ショウジョウバエにおけるストレス誘発性うつ様状態の多様行動表現型

サマリー

このプロトコルは、 ショウジョウバエメラノガスターにおけるストレス誘発性行動変化を評価するための枠組みを提供します。補完的なアッセイを組み合わせることで、個々のハエの活動、探索、意思決定の定量化が可能になります。このアプローチは柔軟であり、ストレス生物学、代謝、神経行動機能を調べる幅広い研究に適応可能です。

要約

代謝性、神経変性性、ストレス関連疾患は、しばしば移動の変性、意思決定の障害、行動の柔軟性の低下を伴います。しかし、ショ ウジョウバエメラノガスター におけるこれらの表現型を定量化するための利用可能なマルチモーダル行動フレームワークは限られています。ここでは、強制泳ぎ曝露、Y迷路旋回行動と利き手、光走性、FlyVacシステムでの活動評価、野外探索、 ショウジョウバエ 活動モニターを用いた長期的な運動モニタリングを統合したプロトコルを紹介します。これらの補完的なアッセイは、運動出力、動機付け、意思決定構造、行動の変動性など、行動の多面を神経および代謝状態の機能的読み取りとして捉えます。このパイプラインは拡張性が高く、再現性が高く、薬理学的、遺伝的、環境的操作に適応可能であり、 ショウジョウバエにおけるストレス、代謝、神経変性に関連する行動表現型を検出するための多様な枠組みを提供します。

概要

移動、意思決定、探索活動の変化などの行動変化は、神経および生理状態の生物レベルの指標として広く用いられています。分類群全体で、神経機能障害はしばしば運動構造の変化、探究的動機の減少、感覚誘導的意思決定行動の障害、行動予測可能性の変化として現れます。これらの生物レベルの出力は神経、代謝、生理状態を統合しているため、疾患に関連する表現型を検出するためのスケーラブルな読み取り結果を提供します。しかし、分子遺伝学や神経科学でド ウジョウバエ の広範な利用にもかかわらず、運動性能、意思決定構造、行動の変動性を同時に捉える標準化された多様性行動フレームワークは限られています。

モデル生物は、ストレス関連および神経精神表現型のメカニズムを研究するために不可欠です。なぜなら、人間では制御された実験操作がしばしば不可能だからです。ストレス関連行動症候群は昆虫を含む多くの分類群で発生し、セロトニンやドーパミンなどの保存された神経調節系や代謝シグナル伝達経路に関与します。したがって、ショウジョウバエはその短い世代時間、遺伝的可解性、疾患関連^経路の保存性により、分子機能障害と生物レベルの行動結果を結びつける強力なシステムとして浮上しました^1,2。

同時に、ショウジョウバエの多くの行動アッセイは通常単独で適用されるため、一般的な病気の影響、運動障害、動機付けの変化、意思決定レベルの行動変化を区別するのが困難です。さらに、平均行動指標だけでは生物学的に意味のある表現型が見えにくくなることがあります。なぜなら、神経調節や発達の乱れが行動の変動を変化させることが多いため、平均的な行動出力よりも行動の変動が変化することが多いからです。したがって、ロコモーター、探索、感覚、意思決定アッセイを組み合わせたマルチモーダル行動的アプローチが、堅牢な生物レベルの表現型シグネチャーを生成するために必要です^。

ここでは、強制泳ぎ曝露^4,5、Y迷路旋回行動と利き手^6,7,8,9、FlyVac^{システムを用いた}光走性と活動^{評価、オープン}フィールド探査¹²、ショウジョウバエ活動^{モニター5,13}を用いた長期の運動モニタリングを統合したマルチモーダル行動パイプラインを示します(図1)).この枠組みの各アッセイは、ストレス関連表現型に関連する独自の行動的側面を捉えています。強制泳ぎテストは受動的対処行動を測定し、早期の非動的移行は逃避反応を維持する動機の低下を反映しています。オープンフィールドおよびDAMアッセイは、一般的な運動活動と概日リズム構造を定量化し、運動出力と覚醒の基準値を提供します。Y迷路アッセイは、左右の選択の連続を通じて意思決定構造を捉え、回転バイアス(側方化)と行動の変動性の両方を予測可能性の指標として推定することを可能にします。最後に、FlyVacアッセイは繰り返しの光戦略選択を通じて感覚誘導された意思決定と回避行動を評価します。これらのアッセイは、活動、動機付け、意思決定レベルの行動の変化を区別する補完的な結果を提供します。

このプロトコルは、運動出力、動機付け、意思決定構造、行動の変動性といった補完的な側面を捉え、 D. melanogaster¹⁴におけるストレス、代謝、神経変性に関連する行動表現型を検出するための拡張可能な枠組みを提供します。本研究の主な目的は、ストレス誘発行動変化の多面性を捉えるために補完的なアッセイを統合したマルチモーダルな行動表現型の枠組みを確立することです。ここでは、ストレスパラダイムを標準化された摂動として用い、フレームワークの感度と適用可能性を示します。

プロトコル

強制泳ぎアッセイは3R(置換、還元、精錬)の原則に従って実施されました。代替は、ショ ウジョウバエ・メラノガスター を無脊椎動物モデルとして用いることで実現され、倫理的理由でますます制限される脊椎動物の強制泳ぎのパラダイムを回避しました。この削減は、比較的小規模なコホートからも動物使用を最小限に抑えつつ、高スループットな特性によって支えられました。精細化は、水泳曝露を2分に制限することで改善され、この期間は疲労や溺死を防ぎ、試験直後に正常な運動行動を完全に回復させるものでした。これらの考慮点が合わさることで、アッセイは意味のある行動データを提供しつつ、潜在的な苦痛を最小限に抑え、倫理的な受容性を最大化します。教育現場においても同様です。

1. ショウジョウバエ における沈み様状態の誘導(振動応力プロトコル)

1. 雄の D. melanogaster は、発梢後24時間以内に軽いCO₂麻酔下で採取してください。すべての詳細は 材料表に記載されています。
2. フライを10匹ずつグループに入れ、コットンプラグで密封したポリプロピレンまたはアクリルバイアル(長さ95mm×内径25mm)に入れます。
3. 振動プラットフォームを用いて機械的振動(300Hz)にさらされます。
4. 標準的な食品入りのバイアルで、45分間の振動と15分間の回復サイクルを繰り返し行います。
5. 振動サイクルを1日合計6時間続けます。
6. ストレス対策を3日間連続で繰り返します。
7. 振動にさらさずに同じハウジング条件下で制御フライを維持しましょう。
   注:本プロトコルでは、生殖状態やホルモンの影響を含む性別特異的な生理学的・行動的差異に関連する変動を減らすために、オスハエのみが使用されました。この標準化により、管理された環境下でストレス誘発の行動効果の検出が容易になります。しかし、このプロトコルはメスのハエにも完全に適用可能であり、性別特異的反応は今後の重要な研究分野です。ストレス関連やうつ様表現型に対する感受性は、ショ ウジョウバエを含む分類群によって性別や年齢によって異なるため、この枠組みを異なる人口統計グループに拡張することで、さらなる生物学的洞察が得られる可能性があります。このパラダイムは、ハエの動機付けや活動の変化を引き起こす既存の制御不能な振動ストレスモデルから応用されています。

2. ショウジョウバエ・メラノガスターでの強制泳泳テスト

注意:ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は刺激物質です。SDS溶液を準備・取り扱う際は、適切な個人用保護具(例:手袋や目の保護具)を着用してください。肌や目を合わせるのは避けましょう。SDSを含む廃棄物は、機関の化学物質安全ガイドラインに従って処分してください。

1. 成虫のハエは羽化から24時間以内に採取し、常に光を保ち管理された環境下で飼育してください。
2. マルチウェルチャンバースライドを準備し、室温で0.08%のSDS溶液を~2mL充填します。
3. 記録直前に各井戸にフライを1匹ずつ移します。麻酔は不要です。
4. オーバーヘッドカメラで2分間行動を記録し、最初の静止までの遅延を定量化します。
5. 最初の不動までの遅延を定量化します。
6. 記録後はハエを取り除き、吸収性の紙に置いて正常な移動の回復を確認しましょう。
   注:不動とは、表面の位置を維持しながら積極的な脱出動作を停止することと定義されます。総動止期間や動けない回数などの追加パラメータを記録するには、より長い記録時間(例:3分)が必要です。このアッセイは受動的な対処行動を反映しています。動かなきまいまでの遅延の減少は、逃避反応を維持する動機付けの低下と解釈されます。ハエごとに動かない時間や完全な動かない状態までの遅延のばらつきがあります。このアッセイは一時的なストレスや疲労を引き起こすことがあります。縦断設計で使用する場合は、他のアッセイの前に実施し、十分な回収期間(例:≥24時間)を確保してから次の試験を行います。

3. ショウジョウバエ活動モニター(DAM)を用いた長期的な運動活動モニタリング

1. 麻酔はチョウバエを短時間(5秒)にCO₂で選別します。
2. 個々のフライを餌と綿のプラグを含むガラスのDAMチューブに入れます。¹⁷。
3. ショウジョウバエ活性モニターシステムにチューブを挿入します。
4. 制御された温度と明暗条件下で連続して(48時間)運動活動を記録します。
5. ビームブレイクカウントは取得ソフトウェアで保存できます。
6. ビンの活動データを定義された時間間隔(例:1〜10分)にまとめます。
7. 適応後に死んだり活動が見られないハエは除外しましょう。
   注:48時間にわたる連続的な運動モニタリングは概日リズムの活動パターンを捉えるのに十分です。 DAM: 個人ごとの総距離、速度、試合構造の変動。

4. オープンフィールドでの運動測定法

1. 短時間(5秒)にCO₂を使ってショウジョウバエを麻酔します。
2. 個々のフライを長方形の25×75mmアリーナに移します(1アリーナに1匹)。
3. 撮影前に、ハエがアリーナ環境に慣れるまで20分間待ってから、一定の低強度の拡散白光の下で撮影します。
4. 自動ビデオトラッキングシステムを使って、常時照明下での行動を記録します。
5. 追跡ソフトウェアを使って軌道を解析し、以下を抽出します:
   移動距離の総額
   平均運動速度
   加速度と旋回計測
   注:このアッセイは、ストレス関連の行動変化を解釈するための基準を提供します。この慣熟期間は取り扱いによるストレスを最小限に抑え、ハエがアリーナに慣れることを促し、記録された運動活動が基準的な行動を反映するようにします。概日リズムの変動に伴う変動を減らし、試験全体で一貫した行動条件を確保するために、一定の照明が用いられました。軌跡は、EthoVision XT(Noldus Information Technology)などの自動追跡ソフトウェアや、Ctrax、idTracker、TrackMate(ImageJ/Fiji)などのオープンソース代替ソフトで抽出可能です。利用可能性やユーザーの好みに応じて可能です。 オープンフィールドアッセイ: 個人ごとの総距離、速度、構造の変動。秩序効果を減らすために、順応と照明条件をセッションごとに標準化しましょう。同じ個体で複数回のアッセイを行う場合は、アリーナ曝露時間を一定に保ちましょう。

5. Y迷路回転行動および行動変動アッセイ

1. CO₂を使ってショウジョウバエに短時間(5秒)麻酔をかけます。
2. 個々のハエをYメイズチャン^バー8,9に入れます。レーザー彫刻機を使って厚さ1.6mmの黒いアクリルに迷路を切り出しました。フライは95個の個別の迷路に配置され、それぞれが3本左右対称のアーム(長さ12mm、幅3.3mm)で構成されていました。
3. ハエが長時間(20分)自由に探索できるようにします。
4. 探索移動(1時間)中の旋回判断(左または右)を記録してください。
5. 右折の割合として個別旋回バイアスを計算します。速度、加速度、動きのない運動、活動の時間に基づく変動などの関連指標を計算します^12,15。
6. 旋回バイアスの絶対偏差(MAD)を用いて、フライ間の行動ばらつきを定量化します。
   注:このアッセイは、全体的な活動レベルとは独立して、運動手の動きと行動予測可能性を測定します。旋回シーケンスは意思決定構造を捉え、ターンバイアスはラテラシエーションを反映し、個人間の変動は行動の予測可能性を反映します。 バイアス =右旋回の割合(フライあたり); バリアリティ =ハエ間でのバイアスの分散(MADn)。繰り返し検査を行う場合は、個人やコホート間でアッセイ順序を逆釣りして配列効果をコントロールすることを検討してください。

6. 光形成選択:FlyVac装置での活動モニタリング

1. 個人の飛行機を_CO2麻酔なしでFlyVacチャン^バー6,11に積み込みます。
2. 試験開始前に10分間の順応期間を設けてください。
3. 各ハエに繰り返し明るい暗い二項の選択肢を提示します。
4. 自動検出を用いて40件の試験で選択を記録します。
5. 1回あたりの光選択確率と光の選択間隔を活動の指標として計算します。
6. MADを用いる個人間の行動ばらつきを定量化します。
   注:FlyVacシステムは平均意思決定バイアスおよび個体間変動の同時評価を可能にします。このプロトコルで記述される行動アッセイはモジュール化されており、実験設計に応じて異なる順序で実施可能です。ただし、潜在的な影響を最小限に抑えるために、他の検査の前に強制泳ぎ検査を行うことが推奨されます。秩序効果を減らすために、順応と照明条件をセッションごとに標準化しましょう。

7. データ分析

注:行動分析は、特に記載がない限り、個々のハエを推論単位として実施されました。

1. 強制泳ぎテスト:動画録画を手動または行動評価ソフトで分析します。
   注:不動とは、フライが浮いている間に積極的な脱出動作がないことと定義されました。各フライごとに抽出されたパラメータは、最初の不動までのレイテンシー(レイテンシー)。行動指標の非正規分布のため、グループ比較は非パラメータ統計検定を用いて実施されました。
2. 長期運動活動(DAM):ショウジョウバエ活動モニターによるビームブレイクカウントの記録。エクスポートして10分ごとにビン分けしてください。
   注:各ハエごとに総活動数と概日リズムの活動パターンが計算されました。これらのパターンはR、Python、Excelのいずれかで計算可能です。死亡や技術的な遺物による活動不振を示すハエは分析前に除外されました。アッセイは48時間続きました。
3. オープンフィールドロコモーターアッセイ:ビデオ追跡データを自動追跡ソフトウェアで処理します。動画ファイルをEthoVision XTにインポートします。コントラストベースのしきい値を用いた自動検出による追跡を行います。
   注:軌道はデフォルトのフィルタリングアルゴリズムで平滑化されています。各フライごとの運動パラメータ(距離、速度、加速度)はCSVファイルとしてエクスポートされ、下流解析に用いられました。1回あたりのロコモーターパラメータには、移動距離(mm)、加速度(mm/^{s 2})が含まれていました。要約統計はグループ比較前に個人レベルで計算されました。このテストの時間は各グループで1時間でした。
4. Y迷路旋回動作:記録された軌道から旋回決定を抽出し、左または右に分類し、各個体ごとに左/右の二進数列としてエクスポートします。
   注:各フライについて、旋回バイアスは記録されたすべての判定における右旋回の割合として計算されました。フライ間の行動変動は、旋回バイアスの中央値絶対偏差(MAD_n = 1.4826 × MAD)を用いて定量化しました。このテストの時間は各グループで1時間でした。
5. FlyVacの光入力選択:光と暗の二択の選択肢を自動的に記録します。各フライについて、ライトアームが選ばれた試行の割合として光選択確率(LCP)を計算します。光悪性バイアスは二値試験結果の平均(ライト=+1、ダーク=−1)として表します。
   注:個体間変動は個々の光走性指数のMAD_nを用いて定量化されました。
6. 統計分析:10,000件のラベルランダム化を用いた置換ベースの検定を用いて行動指標のグループ差を評価します。
   注:変動性比較のため、グループ間のMAD_nの絶対差に対して置換検定を実施しました。MAD_の推定値の信頼区間はブートストラップ再サンプリングを用いて取得しました。2尾の非ペアt検定を用いて、ハエによって移動する距離(mm)と最大加速度(mm/^{s 2})を比較しました。データの可視化には、主に密度、濃度、歪度を示すためのバイオリンプロット、ボックスプロット、コラムチャートが使用されました。統計的有意性はα = 0.05で評価されました。

結果

振動ストレスプロトコルの適用により、D. melanogasterの活動、対処行動、意思決定を捉えるために設計された複数のアッセイ(図1)で測定可能な行動変化が得られました。

うつ様誘導

繰り返しの機械的振動にさらされたハエ(図1A)は、ストレスを受けていない対照群と比較して探索活動が減少し、行動反応が変化しました。これらの変化はその後の行動アッセイで安定しており、振動パラダイムが持続的な抑うつ様状態を効果的に誘発していることを示しました。

ディスカッション

本プロトコルは、 D. melanogasterにおけるうつ様行動状態の誘導と定量化のためのマルチモーダルアプローチを示しています。振動ベースのストレスパラダイムと補完的な行動アッセイを組み合わせた研究により、うつ様誘導は対処行動、運動活動、探索的ダイナミクス、意思決定、行動変動の各指標で検出可能であることを示しました¹⁶。本研究で用いられているストレス体制は、プロトコルの主な焦点を示すのではなく、測定可能な行動変化を引き出し、マルチモーダルフレームワークの有用性を示すための実践的なツールとして機能します。この統合フレームワークは、従来の活動ベースの読み取りと行動の個性測定を組み合わせることの価値を強調しています。本研究で得られた強制泳ぎ検査の結果は、このアッセイがハエにおける受動的対処行動の測定値として既に検証された研究と一致しています。以前の発見と同様に、ストレスを受けたフライは移動停止の増加を特徴とする変化した泳動を示し、振動ストレスの誘導パラダイムとしての信頼性を支持します

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔機器：例えば、ベンチトップフローバディ、コンプリートシステムw / アルティメットフライパッド	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500マルチスピード渦	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	すべてのプラットフォーム付き
狭いバイアル用コットン栓	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	カタログ番号：51-101
Drosophila活動モニター（DAM2）	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: 利用不可	32チューブ
Drosophila melanogaster（Oregon-R-modENCODE）	Drosophila melanogaster（Oregon-R-modENCODE）	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	カタログ名：GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	バージョン11.0.1
Logitech C920 HD Proウェブカム、HD 1080pレンズカタログ名：HD ProウェブカムC920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Switzerland	RRID：利用不可	FSTに使用される上部録画カメラ
ポリプロピレン製の狭いフライバイアル	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	カタログ番号：32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	RRID：SCR_000441	v. 15.0
ナトリウムドデシル硫酸（SDS、≥99%）	Merck KGaA（Sigma-Aldrich）, Darmstadt, Germany	カタログ名：Natriumドデシル硫酸（ACS試薬、≥99%純度）；RRID：利用不可
ZEISS Stemi 508ステレオマイクロスコープ	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Germany	15634448