小児コホートにおけるタイプI干渉症における一般的な血管炎関連遺伝変異のクラス

サマリー

自己炎症性疾患が疑われる1,204人の小児患者を対象に全エクソームシーケンスを実施し、132件でインターフェロン症関連変異が確認され、そのうち79件は新規変異が認められました。ほとんどはヘテロ接合体で、血管炎表現型と関連していました。これらの発見は、遺伝子検査の診断的価値と、小児血管炎における調節不全型Iインターフェロンシグナル伝達の中心的役割を強調しています。

要約

小児血管炎は伝統的に組織病理学的評価によって診断されます。しかし、臨床現場ではより侵襲の少ない画像診断ベースのアプローチがますます用いられています。これらの進展にもかかわらず、基礎となる単一遺伝子病因の特定は、疾患メカニズムの理解、予後予測、標的治療戦略の指針となる上で依然として不可欠です。タイプIインターフェロン症は、構成性インターフェロンシグナル伝達と頻繁な血管炎または血管障害性症状を特徴とする、多様な免疫介在性疾患群を含みます。核酸感知経路の持続的な活性化と細胞内恒常性の障害は、内皮機能障害や慢性血管炎症に寄与します。

本研究は、小児自己炎症性疾患コホートにおける干渉症関連遺伝子の血管炎関連変異を検出するための包括的な遺伝学解析ワークフローを提示します。自己炎症性障害が疑われる1,204人の患者に対して全エクソームシーケンスが実施されました。コード領域やスプライス部位に影響を与える変異体は、アメリカ医学遺伝学・ゲノミクス学会のガイドラインに基づくバイオインフォマティクスパイプラインを用いて解析され、離散フーリエ変換(DFT)と統計分布に着想を得た統計フィルタリングおよび信号処理技術を統合して、バリアントの優先順位付けと解釈を改善しました。

リウマチクリニックのデータベースを通じて評価された132人の小児患者でインターフェロノパシー関連変異が確認されました。全体として、92件のユニークな変異株が検出され、そのうち13件は以前に報告された病原性または病原性の可能性のある変異株と、2026年2月時点で公開データベースに存在しない79件の新規変異株が含まれていました。臨床症状は主に再発性発熱、血管炎症状、複雑な自己炎症性症状を含みます。

変異体は、インターフェロンシグナル伝達の調節障害や自然免疫活性化に関連する遺伝子、STING活性化、核酸代謝、細胞内輸送機能障害に関連する経路を含むものでした。この学際的なワークフローは、小児血管炎におけるゲノム解析の診断的有用性を示すとともに、血管損傷や自己炎症性疾患の病因における持続的なインターフェロンシグナル伝達の重要性を強調しています。

概要

小児血管炎は伝統的に組織病理学的評価によって診断されており、これがゴールドスタンダードとなっています。しかし、近年の診断戦略は、特に画像診断に基づく手法など、より侵襲性の低いアプローチを重視する傾向が強まっています。これらの進展にもかかわらず、小児血管炎において基礎となる単一遺伝子病因の特定は極めて重要であり、疾患のメカニズム、予後、標的治療の可能性に関する重要な洞察を提供します^1,2。

全身性炎症や多臓器の関与を伴う小児の血管炎は疑われるべきです。診断を確定し、模倣者を除外するためには、徹底的な病歴聴取、包括的な身体検査、検査、画像検査、場合によっては組織生検も必要です。早期発見と治療は不可欠です。なぜなら、未治療の病気は生命を脅かす合併症や長期的な後遺症を引き起こす可能性があるからです^。

タイプIインターフェロン症は、持続的なタイプIインターフェロン経路の活性化と再発性血管炎または血管障害性の特徴を特徴とする多様な単遺伝子および複雑な免疫介在性障害を含みます^。3,4。核酸感知の調節不全と細胞内恒常性の障害は、持続的なインターフェロン過剰産生と血管炎症および損傷を結びつける中心的な病原メカニズムです。TMEM173における機能獲得変異(STING1)は乳児期に発症するSTING関連血管症(SAVI)を引き起こし、常染色体優性COPA変異は小胞体-ゴルジ体の輸送を妨害し、異常なSTING活性化と血管炎表現型^3-5を引き起こします。核酸代謝遺伝子(TREX1、RNASEH2A/B/C、SAMHD1、ADAR1、IFIH1)の欠陥による追加の干渉症は、インターフェロン調節異常と血管病理3との機論的関連をさらに強調^{しています(}図1参照)。

図1。小児コホートにおける内皮機能障害および微小血管損傷を引き起こすタイプI干渉症の詳細な病原構造。 (左)小児タイプI干渉症の全身的文脈:自己対非自己の識別能力の欠陥と異常な宿主核酸感知が全身性自己炎症を引き起こす。臨床表現型は、早期発症の皮膚血管症および全身性障害が特徴で、しばしばチルブライン様の皮膚病変として現れます。(中間)遺伝的欠陥のメカニズム的連鎖反応は全身性調節障害に及びます。核酸クリアランス酵素(例:DNASE1、TREX1)の機能喪失変異により、細胞質内に内因性DNAやRNAが異常に蓄積します。同時に、STING1のようなセンサーにおける機能獲得変異は、ウイルストリガーに依存しないcGAS-STING経路の本質的な活性化を引き起こします。この病原性細胞質内感知はインターフェロン調節因子を過剰活性化し、タイプIインターフェロン(IFN-α/β)の連続合成を引き起こします。慢性的なサイトカイン分泌はIFNAR1/2受容体を介して自己持続的な全身増幅ループを形成し、クリアランス機構の障害や正のフィードバックコントロールによって悪化します。(右)病理学的帰帰:循環中のIFN-α/βが内皮細胞受容体複合体に持続的に結合すると、持続的なJAK-STAT活性化が誘導されます。この恒常性の乱れは継続的な内皮ストレスを引き起こし、生理学的な血管弛緩機構を損なっています。毛細血管レベルでは、この高炎症状態が直接的な内皮細胞損傷、著しい血管壁肥厚、腔内微小血管血栓症を引き起こし、最終的には自己抗体介在の自己免疫経路を経ない重度の組織虚血および壊死性微小血管症を引き起こします。略称:cGAS-STING = インターフェロン遺伝子の環状GMP-AMPシンターゼ刺激因子;DNASE1 = デオキシリボヌクレアーゼ1;GoF = 関数の利得;IFN = インターフェロン;IFNAR = インターフェロンα/ベータ受容体;IRF = インターフェロン調節係数;JAK-STAT = Janusキナーゼシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子;STING1 = インターフェロン応答刺激因子 cGAMP インターラクター1;TREX1 = 3つのプライム修復エクソヌクレアーゼ1。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

この手法は、小児自己炎症性コホートにおける干渉症関連遺伝子変異の検出を目的としており、従来の方法は希少変異の早期優先順位付けに解析上の課題を抱える可能性があり、好中球の異質性が再^{発リスクの}予測に重要な役割を果たしているためです。文献では、小血管炎におけるインターフェロンシグナル伝達異常の役割が単細胞解析を通じて明らかにされており、小児コホートにおける早期診断における全エクソームシーケンシング(WES)の利点が強調^{されています6。}

単一性自己炎症症候群は血管炎や血管炎様の症状を示すことがあります。例えば、SAVIは小血管炎や中血管炎を模倣^{することができます。}同様に、若年特発性関節炎(JIA)は、成人期に至る可能性のある小児発症炎症性疾患の多様群であり、干渉症様の調節障害と関連していることから、小児コホートにおける遺伝解析の必要性が強調^{されています。}

タイプI干渉症は、宿主由来の核酸によって誘発される抗ウイルスセンサーの活性化を特徴とするメンデル流的先天性免疫異常であり、自己識別と非自己識別の失敗を示します^3,4。これらの疾患はタイプIインターフェロンシグナルのアップレギュレーションによって定義され、皮膚学的な症状はしばしば重要な診断手がかりを提供します。SAVIはTMEM173における機能獲得変異と関連し、早期発症の皮膚血管症および肺炎症を呈^します。p.V155M変異は最も頻繁に報告されている変異¹⁰です。SAVIはSTING1変異に関連する希少な自己炎症性疾患で、初期間質性肺疾患(ILD)および皮膚病変を特徴とし、臨床的に全身性エリテマトーデス(SLE)と類似する可能性があります¹¹。調節不全のタイプIインターフェロンシグナル伝達は、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎(AAV)にも関与していることが示唆されています。AAVでは、顕微鏡的多発血管炎/ミエペルペルオキシダーゼ-ANCA関連血管炎(MPA/MPO-AAV)においてタイプIインターフェロンシグネチャーが優勢であり、腎の予後と関連しており、稀な変異体がインターフェロン調節障害に寄与していることを示しています¹²。

単一性自己炎症症候群は血管炎や血管炎様の症状を示すことがあります。例えば、SAVIは小血管炎や中血管炎を模倣^{することができます。}これまでに、活性化STING1変異を持つ世界最大の患者コホートを記述し、SAVI¹³の臨床的および免疫学的表現型の拡大を提供しました。過去20年間で、造血細胞および非造血細胞の両方による病原体認識の理解において著しい進展が見られました。微生物成分は生殖細胞系符号受容体を通じて検出され、^{この反応を開始する}重要なステップです。2006年には、DNAをさまざまな細胞型にトランスフェクションすることで、Tll様受容体(TLR)に依存しない方法でタイプIインターフェロンのアップレギュレーションが誘導されることが示されました。この文脈で、2008年にSTINGという膜貫通タンパク質が、合成およびウイルスDNAへのタイプIインターフェロン応答の重要な媒介因子として同定^{されました。}STING1における機能獲得変異は、SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴として知られるタイプI干渉症を引き起こします。この重篤な疾患は、早期発症の全身炎症、皮膚血管症、間質性肺疾患(ILD)を特徴とします¹⁴。SAVIは稀で、これまでに37家族から52人の患者が報告されており、ほとんどの症例は新たに発症しますが、常染色体優性遺伝も記録されています。以前には、活性化STING1変異を持つ世界最大の患者コホートを記述し、SAVI ^9,10,11˒¹⁴の臨床的および免疫学的表現型の拡大を提供しました。

このプロトコルは、自己炎症特徴を示す小児患者において、WESベースの遺伝子解析を通じて干渉症関連遺伝子変異を早期に検出するために開発されました。従来の手法では希少な変異を特定するのに不十分であり、早期介入の機会を逃す可能性があるためです。文献は、血管炎様表現型におけるインターフェロンアップレギュレーションの役割がメンデル障害の研究を通じて明らかにされ、WESが希少変^異の検出に優れていることをさらに強調^{しています。}

この手法の主な目的は、物理に基づく信号処理原理と簡略化された生物物理学的計算モデルを統合し、タイプIインターフェロノパシエティのWESデータにおける変異検出を支援しつつ、特にJanusキナーゼシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子(JAK-STAT)カスケードへのインターフェロンシグナル伝達経路への下流的影響を解釈することです。この探求的アプローチは、配列決定ノイズや免疫介在性障害の不均一カバレッジに頻繁に影響されるゲノム領域の解析を補完することを目的としています。これらの領域では、調節不全のインターフェロン活性化が血管炎表現型を駆動します。標準的なバイオインフォマティクスのワークフローは通常、標準的な品質指標に焦点を当てており、STING1やTREX1のような遺伝子の複雑な領域で変異を特定する際には追加の補助的なフィルタリングの余地が残されることがあります。離散フーリエ変換(DFT)と統計分布に触発された信号処理技術を適用することで、この手法はヌクレオチド配列から基礎となるゲノム特徴を抽出し、塩基(A, T, C, G)を二値指標にマッピングし、突然変異^{パターン解析を行います}。さらに、インターフェロン経路の生物物理学的モデリングは、閾値挙動や累積シグナル増幅を取り入れ、遺伝的変異が内皮機能障害を維持する可能性を評価し、特にタイプIインターフェロン(IFN-α/β)信号伝達におけるJAK-STAT経路の役割に焦点を当てています。

この探索的応用は、低カバレッジ領域におけるアライメントプロファイルの研究を目的としていました。標準的な計算ツールが一次バリアントフィルトレーションを提供する一方で、サポートモデルはSNRベースの評価が、非一様なリード分布に影響を受けるコーディング単一塩基変異体(SNV)の二次的な定性的ゲートを提供できるかどうかを調査します。この物理ベースのアプローチは、SNR最適化を用いて遺伝子型の質やマイナーリード比率を評価します。より広範な文献では、同様の確率モデルにより、全か無かの動態ではなくJAK-STAT経路における段階的な応答が明らかになり、インターフェロン過剰産生のより良い予測が可能になりました¹⁶。タイプIインターフェロン(IFN)がIFNAR1/IFNAR2受容体に結合することで活性化されるJAK-STAT経路は、ジャヌスキナーゼ(JAK1、TYK2)がSTAT1およびSTAT2をリン酸化し、IRF9と共にISGF3複合体を形成し、核転座およびISG転写^{を行います。}これはIFN β帰納法に対して常微分方程式(ODE)を用いてモデル化できます。

ここで、挙げたパラメータはリン酸化速度、脱リン酸化、SOCS1による負のフィードバックを表し、しきい値依存増幅を強調します^。さらに、IFN-γシグナル伝達のためのSTAT1ホモダイマー形成が挙げられますが、タイプI干渉症では持続的な活性化が過剰なISG発現を引き起こします。確率的シミュレーションはさらに変動性を考慮し、Gillespieアルゴリズムを用いて受容体-リガンド結合や核内包のノイズをモデル化し、IFN応答の細胞間異質性を明らかにします¹⁶。この方法は自己炎症性血管炎の研究者に特に適しており、パクリン効果を取り入れた拡張ODEなどを通じて変異体と経路調節障害を結びつける定量的枠組みを提供します。

ここで、挙げられたパラメータは生産率、劣化率、パラクリン強化¹⁸を表します。高スループットのシーケンシングデータや計算資源にアクセスできるユーザーは、このアプローチを適用して候補バリアントの優先順位付けや経路への影響を探ることができます。

本研究は、血管炎の分類の困難さと従来の手法の限界から、自己炎症特徴を示す大規模な小児コホートにおいて、干渉症関連遺伝子の血管炎関連変異を特定するために、臨床エクソームシーケンシング(CES)/WESベースの遺伝子解析プロトコルを用いて、多分野にわたるリウマチ学および遺伝学的アプローチを用いて計画されました。さらに、この研究は小児血管炎における遺伝的評価の診断的価値を強調することを目指しました。

2012年のチャペルヒル血管炎分類には単一性自己炎症性血管炎¹⁹は含まれていません。本研究は、自己炎症症状を持つ小児患者群で検出される干葉症関連変異の頻度を明らかにし、希少疾患データベースの拡充に寄与し、小児血管炎における遺伝的評価の重要性を強調することを目的としました。

プロトコル

このプロトコルはエゲ大学医学部の倫理委員会によって承認されました。すべての末梢血液サンプルは、ヘルシンキ宣言に従い、患者またはその法定後見人から書面によるインフォームドコンセントを取得した後に採取されました。この後ろ向き単一センター研究は、自己炎症性疾患の疑いで遺伝子解析を受ける患者におけるインターフェロン症関連変異の頻度を評価し、血管炎との関係を調査することを目的としました。2022年から2025年にかけて、自己炎症性疾患の予備診断とともにエゲ大学分子医学研究所に送付された末梢血液サンプルが含まれました。合計1,204件のサンプルが遺伝子解析を受けました。CES/WESは、エクソンおよび隣接するイントロン配列を標的とする次世代シーケンシング(NGS)アプローチとして用いられました。変異はACMG基準とバイオインフォマティクス解析を用いて分類されました。良性および潜在的に良性の変異株は除外されました。そのうち、インターフェロン症関連変異が確認され、対象基準を満たす小児症例132名が最終研究コホートに含まれました。

この小児コホート内では、臨床データはリウマチクリニックのデータベースから取得されました。全体として、132人の患者中から92の独自の遺伝変異が特定され、その中には公開バリアントデータベース(例:ClinVar)で既に報告された病原性または病原性の可能性がある変異が13件、2026年2月時点で公開データベースに存在しない新規変異が79件含まれます。ほとんどの変異はヘテロ接合型であり、CAPS様表現型や複雑な自己炎症性血管炎の症状と関連していました。WESは、タンパク質コード領域(エクソン)および隣接するイントロン配列を標的としたNGSアプローチを用いて、スプライス部位および調節変異を検出しました。WESはヒトゲノムの約1%〜2%をカバーしますが、既知の病原変異の約85%を捉えているため、希少な変異検出において非常に効率的なツールとなっています。

研究室のワークフローには、末梢血からのゲノムDNA抽出、DNA断片化、アダプターライゲーテッドライブラリーの準備、およびビオチン-ストレプタビジンプルダウンによるハイブリダイゼーションベースのキャプチャプローブを用いたエクソーム濃縮が含まれていました。高スループットのペアエンドシーケンシングはDNAナノボールシーケンシングプラットフォーム上で行われ、平均カバレッジ深度100〜200倍を実現して、信頼性の高い変異検出を確保しました。バイオインフォマティクス解析は、基準ゲノムへのアライメント、変異呼び出し、キュレーションされた変異データベースを用いた注釈を含み、変異分類はアメリカ医療遺伝学・ゲノミクス学会(ACMG)のガイドラインに従って行われました。変異株は既に報告されたものと新規のものとして分類されました。選ばれた変異はサンガーシーケンスによって検証されました。

標準的なバイオインフォマティックパイプラインに加え、物理学に基づく信号処理の原理や簡略化された計算モデリングを用いてシーケンスの深さ、カバレッジの均一性、信号対雑音特性を評価し、生のシーケンス深度と地域カバレッジを解析するための探索的かつ補助的な層を提供しました。さらに、生物物理学的モデリングの概念を用いて、血管炎に関連する遺伝的変異の累積的影響を評価することも行われました。

この学際的枠組みは、探索的研究文脈で変異フィルタリング特性を研究するための予備的な実験モデルとして機能し、特に抗インターフェロン治療戦略の指導に役立てます。制限としては、低レベルのモザイク変異に対する感度の低下や、新規発見の機能的検証の必要性が含まれます。潜在的な応用例としては、小児血管炎の早期診断、個別化治療的意思決定、免疫学、リウマチ学、血管医学に関連する変異データベースの拡充などがあります。

DNA断片化

希釈されたDNA20マイクロリットルが新しい無菌PCRチューブに移管されました。各チューブに2μLの断片化/アデニル化バッファーと3μLの断片化/アデニル化酵素混合物を加えました。総反応容積は25μLでした。混合物は優しく混合され、短時間遠心分離され、断片化プログラムはサーマルサイクラーで実行されました。完了直後、チューブは短時間遠心分離され氷の上に置かれました。予想される結果は、平均DNA断片サイズが200〜300 bpでした。

アダプターライゲーション

各断片生成物には2.5μLのシーケンスアダプターが追加され、続いて10μLのリゲーションマスターミックス(渦巻きなし)が加えられました。混合物は均一性を確保するために優しくピペットで処理され、短時間遠心分離され、サーマルサイクラーの蓋を開けた状態で20°Cで15分間培養されました。孵化後、チューブは短時間遠心分離され、氷の上に保管されました。

ビーズベースの精製

各試料に30マイクロリットルの磁気ビーズを加え、ピペッティングで十分に混合して均一な懸濁液が得られました。混合物は室温で5分間培養され、その後チューブを磁気スタンドに3分間置きました。上澄液が排出された後、慎重に除去されました。ペレットは80%エタノール100μLで2回洗浄され、最終洗浄後に残留エタノールが除去されました。ビーズは磁気スタンドで最大5分間自然乾燥させられました。ヌクレアーゼフリーの水を9マイクロリットル追加し、ペレットはピペッティングで再懸浮させ、室温で2分間培養されました。3分間の磁気分離後、7.5μLの上清液を新たに標識されたPCRチューブに移送しました。

PCR増幅

in vitro転写(IVT)プライマーは希釈され(プライマーストック20μL+ヌクレアーゼフリー水80μL)、PCR反応(総体積17.5 μL)には、IVTプライマー1 2.5 μL、IVTプライマー2 2.5 μL、ライブラリー増幅マスターミックス 12.5 μLを追加しました。混合物は優しくピペットされ、PCR-3プログラムが実施されました。

PCR後の精製

各PCR製品に25マイクロリットルの磁性ビーズが添加されました。室温で5分間の培養後、磁気分離後、ビーズは80%エタノール100μLで2回洗浄されました。最大5分間の自然乾燥後、ヌクレアーゼフリー水11μLを加えました。10マイクロリットルの上清液が新しいチューブに移されました。図書館の濃度が測定されました。目標値:>25 ng/μL。

プーリングとハイブリダイゼーション(プールごとのサンプル)

ライブラリーはプールごとに8つの患者サンプル(1サンプルあたり93.75ng、合計750ng)でプールされました。必要に応じてヌクレアーゼフリーの水で12.5μLに体積を調整しました。ハイブリッドミックスは65°Cで15分間プレインキュベートされました。ブロッキング溶液、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチド、エクソームキャプチャプローブ、ヌクレアーゼフリー水、ハイブリダイゼーションエンハンサーが順次添加されました。16時間のハイブリッド化プログラム(18:00–10:00)が開始されました。

ストレプタビジンビーズへのハイブリゼーション標的の捕獲

ストレプトビジンビーズは結合バッファーで3回洗浄されました。16時間のハイブリダイゼーション後、混合物をビーズに加え、25°Cで30分間孵化し、5分ごとに優しく混ぜました。洗浄は室温でキャプチャウォッシュバッファー1を使用し、その後予温(48°C)捕獲ウォッシュバッファー2を用いて3回洗浄し、48°Cでのインキュベーションも含まれます。 最終洗浄後、ペレットは23μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁されました。

一本鎖DNA(ssDNA)製剤

TEバッファーを24マイクロリットル追加し、混合物を95°Cで変性させて3分間処理した後、すぐに氷の上に置きました。スプリントライゲーションバッファーとラピッドDNAリガーゼを含むマスターミックスが追加され、SS-2プログラム(37°C、30分)を実施して一本鎖DNAを円形化しました。消化バッファーと消化酵素混合物が追加され、SS-3プログラム(37°C、30分)が実行されました。その後、3.75 μLの消化停止バッファーを追加しました。85マイクロリットルの磁気ビーズが追加され、その後標準ビーズ精製が行われました。15マイクロリットルの上清液が新しいチューブに移管されました。予想濃度は0.8〜2 ng/μLでした。

DNAナノボール(DNB)製剤

ssDNA産物はDNB形成に用いられました。DNB形成バッファー、低EDTATEバッファー、DNB酵素ミックス1および2を追加しました。DNB-1とDNB-2プログラムは順次実行されました。完了後、20μLのDNB反応停止バッファーを追加し、ワイドボアピペットチップで5〜8倍の優しく混合しました。予想濃度は8〜40 ngでした。準備済みDNBはDNAナノボールシーケンシングプラットフォームにロードされ、ハイスループットシーケンシングが行われました。

シーケンスデータ処理と信号解析

生シーケンスリードはFastQC(v0.11.9)およびfastp(v0.23.1)を用いて品質管理されました。信号対雑音比(SNR)閾値20 dBは、既知の自己炎症変異のベンチマークデータセットに対して受信機動作特性(ROC)曲線解析を用いて最適化され、低周波変異株の誤検出率(FDR)<1%とターゲット感度>95%のバランスを取った。この20dBの閾値を下回るリードは破棄されました。ゲノムリファレンスコンソーシアムHuman Build 38(GRCh38)リファレンスゲノムへのアライメントおよび初期バリアントコールは、BWA-MEM(v0.7.17)およびゲノム解析ツールキット(GATK、v4.2.6)を用いて行われました。

物理ベースの信号処理段階では、ヌクレオチド配列を二進数の信号(0はプリン、1はピリミジン)に変換されました。DFTを計算するために、バイナリシグナルはN=512塩基対のスライディングウィンドウと50%の重なり(256 bpステップサイズ)で処理され、局所的なゲノム分解能を維持しました。DFTは次のように定義されました:

高周波シーケンスのアーティファクトを過剰に平滑化せずに除去するために、鋭い高周波局所化された遷移として現れる真の単一塩基変異体(SNV)を過度に平滑化させるため、ローパスデジタルフィルターがプログラム的に校正されました。最適な正規化カットオフ周波数(fc)は、0.05〜0.25サイクル/ベースの範囲を反復的にスキャンすることで決定されました。最適化アルゴリズムはfc = 0.15サイクル/ベースを選択し、これは信号パワースペクトルが既知の真正制御バリアントの総分散の≥85%を保持しつつ、バックグラウンドの技術的ノイズを除去する転換点として定義されました。Python(v3.9)で書かれたカスタムスクリプトを用いてDFTベースのフィルタリングが適用され、特にNumPy(v1.23.0)およびScpy(v1.9.1)ライブラリを活用して高周波ノイズを低減しつつ、突然変異に関連するスペクトル特徴を保持しました。フィルタリングパラメータは、希少なバリアント信号の過剰な平滑化を防ぐためにプログラム的に反復的に校正されました。信号処理と生物物理学モデリングの統合ワークフローは 図2にまとめられています。

インターフェロンシグナル伝達の生物物理学的および確率的モデリング

同定された変異体の機能的影響を調査するため、JAK–STAT経路の動態は次のように定義される常微分方程式(ODE)を用いてモデル化されました。

決定性ODEシミュレーションはCOPASI(Complex Pathway Simulator, v4.36)を用いて実行され、scipy.integrate.solve_ivpモジュールを用いたカスタムPythonスクリプトと裏付けされました。生物学的に現実的な初期条件が確立され、SALib(Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5)を用いて増幅率定数の感度解析が行われました。TYK2を媒介したIFN-αシグナル伝達速度学を組み込み、機能増幅駆動のSTAT2増幅をシミュレートしました。

確率効果はランジュヴァンの定式化を用いて導入されました。

dX = f(X) dt + g(X)dW

さらに、GillesPy2(v1.7.0)Pythonライブラリを用いて、転写バーストおよび異質IFN β誘導インターフェロン刺激遺伝子(ISG)活性化をモデル化するために、Gillespieの確率シミュレーションを実施しました。ガンマカーネル定式化で表現される分散遅延関数は、Pythonで数値積分を用いて遅延転写フィードバック機構をシミュレートしました。信号フィルタリングや数学的モデリングを含むすべての計算パイプラインは、Linuxベースの高性能計算(HPC)環境上で実行されました。

図2。JAK-STAT シグナル伝達の信号処理および生物物理学的モデリングのための統合フレームワーク。 1:信号処理段階:ヌクレオチド配列の二値マッピング(プリン=0、ピリミジン=1)の後、DFTベースのフィルタリング。正確なバリアントコールのためには、20dBの臨界SNR閾値に注意してください。2: 生物物理学的モデリング:初期条件の小さな摂動が持続シグナル伝達の閾値シフトを引き起こす増幅率の常微分方程式(ODE)に基づくシミュレーション。3: 生物学的表現型:IFN-α経路におけるTYK2増大機能変異のモデリングにより、STAT2の活性化が増幅され、それに伴う干渉症表現型が生まれる。略称:DFT = 離散フーリエ変換;IFN-α = インターフェロンα;JAK-STAT = Janusキナーゼシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子;ODE = 常微分方程式;SNR = 信号対雑音比;STAT2 = シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子 2;TYK2 = チロシンキナーゼ2。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2は、探索的計算ワークフローで使用されるODEおよび確率モデリング要素とDFTベースの信号処理の統合をまとめています。この包括的なプロトコルは、高度な分子遺伝学、ハイスループットシーケンシング技術、信号処理アルゴリズム、生物物理学モデリングを統合し、小児自己炎症性血管炎における干渉症関連変異体の検出と機能的解釈を支援しています。

統計的枠組みと信号マッピング 確率分布

シグナルフィルタリング前のゲノム配列のデジタルマッピングを形式化するために、ヌクレオチド生化学に基づく二値変換フレームワークが確立されました。長さNの任意の構造ゲノムウィンドウに対して、プリン{A, G}はデジタル値0に、ピリミジン{C, T}は1にマッピングされます。無偏で均一な背景ゲノム分布の帰無仮説(H0)の下で、この二項変換はベルヌーイ試験枠組みに従います。写像信号Xの確率質量関数(PMF)は次のように定義されます

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x に対して x ∈ {0,1}

ここでp = 0.5は、選択されていない背景トラックでピリミジン残基に遭遇する確率を表します。この変換をDFTによるパワースペクトル密度(PSD)計算のために逐次基底にスケーリングすると、累積背景雑音分布はランダムウォークのように振る舞い、中心極限定理によってガウスホワイトノイズ分布に収束します。したがって、この帰無分布の正規化パワースペクトルは自由度2のカイ二乗(χ²)分布に従います。厳密な統計的有意閾値(α = 0.05)を維持するため、真の病原性変異シグナルスパイクを定義するための臨界パワー強度閾値は、以下の確率密度積分を用いて解析的に計算されました。

しきい値 = - In(a) ×^{a 2}

ここでσ² は局所背景ゲノムノイズフロアの運用分散を表します。この閾値(p < 0.05、相当のSNR>20 dB)を超えるスペクトルピークは、下流のインシリコフィルタレーションゲートに優先され、バリアント呼び出しがデータ駆動で確率的シーケンスノイズの影響を受けにくいことが保証されました。

運用効率とコスト分析(図3)

翻訳的および臨床実装の観点から、この統合プロトコルの運用効率、臨床周回期間(TAT)、経済的実現可能性は、逐次サンガー配列決定や限定的標的遺伝子パネルなどの従来の診断経路と比較してベンチマークされました。小児血管炎や疑われるI型干渉症の従来の診断は、単一遺伝子検査の反復的なため8〜12週間に及ぶことが多いのに対し、高スループットWES分析、最適化された16時間のハイブリダイゼーション、高性能計算(HPC)クラスター上の並列化されたDFT信号フィルタリングを含む効率的なワークフローにより、初期サンプル受領から最終分子報告までの臨床TAT総期間は10〜14日と報告されています。さらに、効率的なサンプル多重化(1つのハイブリダイゼーションブロックあたり8つの患者サンプルをプールする)により、コア試薬およびシーケンスのコストは患者1人あたり約250〜300ドルと報告されており、従来の包括的パネルはしばしば1,200〜1,800ドルを超えることが多いです。診断タイムラインとコストの両枠組みの圧縮は、提案された物理学に基づくバイオインフォマティクスのワークフローが、通常の臨床遺伝学実験室でも実現可能かつ拡張可能であることを示唆しています。

結果

この132名の患者からなるこのコホートでは、同定された干渉症関連変異を含み、幅広い遺伝的変異が特定されました(表1)。患者のうち53人(40.2%)が女性、79人(59.8%)が男性でした。平均年齢は10.2歳(範囲:0〜18歳)でした。最終コホートに対応する患者レベルのデータは 補足表S1に提供されています。

表1:小児自己炎症コホート内で特定されたタイプI干渉症関連遺伝変異の分布と分類(n=132名)。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください

最も影響を受けやすい遺伝子はADAR(25人、18.94%)とDNASE1(24人、18.18%)でした。DNASE1変異は完全にクラス3(遺伝子内100%、全コホートの18.18%)でした。同様に、ADAR変異の大多数はクラス3(24名、96.00%;コホートの18.18%)であり、クラス2変異株は1件のみ(遺伝子内4.00%、コホートの0.76%)のみでした(表2)。

表2:希少疾患NGSパネルで特定された変異。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください

STING1(20名、15.15%)およびRNASEH2B(14名、10.61%)の変異も一般的でした。すべてのSTING1バリアントはクラス3(100%)でした。RNASEH2Bでは、10人(71.43%)がクラス3変異(コホートの7.58%)、4人(28.57%)がクラス2変異(3.03%)でした。

13名の患者(9.85%)で変異がRNASEH2A確認され、全員がクラス3変異株(100%)を保有していました。TREX1変異は10名(7.58%)に認められ、その中には8つのクラス3変異株(80.00%;コホートの6.06%)および2つのクラス2変異株(20.00%;コホートの1.52%)が含まれていました。

SAMHD1変異株は9名(6.82%)で検出され、クラス3変異株を有する患者が7名(77.78%;コホートの5.30%)、クラス1変異株を保有した患者が1名(11.11%;0.76%)、クラス2変異株を保有した患者が1名(11.11%;0.76%)であった。

8名の患者(6.06%)で変異が見つかり、全員クラス3でRNASEH2C変異が認められました。6名(4.55%)でDNASE1L3変異が確認され、その中にはクラス3変異株が5件(83.33%;コホートの3.79%)、クラス2変異株が1件(16.67%;0.76%)が含まれていました。PSMB8およびCOPA変異はそれぞれ5名(3.79%)で検出され、すべての変異株はクラス3(100%)に分類されました。DNASE2およびSTAT4の変異はそれぞれ3名(2.27%)に認められ、すべての変異株はクラス3に分類されました。

全体として、クラス3変異体はコホート内のほぼすべての遺伝子で優勢な変異クラスを構成していました。詳細なヌクレオチド置換および標的遺伝子間での対応するアミノ酸変化を含む特定の変異部位は表 3に分類されています。

信号処理性能の探索的解析

DFTベースの信号処理パイプラインの堅牢性と感度を探るため、標準的なGATKのみの変異型呼び出しワークフローと比較ベンチマークを実施し、特に低カバレッジのゲノム領域(深さ<30x)に焦点を当てました。予備的なベンチマークでは、統合DFTフィルタリングレイアウトが選択された低カバレッジ領域で優先順位付けの改善傾向を示し、これらの特定の実験室制御条件下で最大96.8%の探索的回復推定が示唆されました。重要なのは、これらのパラメータおよび数値効率指標は、普遍的に検証された臨床パイプラインではなく、特定の機関コホートの文脈で調整された予備的かつ探索的な結果であるということです。また、高ノイズ領域で以前に廃棄された真陽性変異株も回収しました。さらにFDRは6.4%から1.2%に減少し、低周波シーケンスのアーティファクト除去における低通過フィルターの堅牢性の可能性を強調しました。コホートで同定された新規変異のうち、14の変異株(新規発見の17.7%)は主にSTING1およびTREX1の非均一カバレッジ領域に位置し、標準的なアルゴリズム閾値で低品質のアーティファクトと分類されましたが、信号対雑音強化プロトコルに基づくサンガーシーケンスによって回復・検証されました。この分析的観察は、物理的信号特性の評価が探索的研究ワークフローにおいて有用なツールとなり得ることを示唆しています。

標準ワークフローとの比較ベンチマーキング

この統合フレームワークの性能を評価するために、2つの標準的なバリアント通話パイプライン、GATKベストプラクティスワークフロー(BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6)とDeepVariant(v1.5)を並べてベンチマーク分析が行われました。パフォーマンス指標は、低カバレッジ(深さ<30x)および高ノイズのゲノム領域で評価された高信頼度検証サブセットを用いて計算されました。比較アーキテクチャは 表4にまとめられています。

計算モデルの定量的パラメータ化と検証

生物物理学的および確率的枠組みを定量的に基盤づけるために、常微分方程とギレスピーシミュレーションは実験的制御条件下で較正された経験的動力学値を用いてパラメータ化されました。連続ODEシミュレーションは、シミュレートされたタイプIインターフェロン曝露後の720分の時間経過期間におけるリン酸化STAT2([STAT2p])の絶対濃度を追跡します。ワイルド型(WT)計算モデルでは、シグナル伝達カスケードは急速な恒常性減衰を示し、t=45分での活性化ピークと、プログラムされた負のフィードバック(k3=0.45分-1)による急速クリアランス(模擬SOCS1発現による)によって特徴づけられました。これに対し、STING1およびTYK2経路の機能獲得(GoF)変動をモデル化すると、深刻な閾値シフトが見られ、持続的で非減衰性の高炎症状態が続いた。信号の半減期(t1/2)と定常状態のフォールド変化は 表5にまとめられています。

データ可用性声明

最終コホートに対応する https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level 臨床データは補足表S1に記載されています。DFTフィルタリングおよび生物物理経路シミュレーション(常微分方程および確率モデル)を再現するために必要な離散デジタル信号処理閾値、数学的定式化、ソフトウェア環境のセットアップ、計算パラメータが公開されています。読者の恒久的かつ妨げられずにアクセスできるようにするため、この複製フレームワークはGitHubに掲載され、DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497 を通じてZenodoに永久にアーカイブされています。GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology。NumPy、SciPy、COPASIなど、このワークフローで使用される標準的なオープンソースソフトウェアライブラリや数値計算プラットフォームは、一般公開されています。

図3。タイプI干渉症関連変異体の同定および生物物理学的モデリングのための運用ストーリーボードおよびデータ駆動型パイプラインアーキテクチャ。 この回路図は、臨床コホート分析と生物学的信号処理を統合した、年代順の4段階の実験および計算ワークフローを示しています。(A) コホート層化およびNGSパイプライン:WESを受けている小児自己炎症コホート(n = 132)のワークフロー。インセットには、代表的な生のFastQ品質管理Phredスコアトラックが表示され、GATK/DeepVariantのバリアントコールおよび最終VCFマトリックス生成へと移行します。(B) DFTベースの信号処理:ゲノムテキストを数値ゲノム信号にアルゴリズム翻訳しノイズ低減を行う。埋め込みデータ駆動グラフはパワースペクトル分布をプロットし、病原性変異周波数(信号スパイク)をゲノム背景雑音に対してSNR閾値>20dBと対比します。(C) シリコ キュレーションゲート:ACMGの5層病原性ガイドライン、HGMD、Ineversのクロスチェックを統合した多層優先順位付けファネルで、79件の新規株と13件の報告株を優先順位付け。(D) 機能的生物物理学的モデリング検証:生物学的検証層。決定論的なODEフレームワークと確率的ギレスピーシミュレーション曲線はグラフィカルコンポーネントとして統合され、野生型とシミュレートされた変異体細胞動態の720分の時間経過回復と持続的なシグナル伝達をプロットします。略称:ACMG = アメリカ医学遺伝学・ゲノミクス学会;DFT = 離散フーリエ変換;GATK = ゲノム解析ツールキット;HGMD = ヒト遺伝子変異データベース;NGS = 次世代シーケンシング;ODE = 常微分方程式;SNR = 信号対雑音比;VCF = バリアントコールフォーマット;WES = 全エクソームシーケンス。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表3:小児コホート(n=132)における第I型干渉症関連遺伝変異の包括的な注釈および遺伝子座データベース管理。 ACMG基準(2015年ACMG/AMPガイドラインより):ACMG/AMPエビデンスコードはエビデンス強度でグループ化されました。非常に強力な証拠としては、機能喪失が確立された疾患機構である遺伝子における機能喪失変異の予測を指すPVS1が含まれていました。強力な証拠としては、既に確立されたアミノ酸変化を含むPS1–PS4、確定された新発発生、支持する機能的証拠、そして影響を受けた個人における変異頻度の増加が含まれていました。中程度の証拠には、PM1–PM6が含まれ、重要なドメインや突然変異ホットスポットに位置すること、集団データベースにおける不在または非常に低い頻度、劣性疾患におけるトランスの出現、タンパク質長の変化、既知の病原変異を持つ残基での新たなミスセンス変化、そしてデノボ発生の仮定が含まれていました。支持証拠には、共分離、遺伝子特異的誤認抑制、サイリコ証拠、表現型特異性、独立した証拠がない場合の信頼できる病原性報告を含むPP1–PP5が含まれていました。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください

表4:高ノイズゲノム領域における変異呼び込みパイプラインの並列性能比較。 ベンチマーキング評価は、低カバレッジ(<30x)領域で実施され、物理ベースのDFTローパスフィルターが標準的なアルゴリズム構成と比較してシーケンスノイズの除去および真正信号保護における性能を評価しました。略称:DFT = 離散フーリエ変換。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください

表5:下流のJAK-STATシグナル伝達における定量的動力学パラメータおよび定常状態変動。 病原性STING1およびTYK2変異を持つモデルにおける細胞恒常性減衰の失敗を浮き彫りにした、720分の時間経過にわたる常微分方程および確率的Gillespieシミュレーション境界の要約。略称:JAK-STAT = Janusキナーゼシグナル伝達物質および転写活性化因子;ODE = 常微分方程式;STING1 = インターフェロン応答刺激因子 cGAMP インターラクター1;TYK2 = チロシンキナーゼ2。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください

補足表S1。小児コホートの患者レベルデータセットで、インターフェロノパシー関連変異株を有しています。 この表は、原稿で分析された最終的な132人の患者コホートに対応する患者レベルのデータを提供します。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコルの重要なステップには、DNA断片化、アダプターライゲーション、PCR増幅、単鎖DNA(ssDNA)円形化が含まれます。これらの段階では、汚染リスクを最小限に抑えるために綿密な作業が不可欠です。ビーズベースの精製時には、正確なエタノール洗浄と適切な磁気スタンドインキュベーション時間が必須であり、逸脱は製品の収率低下や変異検出の見逃しにつながる可能性があります。プールライブラリーの準備中は、患者あたり93.75 ngの正確な計算と慎重な体積調整が必要です。

プロトコルの最適化やトラブルシューティングのために、特にssDNA濃度が0.8〜2 ng/μL未満の場合、シーケンス深度の増ややビード乾燥時間の短縮が必要となり、バリアントの呼び声感度を向上させる必要があります。モザイク変異が疑われる場合、長リードシーケンス技術の統合により検出精度が向上する可能性があります。さらに、酵素分解後にサンプルを氷上に迅速に移すことは、製品の安定性を維持するために非常に重要です^12,13。DNB準備中は、ゆっくりと穏やかなピペッティングとストップバッファーの慎重な追加により、ナノボールの完全性が保たれます。これはSAVI ^6,11のような早期発症型干渉症における遺伝子型-表現型相関の確立に特に重要です。

このWESベースの遺伝子解析は、自己炎症症状および血管炎を持つ小児患者における干渉症関連変異を評価するための枠組みを提供します。DNASE1、ADAR、STING1、RNASEH2A/B/C、TREX1、SAMHD1、COPAなどの主要遺伝子の変異を特定することで、インターフェロン駆動の血管炎表現型の遺伝的異質性を浮き彫りにしました。このコホートにおける核酸代謝および感知遺伝子、特にDNASE1およびADARの変異の頻度は、小児血管炎および自己炎症性疾患の病因において調節不全型Iインターフェロンシグナル伝達の中心的役割と一致しています。これらの発見は、これらの遺伝子が干渉症および血管炎の症状と関連しているという以前の報告と一致しています ^4,5,7。

SAVIで観察される皮膚および間質肺の関与など、単一性自己炎症症候群の血管炎様症状を明らかにすることで、このアプローチは早期診断を促進し、抗インターフェロン標的治療の指針となる^{可能性があります。}単一遺伝子干渉症は、ANCA関連血管炎や他の小児血管炎と臨床的に類似し、非定型または治療抵抗症例における遺伝子検査の重要性を強調しています(^9,10,11)。早期の遺伝子診断は、STING1および他のインターフェロン関連変異患者で臨床的効果を示しているJAK阻害剤などの標的治療の早期開始を可能にすることも可能^である。

また、複雑な自己炎症性血管炎を呈する小児患者の多くが、干渉症関連遺伝子の稀または新規変異を保有していることも強調しています。この大規模なコホートで79の新規変異が特定されたことで、既知の遺伝スペクトルが拡大し、小児血管炎における遺伝子型-表現型相関の改善に寄与する可能性があります。

この探索的ワークフローにおける運用上の考慮事項は、探索的SNRパラメータの逸脱がフィルタリング出力に影響を与える可能性があるため、しきい値の評価です。例えば、DFTベースのヌクレオチド分布フィルタリングはノイズ除去を助けますが、突然変異信号の過剰な平滑化を避けるために校正が必要です。トラブルシューティングには、特徴抽出¹⁵を最適化するために二値マッピングパラメータ(プリンは0、ピリミジンは1)を反復的に調整することが含まれます。生物物理学モデリングにおいて、常微分方程式の初期条件を定義することが不可欠であり、増幅率の小さな摂動が閾値挙動を変化させ、持続的なインターフェロンシグナル伝達を過小評価する可能性があります。強化されたJAK-STATの詳細には、IFN-αシグナル伝達におけるTYK2の役割のモデル化が含まれており、機能獲得型バリアントがSTAT2の活性化を増幅し、干関症表現型²⁰を引き起こすことを示しています。

手法の改良には、常微分方程式にランジュバンノイズ項を追加するなど、ノイズの多いセルラー環境向けの確率要素の積分が含まれることがあります。

dX = f(X)dt + g(X)dW

ここでdWはウィーナー過程ノイズを表し、JAK-STAT変動のシミュレーションにおけるリアリズムを高め^ます。ギレスピーアルゴリズムを用いたインターフェロン経路の確率的シミュレーションは、細胞間転写因子レベルの差がISG活性化の二峰分布をもたらす負のフィードバックループによるIFN-β発現の異質性を捉えます^22,23。経路モデルのトラブルシューティングには、実験的なIFN βデータとの検証が含まれます。増幅が乖離した場合、リン酸化酵素活性化率などの負の対照を再調整したり、転写に分散遅延を組み込むことができます。

遅延過程にはガンマ核を用いています。

全ゲノムシーケンス(WGS)と比較すると、このWES重視のアプローチはコスト効率が高い可能性がありますが、非エクソニック領域に関しては網羅性が劣ります^24,25。この予備的枠組みの範囲は、累積効果が臨界値を超えて血管損傷を引き起こす閾値モデルのように、数学的変動が推定されるインターフェロンシグナル挙動と数学的変動がどのように相関するかを評価するための補助的な生化学的シミュレーションモデルを提供することに限定されています。この手法の制限には、低レベルのモザイク変異を見落とす可能性や、新規発見の機能的検証の必要性^{があります。}

この技術は免疫学や血管医学に応用が見込まれており、経路への変異影響をシミュレートして抗インターフェロン治療を導いたり、希少疾患診断のためのデータベースを充実させたりする。確率的拡張は、インターフェロン症における異質な応答の予測をさらに可能にし、個別化医療の支援となる可能性があります。

本研究では、小児血管炎における遺伝的評価を、組織病理学や画像診断法などの従来の診断手法と並行して強調しています。総じて、本研究は小児血管炎における遺伝的評価の重要性を強調しつつ、自己炎症性疾患の疑いの遺伝子解析を受ける患者にインターフェロン症関連変異の頻度が確認されることを強調しています。これらの変異体がインターフェロンシグナル伝達経路に与える影響を評価し、小児血管炎における早期診断の重要性を強調することで、本研究は血管炎性および自己炎症性疾患に関連する希少疾患データベースの充実に貢献し、変異病原性や集団特異的多型性を調査する将来の研究に洞察を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Adjustable Pipettes (P2, P10, P20, P200, P1000)	Any supplier		正確な液体処理用
Benchtop Centrifuge	Any supplier		PCRチューブの短時間遠心分離用
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (または同等品)	PCR増幅マスターミック
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Any supplier		80%エタノール洗浄液の調製用
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	キットに含まれるか別売り	ライブラリアンプル増幅プライマー
Low-binding PCR Tubes (0.2 mL)	Any supplier		滅菌PCRチューブ
Magnetic Stand / Magnetic Rack	Any supplier		磁気ビード分離用
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	DNBSEQ技術(DNAナノボールシーケンシング)を使用したベンチトップ次世代シーケンサー;複数のリーディング長をサポート(例: SE50からPE300);最大1440 Gbの高いスループット出力;WES、WGS、および標的シーケンシングアプリケーションに最適。
MGIEasy Circularization Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (デュアルバーコード、16 RXN) または 1000005260 (V2.0)	単一鎖環状DNA(ssCirDNA)を生成するための環状化キット;デュアルバーコードバージョンはインデックスホッピングを減少;MGIシーケンシングワークフローにおけるDNB形成のためのライブラリ前処理後の重要なステップ。
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	DNA精製用磁気ビード
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (デュアルバーコード環状化と統合) または関連DNB Make (例: 940-000036-00 Onestep DNB)	DNAナノボール(DNB)調製モジュール;フローセルローディング用の環状化とナノボール生成を含む;DNBSEQシーケンサーのライブラリ処理の最終ステップ(しばしば環状化キットと組み合わせる)。
MGIEasy Exome Capture Accessory Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (または同等品)	ブロッカー溶液、MGI Universal Blockers、Enhancer、Binding Buffer、Wash Buffer 1& 2、およびストレプタビジンビードを含む
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (または Twist CES Probes、MGI/DNBSEQと互換性あり)	MGI Tech Co., Ltd. (MGIEasy用) または Twist Bioscience (Twist用)	1000007745 (V4プローブセット、16 RXN) または 1000007740 (プローブ);Twist: カスタム / パネル固有 (注文ベース、標準番号なし)	ハイブリダイゼーションベースの全エクソームキャプチャープローブ;~59 Mbのコーディング領域(CCDS、RefSeq、GENCODE、miRBase)をターゲット;DNBSEQプラットフォーム上のWESワークフローにおける高効率エンリッチメント用に設計;MGIEasyアクセサリーキットとハイブリダイゼーション(65°C予備インキュベーション、65°Cで16時間)、ブロッカー添加、ストレプタビジンビード捕捉(結合バッファー、48°CでWash Buffer 1/2)、溶出、およびハイブリダイゼーション後のPCR増幅(Equinoxミックと互換性あり)に使用。
MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	ハイブリダイゼーションおよび洗浄試薬
MGIEasy FS DNA Library Prep Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (16 RXNセット) または 1000005256 (96 RXNコアキット)	高速フラグメンテーションベースのDNAライブラリ調製キット;5–400 ng gDNA入力の酵素的フラグメンテーション;DNBSEQプラットフォームと互換性があり、効率的なWGS/WESライブラリ構築が可能。
Nuclease-free Water	Any supplier		分子生物学グレード
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	ライブラリ定量用
Qubit ssDNA Assay Kit (オプション)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	環状化後のssDNA定量用
Streptavidin Magnetic Beads	MGI Tech	アクセサリーキットに含まれる	ハイブリッドキャプチャー用
TE Buffer (pH 8.0)	Any supplier		変性ステップ用
Thermal Cycler	Various (Bio-Rad、Thermoなど)		フラグメンテーション、リゲーション、PCR、およびDNBプログラムに使用
Vortex Mixer	Any supplier		サンプル混合用
Wide-bore Pipette Tips	Any supplier		DNB調製に必要