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方法論記事

使用済みヒト胚培養培地の核磁気共鳴代謝解析:方法検証と技術的考察

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DOI:

10.3791/71285

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2026年7月31日

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1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

この記事について

サマリー

ここでは、核磁気共鳴(NMR)分光法を用いて使用済みヒト胚培養培地を採取、調製、分析するプロトコルを紹介し、通常の臨床培養条件下でマイクロリットルスケールのサンプルから低分子量代謝物を再現可能にします。

要約

使用済みのヒト胚培養培地には低分子量の代謝物が含まれており、着床前の胚の生理を非侵襲的に読み取ります。しかし、これらのサンプルの核磁気共鳴(NMR)に基づく代謝解析は技術的に困難です。なぜなら、通常の胚培養条件ではマイクロリットルの体積、タンパク質補給、そして背景信号を生成しスペクトル品質を損なうパラフィンオイルのオーバーレイが含まれるからです。ここでは、油汚染を最小限に抑える制御された液滴収集、外部参照(TMSP)から化学的に分離しつつマイクロリットル容量に対応したフッ素化エチレンプロピレン(FEP)チューブライナー、そしてCarr-Purcell-Meiboom-Gillパルスシーケンスを用いた高分子背景信号抑制の取得を導入し、使用済み胚培養培地の最適化されたNMR代謝学ワークフローを提示します。このプロトコルは、個別培養されたヒト胚からの低分子量代謝物の一貫した検出と定量を可能にし、通常の実験室条件下での再現性分析をサポートします。多くの技術的課題があるため、研究や臨床目的で使用する前に適切な検証が必要です。

概要

着床前発育の間、胚は周囲の培地に低分子量の代謝物を継続的に消費し放出します。使用済み胚培養培地(SECM)の組成は胚の代謝活動を反映し、非侵襲的な胚生理学および発生能力の機能的読み取りを提供します1,2。この代謝フットプリントの解析は従来の評価手法を補完し、補助生殖技術における胚選択戦略を改善する可能性があります3,4。特に、アミノ酸と炭水化物のターンオーバーの変化が胚の発生可能性および生存可能性と関連しています 5,6,7。

核磁気共鳴(NMR)分光法は、使用済み胚培養培地8,9,10を含む多様な生物サンプルの非標的代謝物プロファイリングに広く利用されています。しかし、これらのサンプルの分析は依然として分析的に困難なままです。日常的な臨床実践では、胚は生理的条件を模倣するよう設計された特定の微小環境で培養されます。培養培地には、浸透圧の安定化、有毒化合物の結合、脂質や成長因子のキャリア分子の供給が通常アルブミンで補われ、浸透圧の安定化、毒性化合物の結合、そして正常な発生を支える担い手分子が供給されます12。蒸発を防ぎ、溶質濃度を一定に保つために、培養液滴の上に無菌パラフィン油13が重ねられます。

重ね油やタンパク質成分から起因する脂質は、グルコース、ピルビン酸、アミノ酸などの低分子量代謝物からの狭い共鳴を隠す広範な背景信号を生成します。さらに、標準的な5mmNMR管でマイクロリットルのサンプル体積を分析するには、RFコイルの有効体積に達するためにかなりの希釈が必要です。この分析物濃度の低下は信号対雑音比(S/N)を著しく低下させ、低存在比の代謝物を隠し、再現可能な定量を妨げます。多くの研究が使用済みヒト胚培養培地にNMRベースのメタボロミクスを適用していますが、標準化かつ再現性のある収集および調製プロトコルの欠如により、再現性と研究間比較性が制限されています(8,9,11)。

ここでは、ヒト胚培養培地のサンプリングおよび解析に伴う技術的課題を克服するために設計されたNMRベースのメタボロミクスワークフロー(図1)を紹介します。このアプローチは、油のキャリーオーバーを減らすための制御された液滴収集、希釈アーティファクトを避けるためのフッ素化エチレンプロピレン(FEP)ライナーを用いたマイクロリットル単位の取得、そしてCarr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)パルスシーケンスを用いた高分子シグナル減衰を組み合わせています。

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プロトコル

この研究は、2023年1月から4月にかけてスロベニアのマリボル大学医療センターの生殖医学婦人内分泌科で実施されました。NMR解析はスロベニアのリュブリャナにある国立化学研究所で行われました。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。この研究は、機関倫理委員会(番号:UKC-MB-KME-1/21)および国家医療倫理委員会(番号:0120-37/2021/15)の両方から承認を受けました。

1. 研究デザイン

注:本研究は、NMRベースの代謝組学を用いてヒト使用済み胚培養培地を解析しました。

  1. 細胞質内精子注入(ICSI)後の長期胚培養後にサンプルを採取します。未使用のインキュベーション対照サンプルを同数採取します。

2. サンプル採取

  1. 図2に示すように、胚培養後に使用済み胚培養培地(SECM)サンプルを採取します。
  2. 胚を培養液滴から取り出した後、培地を乱さずに培養皿表面から余分なオーバーレイ油を慎重に吸引します(図2、ステップ1)。
  3. 滅菌ピペットを用いて、元の液滴から約35μLの培養培地を吸引し、残留油分を吸い込むのを防ぐために約5μLを残します。この体積を無菌ペトリ皿に移し、新しい液滴を形成します(図2、ステップ2)。
  4. 立体顕微鏡の下で、新たに形成された液滴を目視で観察します。この滴から約30μLを慎重に吸引し、油の持ち越しを最小限に抑えるために約5μLを残します。この体積を別の無菌場所に移し、よりクリーンな液滴を形成します(図2、ステップ3)。
  5. 拡大鏡で2枚目の水滴を目視で確認してください。油滴が最も目立たない地域を特定しましょう。ピペットの先端をこの領域に挿入し、約25μLの培地を吸引し、油の持ち越しを最小限に抑えるために約5μLを残します(図2、ステップ4)。
  6. 収集した25μLを直ちに無菌でRNaseフリーのマイクロ遠心分離機チューブに移します。サンプルを分散する際には、汚染やサンプルの損失を防ぐためにチューブの内壁に触れないようにしてください。すぐに、収集したすべてのサンプルを液体窒素で急速凍結し、-80°CでNMR解析まで保存します(図2、ステップ5)。
  7. 同一培養条件下で、上記の培養皿、オーバーレイ油、培養期間、培養環境、取り扱い手順を用いて、未使用の未使用済みコントロールドロップ(胚なしの培地)を採取し、環境変動と潜在的な系統的バイアスを最小限に抑えます。
    注:連続的な滴の移動と目視検査の厳格な遵守により、油汚染が大幅に減少します。この段階では、実験は一時停止され、NMR取得のためのさらなるサンプル処理の前に再開されることがあります。

3. NMR分析のための試料準備

  1. サンプルは室温で解凍し、約10分間保存します。
  2. NMR混合物の準備:
    1. 25μLのSECMを1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。D₂Oを200μL加えて10秒間渦巻き、その後室温で1000 × g で10秒遠心分離機にします。
  3. ロードインサート:混合物の225μLをFEPライナーに移します。
  4. 外部参照管を準備しろ。
    1. 5mmのNMRチューブに150μLのD₂Oを充填し、1mMの3-(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウム塩(TMSP-d4)を含みます。
  5. サンプルの組み立て:FEPインサートをNMRチューブに挿入し、パラフィルムで密封します。

4. NMR取得およびスペクトル処理

  1. Bruker cpmgpr1dパルスシーケンスを用いて 1回のH-CPMG取得を64回のスキャンで取得します。65,536件のデータポイント;リラクゼーション遅延:8秒;スペクトル幅:11.9 kHz;エコー時間:80ループ×400μs(有効T₂フィルター32ms);総取得時間:~15分。
    注:有効なCPMG T₂フィルター持続時間は64 msで、タンパク質含有生物サンプルの確立されたメタボロミクスプロトコルに基づいて選ばれ、この値は高分子シグナルの効率的な抑制を提供しつつ、低分子量代謝物共鳴を保持します14。
  2. スペクトル処理を行う:
    1. フーリエ変換スペクトルを取得します。
    2. 0.3Hzの指数線拡幅を適用します。
    3. 位相補正と基準補正を行います。
    4. 0 ppmのTMSP-d4に対する参照スペクトル。
    5. 参照化学シフト(δ)は0 ppmの外部TMSP-d 4 信号にシフトします。
      注:FEPライナー内の試料混合物(225μL)と外部同軸ギャップ内の外部TMSP-d4参照溶液(150μL)は、アクティブなNMRコイル検出ウィンドウ内で異なる物理的形状と体積を占めているため、それらの絶対信号強度は1:1でスケールしません。外部参照を用いた直接的な絶対定量化には、システム固有の幾何学的キャリブレーション曲線が必要です。したがって、このプロトコルの厳密なサンプル体積と高い再現性を持つピペッティング精度を踏まえ、生バケット積分を直接利用してサンプル間の相対的な代謝変動を追跡し、外部参照や総和強度の正規化を不要にしました。
  3. スペクトルビニングの実施:
    1. ビンニング前に水共鳴領域(例:4.65–5.00 ppm)およびTMSP-d4基準領域(例:-0.05–+0.05 ppm)を除外します。
    2. スペクトルを可変幅のバケットに分けてピークを分割しないようにしましょう。
    3. 外部TMSP-d4信号に正規化するのではなく、統計解析には生のバケット積分を使用してください。参照は外側管体積内で物理的に隔離されています。この方法は、インサートと外側チューブの有効体積の違いによる定量誤差を回避します。
    4. 統計解析のための数値データ行列としてバケット積分をエクスポートします。
      注意:各「バケット」(またはビン)は、定義されたppm範囲内のすべてのNMR信号の数値積分を表しています。これらの積分はその範囲内の化学基の相対濃度を反映していますが、単一のバケツには複数の重なり合う代謝物からの信号が含まれている場合もあれば、特定の代謝物全体の信号の一部のみが含まれている場合もあります。

5. 統計分析

  1. nmrglue15を使って1つのH-CPMGスペクトルをPython(v3.12)にインポートしました。
  2. 水とTMSP-d4スペクトル領域を除去します。
  3. 解析のためにバケット積分をエクスポートします。
  4. SciPy(v1.14.1)を使った統計検定を行う:
    1. シャピロ–ウィルク検定を用いて各スペクトルバケットの正規性を評価します。
    2. 正規分布データに対して一方向ANOVAまたはノンパラメトリックデータに対してKruskal-Wallis法を適用し、未使用インキュベートコントロールと使用済みメディアとの間で統計的に有意な差を持つバケットを特定します。
    3. 大きな違いを示すバケットについては、1次元および2次元NMR実験の組み合わせを用いて構造割り当てを行います: 1回のH-13CHSQC、 1回のH-13C HMBC、 1回のH-1H COSY。
    4. 観察された2次元相関を標準データベース(例:HMDB)と比較して、識別バケットに寄与する代謝物の同一性を検証します。

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結果

使用済み胚培養培地の非標的NMR代謝プロファイリングの分析ワークフローは 図1にまとめられています。

サンプリング中のオイル汚染の除去
図2は、オーバーレイオイルのキャリーオーバーを減らすために用いられる逐次液滴移動手順を示しています。慎重なピペッティングを行わずに採取したサンプルは、スペクトルの脂肪族領域にまたがる広範な炭化水素共鳴(δ 0.5–2.3 ppm)を示し、基準線の歪みが大きく、低分子量代謝物信号が遮蔽されました(図3A、緑色のトレース)。対照的に、最適化された逐次液滴移動プロトコルで採取したサンプルは、検出可能なパラフィン油汚染がほぼ完全に除去され、基準安定性が回復し、関心のあるスペクトル領域全体でよく分解された代謝物共鳴が明らかになりました(図3B、黒い痕跡

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ディスカッション

本研究では、非標的NMR代謝体学を用いて使用済み胚培養培地中の低分子量代謝物の同定と定量に関わる主要な解析的課題に取り組みました。私たちの結果は、最適化されたワークフローにより、低分子量代謝物の信頼できる検出に適した高品質で情報豊富なスペクトルの取得が可能であることを示しています。

慎重な逐次滴の移動は、油汚染を減らすために不可欠であることが判明しました。油は広範な共鳴を生み出し、低分子量の代謝物シグナルを隠していました。最適化されたサンプリング手順の実装前後に取得したスペクトルの比較により、検出可能なパラフィンオイル信号がほぼ完全に除去され、代謝物共鳴を遮蔽していた広範な炭化水素背景が効果的に除去されました。主にアルブミンタンパク質から発生する高分子干渉は、信頼できるスペクトル解釈をさらに制限しました。文献で検証された有効T₂フィルター持続時間64 msを用いて実装されたCPMGパルスシーケンスは、高分子共鳴を選択的に抑制しつつ、狭い代謝物ピークを保持するため、背景信号を減衰し代謝物強度を減衰させる超音波検査のよ...

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開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。

謝辞

この作業はスロベニア研究イノベーション庁(ARIS)[プロジェクト番号P3-0327]の支援を受けました。

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材料

```html
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5 mm FEPチューブライナーSP Wilmad-LabGlass4682701同軸NMR用インナーインサート
5 mm NMRチューブSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBアウターチューブ
6ウェル培養プレートOosafeOOPW-SW02胚培養皿
極低温液体窒素Messer製造元に問い合わせサンプルの急速凍結
重水（D2O）EurisotopD214LNMR溶媒
マイクロピペット（10〜100 μL）Eppendorf4924000053調整可能容量ピペット
マイクロ遠心管、1.5 mL、RNaseフリーEppendorfN216966Nサンプルの収集と保存
ミネラルオイルVitrolifeVTL-10029培養液のオーバーレイ
NMR分光器、600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlスペクトルの取得
パスツールピペットFalconFAL-357575液滴の移動
単チャンネルメカニカルピペットSartorius728060サンプルの取り扱い
ピペットチップ、滅菌済みEppendorf22491148マイクロピペットと互換性あり
ピペットチップ、滅菌済みフィルターSartorius790201Fエアロゾルバリア
Sequential Gシリーズ培養液VitrolifeVTL-10143胚培養培地
TMSP-d4（ナトリウム3-トリメチルシリルプロピオン酸-d4）Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1化学シフト基準
チューブ、Safe-LockEppendorf0030121589保存チューブ
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参考文献

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