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方法論記事

共鳴ラマン分光法を用いたミトコンドリア機能のリアルタイム・非侵襲的評価

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DOI:

10.3791/71290

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2026年8月7日

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

この記事について

サマリー

私たちは共鳴ラマン分光法(RRS)を用いてミトコンドリアの健康状態を監視するための非侵襲的かつリアルタイムな方法を提案します。RRSを用いてミトコンドリアの酸化還元状態を定量化し、ミトコンドリア健康の指標であるレゾナンス・ラマン低調ミトコンドリア比(3RMR)を開発しました。これは従来の血液ガス分析物よりも酸素化の変化に対する反応が速いことを示しています。

要約

ミトコンドリアは病因や疾患進行の中心的存在であるものの、ミトコンドリアの健康動態に関するメカニズム的洞察は依然として高コストで入手困難です。このギャップを埋めるため、本研究では共鳴ラマン分光法(RRS)を用いてミトコンドリア機能を評価し、携帯型システムを用いてラット肝臓のミトコンドリアシトクロム酸化還元状態をリアルタイムかつ非侵襲的かつ定量的に測定します。このプロトコルでは、セットアップ、データ取得、データ処理を含むこの技術の利用を実演します。本研究は、RRSがミトコンドリアの酸化還元状態、ひいてはミトコンドリア機能のリアルタイム変化を測定する能力を強調する概念実証実験を提示します。簡単に言うと、RRS装置はレーザーポンプとデータ取得コンピュータに接続され、ラット肝臓から1cm離れた場所に設置されました。 取得パラメータはラット肝臓プロトコルに従って選択されました。酸化還元状態は酸素ストレス試験を用いて酸素化および虚血状態で測定されました。ミトコンドリアの酸化還元状態の変化は酸素ストレス試験全体を通じて追跡されました。

概要

ミトコンドリアは細胞の機能と恒常性において重要な役割を果たします。ミトコンドリアは細胞代謝の主な推進力であり、酸化的リン酸化を通じてATP生成を調節します。また、細胞の運命を決定づけるシグナル伝達小器官としても機能し、アポトーシス経路やROSおよびCa+2シグナル伝達1を制御します。したがって、ミトコンドリア機能障害はさまざまな神経変性疾患、筋肉疾患、心血管疾患を引き起こす可能性があります 2,3。ミトコンドリアは病気の進行に重要な役割を果たしますが、ミトコンドリア機能の評価は侵襲的で費用がかかり、限界がかかることがあります。

酸素消費率、酸化リン酸化、電子伝達連鎖(ETC)内の各種複合体の活性など、ミトコンドリア機能の重要な指標は呼吸計検査で測定されます。ETCは内ミトコンドリア膜(IMM)に埋め込まれた4つの複合体(I–IV)で構成されています。これらの複合体は他の補酵素の助けを借りて、NADHやFADH2などの還元基質から電子を最終電子受容体O2に移し、O2は水に還元されます。シーホースやオロブロスO2kなどの現代的な呼吸測定法の多くは組織処理を必要とし、そのためトランスレーショナルリサーチへの応用が制限されています 4,5。 ミトコンドリア膜電位(MMP)の測定は、JC-1のような陽イオン性脂溶性蛍光体と顕微鏡イメージングを用いて、ミトコンドリア機能障害を評価する別の方法であり、結合(健康)および非結合(損傷)ミトコンドリアが異なる波長で蛍光を発光する現象を用いています。しかし、これらのアッセイは感度が低いこともあります。染料自体も高濃度で高い細胞毒性を持つことがあります5。最後に、呼吸計測と同様に、この技術も組織処理を必要とします。最近では、分光法に基づく技術がミトコンドリアの健康評価に非侵襲的手段として用いられています。例えば、リンを含む代謝物の濃度を測定して細胞代謝を評価するリン磁気共鳴分光法(P-MRS)は、分化を遂げる人工的に脂肪生成組織を特徴づけるために用いられてきました。しかし、この技術には専門的な機器や訓練も必要です。

私たちのグループは最近、共鳴ラマン分光法(RRS)を用いてミトコンドリア酸化還元状態を臓器生存率のマーカーとしてリアルタイムで非侵襲的かつ高度に特異的に測定する技術を実証しました。RRSはミトコンドリア細胞クロムの酸化還元状態の定量に光子の非弾性散乱を用います。ミトコンドリア・シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの分子のヘム基層中のポルフィリン環は、441 nm波長レーザー8で励起すると酸化状態に応じて特徴的なラマンスペクトルを生成します。RRSシステムは441 nmの波長を利用しますが、420 nmおよび405 nmのレーザーも使用可能で、それぞれ異なるシトクロム複合体を優先的に増強します。不明なサンプルから得られたスペクトルは、完全に酸化または還元された完全なミトコンドリアの事前記録ライブラリと照合され、還元ミトコンドリアと全ミトコンドリアの比率、または in situ ETCシトクロムの平均酸化還元状態を算出します。この比率は共鳴ラマン還元ミトコンドリア比(3RMR)として定義されます。

3RMRには3つの異なる計算方法/タイプがあります:ミトコンドリア3RMR(ミト-3RMR)、複合体III3RMR(cIII-3RMR)、および複合体IV3RMR(cIV-3RMR)。これらの各指数は、与えられた成分の総数への割合を算出します。例えば、cIIIの3RMRは、組織内のcIIIの還元した比率(cIII-R/(cIII-O+CIII-R)となります。同じパターンがCivにも当てはまります。したがって、3RMR-cIIIは縮小cIIIとcIII総量の比率、3RMR-cIVは減少cIVとcIV総量の比率を指します。回帰解析により、ミトコンドリアの酸化還元状態(ミト-3RMR)は完全なミトコンドリアのスペクトルライブラリを用いて計算するか、個別の複雑な酸化還元状態(cIII-3RMRおよびcIV-3RMR)はcIIIおよびcIVスペクトルライブラリを用いて計算されます。最近の論文9 では、ミト-3RMRがcIIIおよびcIVのレドックス状態(またはcIII-3RMRおよびcIV-3RMR)の加重平均を代表していることが示されました。cIおよびcIIは441 nm波長を通じてラマン活性や共振増強を行っていません。したがって、ミト3RMRの計算時には計算されません。

これらの3RMRを活用し、最適な範囲を定義してきました。「健康な」臓器では、ミトコンドリアは完全な状態にあり、十分な酸素供給を持っています。一方、損傷した臓器は酸素の供給や利用が不足し、ETC錯体に電子が蓄積することがあります。電子の蓄積は「還元ストレス」を引き起こし、ミトコンドリアを酸化状態から還元状態へとシフトさせ、3RMR値を増加させます。8、9、10、11、12の研究(8、9、10、11、12)は、齧歯類や豚のモデルを用いた心臓と肝臓を対象に、3RMRの最適な「健康」範囲(10から30の間と提案されている)を明らかにし始めています。例えば、Perryらは哺乳類の心臓に低酸素症を投与し、3RMRが30%であることが低酸素組織の検出に最適な感度と特異度のバランスをもたらすことが示されました。この傾向は、心臓組織11、12、肝移植10の追加研究でもさらに確認されました。さらに、Nyugenら9は、代謝が停止した組織において3RMR値が非常に低い(酸化された)値に低下することを示しました。移植不可の温空性肝臓は、3時間の正常な機械灌流後に3RMR(7.667 ±± 4.926)を記録し、新鮮かつ移植可能な温空性虚血肝ではRMR値が3%(約12~15)を超え、9。

3RMRが組織の生存可能性を測定するこれらの実証に加え、感度、特異性、使いやすさにより、細胞代謝やミトコンドリア機能に影響を与える多くの研究にも非常に応用可能です。これまでの研究では、RRSは視神経頭13の網膜神経節細胞の無髄軸索の代謝活動を評価することで、マウスの黄斑変性や緑内障の検出に利用されてきました。さらに、先天性心疾患のラットモデルにおける大動脈共縮症(CoA)の検出にも用いられました。この診断は新生児の心臓検診で見落とされがちです12。この技術は、臓器移植の分野で関連する様々な実験条件下での機能と生存性の理解に活用されました。これには、体外機械灌流による臓器生存可能性の評価(10,11)、静的冷蔵後の再酸素化評価(14)、または温空虚血性肝臓の再灌流損傷の緩和などが含まれます。

本論文は、RRSをミトコンドリアの健康評価におけるリアルタイムかつ感度の高いツールとして確立することを目指しています。ラットモデルの全肝臓を用いて、ミトコンドリア反応を評価するために、さまざまなレベルの虚血および酸素再灌流を行った。この酸素ストレス検査では、新鮮な肝臓に対して5分間の初期灌流、5分間の虚血、5分間の再灌流を受けます。ストレス試験全体を通じて、3RMRおよび乳酸K+、酸素分圧(pO2)の測定が行われました。従来の血液ガス分析物と比較して、3RMRの方が酸素化変化に対する反応が速かったことが観察されました。これらの実験では、RRSの利用は単なる機構的研究だけでなく、診断手法および治療的試験場としても強調されています。したがって、この共有プロトコルはミトコンドリアを研究するさまざまな研究者にとって有用である可能性があります。全体として、非侵襲的でリアルタイムかつ高度に特異的な性質を持つRRSは、細胞代謝に大きな影響を与える可能性があります。

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プロトコル

実験に使われたすべての動物は、国立研究評議会(NRC)のガイドラインに従って管理され、マサチューセッツ総合病院(ボストン、マサチューセッツ州、米国)の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. RRSの設定と活用

  1. 装置の説明:
    注:携帯型RRSシステム(Pendar Technologies;製品は研究目的のみ)は、この波長のミトコンドリア・シトクロムのラマンスペクトルの共鳴増強により、441 nmレーザーを使用しています。レーザーは4 mWから8 mWの間で動作します。
    1. レーザー励起源をファイバー光ケーブルでカスタムプローブに接続します。プローブは直径2mmのレーザースポットを組織に照射し、放出されたスペクトルを収集します。スペクトルはバンドパスフィルタを通過し、電荷結合素子(CCD)アレイで収集されます。スペクトルは180秒の時間枠で毎秒収集され、平均化されて解析用の生でノイズの少ないスペクトルが作成されます。
    2. ソフトウェアは、回帰解析を通じて得られたスペクトルと事前測定済みのスペクトルライブラリを比較します。
  2. 事前録音ライブラリの手順
    注:本論文で発表した実験では、ミトコンドリアの還元および酸化形態、複合体IIIおよび複合体IV、ヘモグロビンおよびミオグロビンライブラリが作成され利用されました。すべてのライブラリのRRS信号は室温(21°C)のブラックボックスで取得されました。これらのライブラリファイルは解析ソフトウェアとともに別途提供されています。しかし、関心のある組織や他のラマン活性分子の存在によっては、以下のプロトコルを適切に適応させることで他のライブラリを作成することも可能です。ヘモグロビン、ミオグロビン、および酸化・還元複合体III/IVライブラリーの生RRSスペクトルは以下の通りに提供されています。 補足図1。
    1. ヘモグロビンライブラリー(補足図1C):
      1. 動物の出血による新鮮な齧歯類の血液を集めましょう。集めた血液を100%酸素で酸素化するか、100%窒素で脱酸素し、ガラスのキューベットに二チオネートナトリウムを加えます。
      2. 各状態のRRSをガラスキュベットの壁越しに10分間測定し、RRSプローブはガラスキュベットから9mm離れた位置に置きます。
      3. 1356 cm-1 のスペクトルピークを用いて脱酸素状態を、1376 cm-1 のピークを用いて酸素状態を確認しましょう。
    2. 還元/酸化されたミトコンドリアライブラリー(図1)
      1. 均質化・精製された齧歯類の心臓からガラスのキュベットでミトコンドリアを分離します。ガラスのクヴェットから9mm離れた場所にラマンプローブを置き、ガラス壁を通してこれらのミトコンドリアのスペクトルを測定します。
      2. ミトコンドリアに100%の酸素供給を提供することで、完全に酸化した状態を作り出します。1357 cm-1の還元RRピークが存在しないことで酸化状態を確認します。
      3. ミトコンドリアを100%窒素に少量の硫化水素を曝露し、完全に還元条件を作り出します。1371 cm-1の酸化RRマーカーピークが存在しないことで、条件の減少を検証します。
    3. 酸化・還元複合体III/IV(補足図1A,B):
      1. 他の場所で説明されている複合体IIIおよびIVを9,15,16,17。簡単に言えば、単離ミトコンドリアのストックサンプル(200ナノモルのシトクロムa相当)を出発物質として使用します。
      2. ミトコンドリアを氷温バッファーC(50 mM Tris、1 mM MgSO4、pH 8.45)で10 nmolシトクロムA/mLに希釈します。次に、氷の上で優しく混ぜながら、n-β-D-ドデシルマルトシド(DM)を1滴ずつ1滴ずつ加えます。
      3. 抽出物を40,000 × gで40分間、4°Cで遠心分離します。 上清液を、交換樹脂で充填した2.5cm×20cmのガラスカラムに塗布し、バッファーC(0.02%のw/v DMを含む)5カラムで平衡させています。
      4. バッファーCの2カラムで洗浄した後、同じバッファー内に0–400 mMの直線的なNaCl勾配を適用してミトコンドリア錯体を洗脱し、4 mLの分割でエライトを採取します。
      5. 複合体IVを含む緑色の分画は勾配の中央付近(約180 mL NaCl)で溶出し、その後に複合体IIIを含む赤色の分画が現れました。各複合体を含むプールされた画分を20〜30 nmのシトクロムa/mLに濃縮します。
      6. 個々の錯体が分離されたら、それぞれを酸化および還元条件にさらします。Trisバッファー中の複合体IIIの11mMサンプルを還元し、アスコルビン酸2mL(1M)を用いてシトクロムc1を還元し、HS(ヒドロ硫酸塩)2mLを用いてシトクロムbLおよびbHを完全に還元します。
      7. Trisバッファーで18.67 mMの複合体IVサンプルを複数段階で還元します。なぜなら、複合体IVは多段階の触媒酸化プロセスを経るからです。複合体IVを完全に還元するには、H22 mL(10 mM)を2 mL、その後HS 2 mLを加えます。
      8. 各追加後にライブラリスペクトルを収集し、サイクルの各ステップを捉えましょう。最終的な基準ライブラリに完全に酸化され還元されたスペクトルを追加し、複体IVの定常状態を表現します。
      9. すべてのサンプルを1mLのガラスバイアルに準備し、プローブレンズから9mm離れた位置に固定して保管し、ブラックボックスに封じて光の汚染を防ぎます。各錯体および酸化状態ごとに600秒のRRSスペクトルを収集します。
      10. 前述の分離されたcIIIおよびcIVの純度を検証し、最近の論文9で記述された全ミトコンドリアスペクトルを説明する上で、分離されたcIIIおよびcIVスペクトルライブラリの適切性を検証します。
    4. マイオグロビンライブラリー(補足図1D):
      1. 同様の酸素と窒素(溶解ジチオナイトを含む)流量を用いて、心筋ミオグロビン抽出物のオキシミオグロビン飽和度を0%から100%の範囲で変化させます。1355 cm-1 および1376 cm-1のマーカーピークを通じてラマンスペクトルを検証してください。

注:上記のヘモグロビンや酸化・還元ミトコンドリアなど、ほとんどのスペクトル成分はヘムを含む分子であり、同じ波長で励起されます。このRRSシステムは、各分子の固有のスペクトル信号に基づいて回帰ライブラリを作成することで、信号の重複を回避します。得られた散乱スペクトルは、選択されたライブラリに対して回帰アルゴリズムで解析されます。回帰アルゴリズムは、各ライブラリスペクトルに対して、記録されたスペクトルにおける相対的な寄与、ひいては組織内の相対濃度の最適適合推定値を示す因子を導き出します。このアルゴリズムは波数範囲にわたる最適な適合を用いるため、各ライブラリ成分のスペクトルピークの位置や強度のわずかな差から、回帰分析では近縁なクロモフォアでも識別できます。回帰アルゴリズムとスペクトルライブラリを通じて、RRSシステムは散乱信号をそれぞれ固有のスペクトルピークに応じて様々な成分に分解し、ヘムを含む分子からの信号重複を回避できます。ヘモグロビンとミトコンドリアの関係を示すために、 肝 臓灌流から取得したスペクトル画像を、測定信号、最適適合線、個々のスペクトルピークの違いから生じる説明のつかない残差の画像を掲載しています。パネルAでは、還元および酸化されたヘモグロビンおよび還元および酸化されたミトコンドリア回帰ライブラリーが選択されます。ライブラリと回帰解析を通じて選ばれた最適フィットのラインは測定信号ときれいに重なり、説明のつかない残差はほとんどありません。パネルBでは、酸化および還元されたミトコンドリアライブラリのみが選択されます。大きな未解明の残留構造があるため、ミトコンドリアのスペクトルピークは回帰解析に含まれていなかったヘモグロビンのピークから数波数ずれています。さらに、Nguyenらの補足図9では、ミトコンドリアと個々の複合体(cIIIおよびcIV)の関係、さらに個々の複合体16の関係について説明しています。すなわち、複合体IIIはより鋭く低周波のピークを示し、複合体IVはより広く向上シフトした帯域を示します。さらに、著者らは還元された複合体IIIおよび複合体IVライブラリが、還元された全ミトコンドリアの測定スペクトルを完全に説明し、未説明の残留物を最小限に抑えていることを示しました。

figure-protocol-1
図1:完全に酸化・還元されたミトコンドリアのスペクトルライブラリー。 RRSライブラリスペクトルは、単離ミトコンドリアに(A)100%酸素または100%窒素(B)を与えてそれぞれ酸化状態と還元状態に到達させた後に得られました。これらの状態は、RR(C)の酸素化および低減(D)マーカーピークの存在によって確認されました。これらのピークのシフトは、酸素が存在するときの分子振動モードの変化に対応します。各ピークの強度は1任意の強度単位(AU)に正規化されており、この441 nm励起波長を使うことで還元状態の強化がより大きくなります。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. RRSを用いたデータ収集

  1. 機器の設定:
    1. 分光器ユニット(コンパクトボックス内に収められている)を直流(DC)電源と電源アダプターに接続し、付属のケーブルを使用します。分光器ユニットはアライメントインデント付きの丸いプラグが1つあります。
    2. 丸いプラグのくぼみを電源アダプターに接続するケーブルの凹みに合わせて合わせてください。ポート接続前の清掃は不要です(図2)。
    3. 解析を行うコンピュータを、付属ケーブルを使って分光器と電源を接続する同じ電源アダプターに接続します。
    4. レーザープローブをプローブホルダーに入れます。実験開始時にこのプローブの位置を調整してください。
    5. 分光計制御ソフトウェア(セルラーエネルギーソフトウェア)を開きます。
  2. ソフトウェア設定:
    注:システムには異なる種類の組織の設定ファイルおよび回帰ライブラリが付属しています。これらのファイルには、RRSシステムが回帰分析に含めるべきライブラリ、回帰ウィンドウに含まれるスペクトル数、レーザー出力などのパラメータが含まれています。デフォルト設定は変更可能で、新しい設定ファイルを保存して将来の実験で使うことができます。以下に詳述するソフトウェアのスクリーンショットは 補足図3に示されています。
    1. 分光計制御ソフトを開くと、3RMR、酸素飽和度(StO2)、ミオグロビン飽和度の割合を示すグラフが表示されます。この画面では、これらの指標を選択した場合、測定中にリアルタイムで表示されます。ページ左下の 設定 タブをクリックしてください。
    2. 情報タブの「セッション名」にセッション情報を入力し、必要な詳細は「セッション説明」タブに入力してください。
    3. データ収集モードは2つあります。 スポットチェック モードを使ってスペクトルを蓄積し、指定された品質指標(例:ターゲットシグマや回帰のウィンドウ/スペクトル数)を満たしたら記録を停止します。ストップボタンを押すまでスペクトルを連続 モードで 記録します。両モードともに、3RMR結果および個別スペクトルを含むすべてのデータが自動的に保存されます。この実験は 連続モードを利用しています。
    4. すべてのセッション情報を入力したら、「 システム 」タブをクリックします。
    5. 設定ファイルでプロジェクトに適したプロトコルを選択してください(無細胞ラット肝臓灌流の場合はラット肝無細胞プロトコルを選択してください)。これにより、測定タイプ、平均測定時間(回帰ウィンドウ)、およびターゲットシグマが自動的に調整されます。
      1. 新しい設定ファイルを作成するには、上記のコンポーネントのいずれかを調整し、 その後「保存 」ボタンをクリックしてください。これにより、これらのパラメータは別の設定ファイルとして保存され、システムにインポートできます。
      2. 新しい設定ファイルをインポートするには、「 デフォルト(モッド) 」のドロップダウンメニューをクリックし、「 新しい設定ファイルをインポート」を選択してください。新しい 設定ファイル をクリックしてインポートしてください。
    6. 回帰ライブラリでは、データ取得および解析に使用されるライブラリの組み合わせを選択し確認します。この実験では、還元および酸化ミトコンドリア(ミトのみ)のライブラリーが選ばれました。他のユーザーは、上級ライブラリに含まれるヘモグロビン、ミオグロビン、その他の複合体を含むライブラリを選択することもできます。
    7. 希望する ウィンドウ幅モードを選択して確認してください。
      1. 適応幅モード: 適応幅 モードを使って平均化されたスペクトルに個々のスペクトルを追加し、最大シグマ目標に達するまで続けます。シグマ目標に到達しなければ、設定された回帰ウィンドウの上限(すなわち記録するべき最大スペクトル数)に達した時点で記録は停止されます。最小シグマ目標に到達した後、測定結果は画面に表示されます。
      2. 固定幅モード:目標スペクトル数を含めるまで、平均化されたスペクトルに 個別 スペクトルを追加します(平均長さ以下に設定)。
    8. システム設定が完了したら、 プロット タブをクリックします。
    9. メインシリーズで、測定時にプロットして画面に表示する部品を選択します。
    10. 選択したすべての測定成分が対象のプロトコルに準拠していることを確認してください。
  3. データ取得:
    注意:ラマン測定は暗い空間で行うべきです。データ取得を始める前に、作業スペースができるだけ光から遮蔽されていることを確認してください。部屋を完全に遮断できない場合、RRSシステムは中央に長方形の開口部がある黒いカバー(参照:参照)でカバーを装着しています 図2レーザープローブを装着することができます。箱はRRS測定が行われるサンプルや臓器の部分を覆うことができます。RRSレーザーを使う際は、直接または長時間の眼への曝露を避けてください。レーザーを直接目や反射面に照射しないでください。レーザーは対象の組織に直接位置する場合にのみ起動してください。RRSレーザーは4 mWで使用した場合はクラス3R、10 mWで使用した場合はクラス3Bに分類されます。レーザーは組織接触に安全です。
    1. 適切な事前保存済みの設定、録画パラメータ、ライブラリファイルを選択します。
    2. レーザープローブを目的の組織や臓器の真上に置きます。プローブはできるだけ直角に、組織から1cm離して位置付けます。定規を使ってオルガンの表面から正確に1cmの距離を測ってください。信号がクリアでない場合は、プローブを1cmより近く位置に調整してください。ただし、プローブが組織に触れないように注意してください。
      注意:プローブは手持ちでも構いませんが、調整可能で安定するプローブホルダーやスタンドの使用が推奨されます。プローブはできるだけ直角に、組織から1cm離して位置付けます。定規を使ってオルガンの表面から1cmの距離を正確に測ることもできました。信号がクリアでない場合は、プローブを1cmより近づけるように調整することも可能です。ただし、プローブは組織に触れてはいけません。
    3. レーザースポットが左側葉、門脈にできるだけ近い位置にあるか確認してください。
    4. 選択したライブラリ、回帰設定、ターゲットシグマ、回帰ウィンドウ、取得モードが正しく、望ましいものであることを確認しましょう。
      1. 部屋はできるだけ暗くしてください。プローブに特に血液などの汚染が入っていないか確認してください。汚染がある場合は、70%イソプロピルアルコールを含む綿くりのない非研磨性ワイプでクォーツの窓を清め、その後ドライワイプでしっかり乾燥させてから作業を進めてください。
      2. 重度の汚染がある場合は、上記の通りプローブをできるだけ徹底的に拭き取ってください。次に、レーザーを黒いテープで覆った暗い筐体に入れて「 Take Dark 」ボタンを押して機器をキャリブレーションします。キャリブレーションには約5〜10分かかります。汚染の有無にかかわらず、月に一度キャリブレーションすれば自動的にリマインダーメッセージを送信します。
        注:各品質管理指標の説明、そのようなQC指標の例、および最適および非最適記録から得られる生スペクトル信号(補足ファイル1、 図3、 補足図3)。これらの品質管理基準は、ラットモデルから肝臓全体に対して最適化されました。異なる臓器・動物モデルを用いた新たに開発されたプロトコルは、これらの指標を適切に洗練・調整すべきです。
    5. メインページで「 スタート 」ボタンをクリックしてデータの取得を開始します。選択した設定によって、ソフトウェアは目標誤差値(シグマ)または180秒に達するまで記録を続けます。データ収集は完了しました。
      1. これらのプロットと値からRRS信号の品質を推定し、プローブ位置や測定条件の調整を可能にします(図3)。もし得られたRRS信号がこれらの品質管理基準を満たさない場合は、プローブをできるだけ垂直に、かつ表面からプローブ窓から約9mmの角度に調整してください。
    6. データ取得や実験プロトコルが完了したら、肝臓や組織全体をバイオハザードビンに捨ててください。臓器や組織に接触したシステムや表面は70%エタノールで洗浄してください。
      1. 灌流システムを使う場合は、酵素洗浄剤(7.8mLを脱イオン水1Lに希釈した)を混ぜたDI水を流し、その後きれいなDI水を流します。
        注意:各録画は新しいセッションファイルの下に別個の解析ファイルとして保存されます。3RMRおよびミトコンドリア信号強度(r3RMR)の結果はメインウィンドウにプロットされています。生スペクトルも表示可能です。残留信号強度や総信号強度などの品質チェック指標は 、スペクトラム タブに表示されます。
  4. データ分析:
    1. データ取得が完了したら、画面下部の Review フォルダをクリックして実験ファイルを開き、結果を確認します。
    2. あるいは、結果を含むテキストファイルを開いてみてください。興味のあるセッションファイルを選択します。すべての測定結果を含む解析ファイルが開きます。各パラメータとそのシグマ値はそれぞれ別の列を持ちます。例えば、1秒ごとに得られる3RMR値は「3RMR」欄に、そのシグマ値は「sigma_3RMR」欄に記載されます。
    3. 各列の最後の行には、そのセッションファイルの各パラメータの最終値が記載されます。この値をプロットに使います。
    4. 各セッションファイルや録音ごとに手順を繰り返します。プロットは望む値を獲得しました。

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図2:RRSデバイスの設定。 RRSシステムの構成図。プローブは光ファイバーケーブルを介してRRSシステムに接続されており、RRSシステムにはレーザー励起源と分光器が内蔵されています。このセットアップは、分光計制御アプリを搭載したノートパソコンに接続してデータ収集と分析を行います。コンピュータと分光計ユニットの両方が電源コンセントに接続されています。RRSの測定は暗闇の中で行うべきです。部屋を完全に遮断できない場合、RRSシステムは中央に長方形の開口部を持つ黒いカバーを備えており、そこにレーザープローブを置くことができます。箱はRRS測定が行われる臓器のサンプル/部位を覆っています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:最適品質および最適品質痕跡の例と品質管理指標。 残留信号(ノイズ)はオレンジの括弧で、ミトコンドリア信号は緑の括弧で示されます。(A) 最適でないラマン信号からのトレース例。残留信号はミトコンドリア信号と区別するには大きすぎます。スペクトルピークは測定信号全体で区別できません。(B) 最適ラマン信号からのトレースの例。ミトコンドリア信号は残留信号とは明らかに大きく、区別されます。得られた測定値からのスペクトルピークは識別可能です。(C) 各信号から得られる品質管理指標。全体として、最適でない読み取り値で得られる総信号は最適読み取り値よりも小さいです。最適記録では、ミトコンドリア信号が非最適記録に比べて多く測定され、ミトコンドリア信号はそれぞれ全体の17%と14%を占めています。最適読み取りでは誤差4.3%、最適でない読み取りでは誤差が18.5%でした。同様に、説明不能の残差信号は最適でない記録では全体の信号の11%を占めますが、最適記録では3.6%を占めます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. RRSを用いたミトコンドリアの健康評価

注:共鳴ラマン分光法(RRS)技術を用いて、移植臓器の生存可能性を示すミトコンドリア生存率指標(3RMR)を開発しました。本研究は、酸素化の変化、ひいては細胞呼吸の変化が、乳酸やK+などの従来の損傷バイオマーカーと比較して3RMRトレンドにどのように反映されているかを示すことを目的としています。ここでは酸素ストレス試験が用いられ、5分間連続灌流した後、酸素入り灌流の流れを5分間停止し、その後5分間再開します。ストレス試験中はRRS測定や流入・流出の灌流サンプルが測定されます。

  1. 肝臓の取得:
    1. 誘導チャンバーで3%–5%のイソフルランを用いて動物を鎮静させます。余分な蒸気は活性炭でろ過します。
    2. オスのルイスラットに全肝摘出術(150g)を行ってください。門脈の枝を結紮します。下腔内静脈から50 Uのナトリウムヘパリンを注射します。手術中は16Gのカテーテルで門脈をカニューレし、肝臓は生理食塩水50mLで洗浄します。
    3. 採取した肝臓を、ウィスコンシン大学(UW)の溶液30mL入ったペトリ皿に氷入れします。
  2. サブノーマミック機械灌流(SNMP)セットアップおよび共鳴ラマン測定:
    1. 前述の方法でRRSデバイスをセットアップします。分光計制御ソフトウェアで 無細胞ラット肝プロトコル を設定すると、 幅モード を自動的に 適応幅に、平均長さを180に、ターゲットシグマを1.5に設定します。また、測定パラメータとして 3RMR と 蛍光 を選択し、回帰ライブラリとして ミトのみ を選択します。取得モードを 連続モードに設定してください。
    2. 他の場所で説明されているようにSNMPシステムをセットアップしてください。18。
      1. 簡単に言うと、灌流装置が灌流室、蠕動ポンプ、膜酸素装置、バブルトラップで構成されていることを確認しましょう。
      2. 大気中の酸素混合気(95%O2 、5%CO2)を供給します。pO2 は400〜500 mmHgの範囲に保ちます。肝内圧を圧力センサーで監視し、3〜5 mmHgの範囲に保ちます。サンプルをサンプリングポートから採取してください。
    3. ソフトウェアと灌流システムがセットアップされたら、PVを貫通するカニューレを灌流装置のインフローチューブに接続します。臓器、灌流液、灌流のセットアップは常温(21°C)で保ち、水浴の助けを借りずに維持してください。
    4. パルフューゼをPV内のカニューレを通じて蠕動ポンプを使って臓器に送ります。
      1. 調製には、フェノールレッドフリーウィリアムズ培地500 mLに5gの牛血清アルブミン(BSA)、12 mgの水溶性デキサメタゾン、5 mLのペニシリン・ストレプトマイシン、5 mLのL-グルタミン、2.5 μLのインスリン、1000 Uヘパリンを混ぜます。
      2. すべての成分をかき混ぜ盤で約20分間かき混ぜ、または全ての成分が溶けるまで続けます。灌流流量を増加させ、圧力を3〜5 mmHgにします。
    5. 次に、RRSレーザー源をプローブホルダーに挿入し、肝臓の最大の葉の1cm上、PVにできるだけ近い位置に位置させます。5分(T5)で灌流を一時停止し、10分(T10)に再開します。ストレステストは15分(T15)に実施してください。
    6. ストレステスト全体を通じてRRS測定を行い、T0から5分ごとに流入と流出を測定します(図4)。 3RMR値、およびT0、T5、T10、T15(n = 3)の流出K+レベルおよび乳酸レベルをプロットします(図5)。
    7. 酸素の流入・流出分圧(pO2)に血漿中の酸素溶解度係数(0.00314)を掛けて、T0,T 5, T10, T15での酸素消費率(OCR)を計算します。T0、T5、T10、T15のOCRをプロットします(図5)。
      注:片方の肝臓からの灌流状態(T5)、虚血性(T10)、再灌流状態(T15)における例例的な共鳴ラマンスペクトル痕跡を示しています(図6)。

figure-protocol-4
図4:実験フローを示す図。ルイスラットの雌に対して全肝摘出術が行われました。調達した肝臓はサブノーママムの灌流装置に入れられ、最初の5分間は酸素入り灌流液が投与されました。灌流液は門脈を通って肝臓に流れ込み、蠕動ポンプ(青い矢印で示された灌流流)を通って再循環します。酸素灌流はT5で5分間停止し、T10でさらに5分間再開されました。3RMR測定はストレステスト中に測定されました(レーザーとして示されています)。混入剤サンプルはT0、T5、T10、T15で採取されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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結果

新鮮な肝臓は酸素ストレス検査を用いて虚血と再灌流の期間を受けました。その後、ストレス試験全体を通じて3RMRのリアルタイム変化を、T0、T 5、T10、T15の硫化液分析から得られる酸素消費率、流出乳酸、カリウムと比較しました。健康条件下では、3RMR値は10%から30%の間で期待されます(図5A)。予想通り、T0およびT5の3RMR値はこの範囲内に収まります。これは、肝臓がこれらの時点の間に継続的に酸素入り灌流液を供給されていたためです(図5A)。しかし、虚血期終了時の3RMR値は最適範囲外です(図5A)。この増加は、脱酸素化によって電子が輸送連鎖全体で蓄積されるため、ミトコンドリアが還元状態に移行していることを示しています。T1...

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ディスカッション

本研究は、レーザーをコンパクトなプローブに装着し、光ファイバーケーブルでレーザーポンプに接続した携帯型共鳴ラマン分光システムを用いて、非侵襲的でリアルタイムかつ高感度のミトコンドリア健康を定量化する方法を強調しています。この方法は441 nmレーザーを用いてミトコンドリアを励起し、酸化状態に応じて独自のスペクトル信号を発生させます。したがって、RRSはミトコンドリアの各状態をスペクトルシグネチャを通じて定量化し、回帰解析を用いて放出されたスペクトルと事前測定済みのスペクトルライブラリを比較することができます。その後、ミトコンドリア健康指標として、減少したミトコンドリアと総ミトコンドリアの比率に基づく、低共振ラマンミトコンドリア比(3RMR)が作成されました。

本論文は、サンプル処理を必要とせずに、天然組織との酸素化による3RMRのリアルタイム変化を示すことに焦点を当てています。これは酸素ストレス試験によって達成されました。5分間の連続酸素灌流後、灌流を5分間停止し、さらに5分間再開します。ストレステスト中は3RMR...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を宣言しています。S.N.T.およびP.R.は本研究に関連する暫定特許出願を行っています。P.R.はPendar Technologiesの従業員であり株主です。S.N.T.は、MGHおよびパートナーズ・ヘルスケアが利益相反ポリシーに従って管理しています。J.N.Kの対立する利害はBCHの利益相反政策によって管理されています。本研究で使用された特許技術は以下の通りです:US2020/0281474A1 ラマン分光法を用いた細胞エネルギーの 体内 モニタリング(応用)。眼科、組織の生存可能性、共鳴ラマン分光法を用いた火傷損傷評価に関する追加の特許出願も提出されており、R.J.はこの分野の発明者でもあります。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(R01DK134590)からの寛大な資金援助によって支援されました。また、米国国立衛生研究所(K99/R00 HL1431149からのS.N.Tへの資金提供にも感謝いたします。R01HL157803;R24OD034189)、国立科学財団(EEC 1941543)、ポルスキー・ファミリー財団、シュライナーズ・チルドレンズ・ボストン(グラント #BOS-85115)などが含まれます。さらに、米国肝疾患研究協会財団からの助成金 #LIFER23-263034によるR.J.への資金提供にも感謝いたします。著者らは、組織学研究のためにハーバード医科大学の病理コアからの専門家支援に深く感謝の意を表しています。NIH国立心肺血液研究所のロバート・バラバン博士とアルメル・フェムヌー博士には、ミトコンドリアエネルギー学に関する専門知識と、個々のミトコンドリア複合体のRRSライブラリー開発に重要な支援をいただき、心より感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16 Gカテーテル BD Insyte Authoguard381454門脈へのカニューレ挿入に使用
活性炭Vet Equip Vapor Guard 活性炭931401麻酔中の過剰な蒸気をフィルターする
BSA Sigma-Aldrich A7906灌流液の組成
バブルトラップ Radnoti130149
デキサメタゾンSigma-AldrichD2915灌流液の組成
グルタマックス Thermo Fisher Scientific35050061灌流液の組成
Masterflex L/S精密ポンプチューブ（24 G）Fisher Scientific 13-200-292肝臓を通して灌流液を流すのに使用
Masterflex蠕動ポンプ Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 肝臓を通して灌流液を流すのに使用
膜型酸素化器 Radnoti130144灌流液を酸素化するために使用。 
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma-AldrichP4458灌流液の組成
RAPIDPoint 500血液ガスシステムSiemens Healthineers41115805血液ガス分析用
共鳴ラマンシステム  Pendar TechnologiesA4D441この製品に関する問い合わせはPendar Technologiesに問い合わせてください

参考文献

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  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
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