1枚のプレートにつき4枚の画像が収集され、平均化されて生物学的複製ごとに単一の値を生成し、統計解析を行います。プレートは、較正された光周期(例:12時間12時間または8時間16時間の明暗サイクル)で7日間キュベートされます。

成長チャンバー内にデータロガーが設置され、光の強度、温度、湿度を継続的に記録することで、安定した環境条件を検証します。光強度は1,000ルクス以上に保たれますが、低レベルは原腹膜の産生を減少させます。チャンバー温度の上昇や熱的相互作用を防ぐため、過剰な照明は避けられます。培養後、マクロコニディアは70%エタノールを浸した湿ったペーパータオルで優しく取り出します。各プレートの周囲に均等に配置された4つの象限は、明視野照明下でステレオ顕微鏡を用いて40×倍率で画像化します。原腹膜は画像処理装置を使って手動で数えられ、プレートごとの平均数は光周期を横断した統計的比較に用いられます。

プロトコル

使用される試薬、ソフトウェア、機器は 材料表に記載されています。

1. 媒体および材料の準備

(推定時間:稼働時間1〜1.5時間;夜間冷却はオプション)

1. 合成交差(SC)媒体を準備します
   1. SC培地を準備:0.2%ショ糖、5μg/Lビオチン、1.5%寒天、およびウェスターガード塩(pH6.5、N1 NaOH)¹⁵。
   2. 培地をオートクレーブ消毒してください。注ぎやすい状態になるまで50〜55°Cまで冷ます。
      注意:フラスコをオートクレーブから取り出す際は耐熱性の手袋を使用してください。
2. 打倒板
   1. 使い捨てピペットを使って10mLの溶融培地を60mmペトリ皿にピペットします。
   2. 板を室温で30〜45分間固めます。
   3. 皿は逆さまに4°Cで最大4週間保存します。
      注:皿の水分補給を保ちましょう。プレートは4°Cで4週間以上保存しないでください。
3. 菌株を準備する
   1. 各株は、完全なまたは最小限の培地を含む小さなガラス試験管で培養し、検査マニュアル¹⁵に従って調製します。
   2. 管は30°Cの常時暗闇(DD)で培養し、管表面に菌糸体が見えるまで(通常2〜3日)培養します。
      注意: 真菌培養は標準的な微生物学的手法で取り扱い、バイオセーフティキャビネット内で作業して汚染を最小限に抑えましょう。

2. プレートの接種

(推定時間:1セットあたり15〜30分)

1. 転移菌分生子
   1. 各SCプレートを滅菌技術と接種ループで接種します。
   2. 均一な成長を確保するために分生子をプレートの中心に配置します(図1A)。分生子はコロニー表面を覆う粉状で明るい色の胞子として現れます。
   3. 約1〜2μLの濃縮円生子懸濁液(または同等のループ状)を適用し、プレート間の接種を標準化します。
2. 培養皿の準備をしてください
   1. ガス交換を許しながら汚染を防ぐためにプレートをしっかり閉じてください。
   2. 各プレートに株名、日付、光周期の状態をラベル付けしてください。

3. 光周期処理装置

(推定時間:セットアップ10分+潜伏7日間)

1. 成長チャンバーの校正
   1. チャンバー温度を25°Cに設定します。
   2. 湿度を50%(許容範囲:40%〜60%)に設定し、プレートの乾燥を防ぎます。
   3. 番組の光周期サイクル:EQ(春分点):12時間の光/12時間の暗い時間、SDP(短い日中):8時間の光/16時間の暗い時間
   4. プレートレベルで光の強度を、校正済みの露出計を使って>1,000ルクスに設定します。チャンバー温度が25°Cを超えるような強度は避けてください。
      注: チャンバーライトが室内を過熱させないように注意してください。
      注意:パラフィルムやビニール袋は湿度維持に使わないでください。これらはガス交換を制限し、真菌の成長を妨げます。湿度管理ができない場合は、チャンバー内に水の貯蔵庫を設置してください。
2. プレートをチャンバーに置いてください
   1. 皿を均等に棚に配置し、均一な光の露出を確保しましょう。
   2. チャンバー内にデータロガーを設置し、温度と湿度を継続的に監視し、安定した環境条件を検証します。
3. アッセイ開始
   1. プログラムされた光周期の下で7日間、妨害せずに培養します。

4. 画像診断用のプレートのモニタリングと準備

(推定時間:1枚あたり15〜20分)

1. チャンバーからプレートを取り外してください
   1. 7日間の孵化後にプレートを取り除きます。
   2. 分生子の成長や原腹皮膜の形成を検査してください。
2. 視認性のためのクリーンプレート
   1. 破ったペーパータオルを使って、プレート蓋と寒天表面から表面分生子を除去します(図1B)。
   2. 70%エタノールを1〜2mLでペーパータオルに湿らせます。分生盤を優しく3〜5回軽く叩き、分生虫を取り除きます。画像化前に1〜3分間自然乾燥させます(図1C)。
      注意: エタノールは可燃性であり、熱源からは避けましょう。
      注: 過度な圧力をかけないようにしましょう。タオルを寒天の表面に引きずらせないように注意してください。培地を損傷したり、原腹膜を乱す恐れがあります。

5. 原腹皮のイメージング

(推定時間:1枚あたり5分)

1. 画像診断の準備をしてください
   1. 照明と倍率が一定(通常40×)の顕微鏡を設置します。
   2. プレート表面が乾燥し、ゴミがないことを確認してください。
2. 画像をキャプチャ
   1. プレートの周囲に均等に配置された4つの象限を、一定の倍率でイメージしてください。
   2. 各画像にひずみ、光度条件、プレート番号、象限位置をラベル付けしてください。
   3. 画像は一貫した形式(例:TIFF)で保存し、分析用に行います。

6. 定量化とデータ分析

(推定時間:プレート1枚あたり10〜20分、分析に15〜25分)

1. プロトペリテキア伯爵
   1. 画像処理パッケージ内の各画像を開きます。
   2. Cell Counterプラグインを使って手動でプロトペリテシアを数えてください。バブル、エッジアーティファクト、曖昧な構造を除外します。クラスタリングされた原腹膜を個別の区別可能な単位として数えましょう。
   3. 各象限ごとに記録数を計算し、プレートごとの平均値を計算します。
2. データの分析
   1. 定量化されたデータを統計分析ソフトウェアにインポートします。
   2. 図2に示す比較に対してウェルチのt検定を用いた統計解析を行います。
   3. 光周期処理、ひずみ、または複製を比較するグラフを作成します。

結果

野生型株への接種後、分生子は36〜48時間以内にSC表面を覆いました。7日間の光周期曝露後、密な分生子層が形成され、70%エタノールを浸した湿らせたペーパータオルで除去されました(図1)。この工程により、その構造を破壊することなく、基礎の原腹膜が露出しました。顕微鏡下では、原腹膜は板面全体に広がる暗い円形構造として現れました。これらの構造は球状の形態を示し、周囲の菌糸と区別できました。プレート内では、原ペリテシアは一般的に均一な大きさを持ち、その分布は光周期の条件によって変化しました。春分点のような光周期下で成長した板は、密集した原腹膜の形成を示した一方、短日照条件下では構造数が少なかった。

ディスカッション

PPAの目的は、菌類の有性発生を指標として、生物が特定の光周期を知覚するかどうかを判断する指標として用いることです。異なる光サイクル下で生成されるプロトペリテシアの平均数を定量化することで、光周期的応答を評価・比較することができます。前述の観察^4,16と一致すると、N. crassaは春分点のような光周期下でプロトペリテシア産生が増加する一方、短日照条件下では構造数が少ない(図2)。このアッセイは、制御された実験室条件下で真菌モデルシステムにおける光周期依存の発生反応を調べる方法を提供します。菌類における光周期的応答は^{表現型として}よく記録^{されていますが、}機構的にはまだ定義が薄く、標準化されたアッセイもほとんど存在しないため^(4,18

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガー	BD	90000-786	合成交配培地/最小培地用
アルコールバーナーフレーム	Wards	470346-104	接種ループの滅菌用
アンモニウム鉄硫酸塩ヘキサハイドレート	Supelco	FX0245-1	合成交配培地/最小培地用
硝酸アンモニウム（NH4NO3）	BeanTown Chemical	BT134170-250G	最小培地用
オートクレーブ	VWR International	76683-456	ガラス器具と培地の滅菌用
生物安全キャビネット	ThermoFischer Scientific	1323TS	プレートとラボの汚染を減らすために
ビオチン	VWR	97061-444	合成交配培地用
ホウ酸（H3BO3）	Electron Microscopy Sciences	100503-696	合成交配培地/最小培地用
塩化カルシウム（CaCl2）	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	合成交配培地用
塩化カルシウム二水和物（CaCl2・2H2O）	Sigma-Aldrich	223506-25G	最小培地用
クエン酸一水和物（C6H8O7・H2O）	Sigma-Aldrich	1002440500	合成交配培地/最小培地用
硫酸銅五水和物（CuSO4・5H2O）	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	合成交配培地/最小培地用
エタノール	Decon Labs	71001-754	プレート表面のコニディアの除去と接種ループの滅菌用
FIJI/ImageJ	国立衛生研究所（NIH）	N/A	画像の分析/数え上げ用
手袋	SW Safety Solutions	76382-944	安全用
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	統計検定の実行と図の作成用
成長チャンバー	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	光周期サイクル用にプログラム可能
HOBOデータロガー	Onset Computer Corporation	MX2202	光強度と温度の記録用
接種ループ	VWR International	10806-354	真菌材料をペトリ皿に移す用
硫酸マグネシウムヘプタハイドレート（MgSO4・7H2O）	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	合成交配培地/最小培地用
硫酸マンガン一水和物（MnSO4・H2O）	Sigma-Aldrich	1059410250	合成交配培地/最小培地用
顕微鏡（Leica S6 D Greenough Stereo Microscope）	Leica Microsystems	10446297	イメージング用
Neurospora crassa FGSC 2489	真菌遺伝学株センター	74-OR23-1VA, JCM19069	真菌株
ペーパータオル	Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex	6666114	培地を注ぐ用
パーマネントマーカー	Sharpie	30072	プレートのラベル用
ペトリ皿	VWR International	25384-164	合成交配培地のプレート用
ピペット	VWR International	75816-090	培地を注ぐ用
二リン酸カリウム（KH2PO4）	BeanTown Chemical	BT225070-500G	合成交配培地/最小培地用
硝酸カリウム（KNO3）	Sigma-Aldrich	221295-100G	合成交配培地用
小さな使い捨てガラス試験管	VWR International	470211-698	初期の真菌株の成長用
塩化ナトリウム（NaCl）	VWR International	BDH9286-500G	合成交配培地用
クエン酸ナトリウム二水和物（Na3C6H5O7・2H2O）	VWR	97061-008	最小培地用
水酸化ナトリウム（NaOH）	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	合成交配培地用
モリブデン酸ナトリウム二水和物（Na2MoO4・2H2O）	Supelco	1.06524.1000	合成交配培地/最小培地用
シュクロス	VWR International	BDH9308-500G	合成交配培地/最小培地用
硫酸亜鉛七水和物（ZnSO4・7H2O）	BeanTown Chemical	BT122545-500G	合成交配培地/最小培地用