ヒト乳がんオルガノイドの構築およびドキソルビシン誘発DNA損傷の彗星アッセイに基づく定量化

サマリー

このプロトコルはヒト乳がんオルガノイド(BCO)モデルを構築し、コメットアッセイを用いてドキソルビシン誘発性DNA損傷を定量的に評価します。コメットアッセイをBCOに適用する実現可能性が示され、DOX誘発DNA損傷の検出のための再現可能で拡張性があり運用可能なワークフローが提供されています。

要約

乳がんは世界中の女性に最も多い悪性腫瘍であり、かなりの多様性を示しています。ドキソルビシン(DOX)は乳がん治療に広く用いられており、その主な作用機序はDNA二本鎖切断を誘発し、細胞死を引き起こすことです。このプロトコルでは、DOX誘発DNA損傷を定量的に評価するためのヒトBCOモデルが確立されました。原発乳がん細胞は、患者由来の腫瘍組織から機械的および酵素的解離によって単離され、その後三次元マトリックスで培養されてBCO(BCOs)を生成しました。オルガノイドは8μM DOXで2時間処理され、2時間後にDNA損傷が評価されました。処理後、オルガノイドは単細胞に解離され、低融点のアガロースに埋め込まれ、アルカリ性条件下で電気泳動されました。電気泳動の後、DNAの移動パターンは蛍光顕微鏡下で彗星構造として可視化され、OpenCometソフトウェアを用いて尾部DNAの割合(尾部DNAの割合)を定量的に解析しました。彗星アッセイはBCOのDNA損傷を成功裏に検出しました。対照群と比較して、8μM DOXに2時間曝露されたBCOは、オルガノイド解離および電気泳動後に細長い彗星尾を示しました。定量解析の結果、治療群の尾部DNAの割合が有意に高く、DNA損傷の誘導を示しました。この高感度な手法はDOXの毒性学的および薬理力学的研究を支援し、患者由来BCOシステムにおけるDNA損傷を評価するための堅牢な技術的プラットフォームを提供します。

概要

乳がんは、遺伝的変化、ホルモン調節障害、その他の病原性要因により乳腺上皮組織から発生する悪性腫瘍です。これは世界中の女性に最も多い悪性腫瘍であり、独自の疫学的パターンと腫瘍内の多様性が著しいものを示します^1,2。DOXは第一選択の化学療法薬であり、DNAに挿入し、トポイソメラーゼII活性を阻害し、DNA鎖の切断を誘発して最終的に腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こします^。従来の二次元細胞培養システムは、乳がんの複雑な細胞組織や異質性を再現する能力に限界があります。対照的に、BCOは患者の腫瘍組織から派生した三次元構造であり、元の腫瘍の細胞組成、組織構造、分子表現型などの重要な特徴を保持しています。特に、BCOモデルは臨床薬物反応と高い整合性を示しています。特定の治療薬について、BCOと対応する患者⁴の間で陰性反応の一致率は100%に達し、正性反応の一致率は98%に達します。

BCOは、原発腫瘍の主要な構造的および機能的特徴を再現する先進的なin vitroモデルとして機能し、腫瘍形成、疾患進行、^{治療抵抗の}調査に広く応用されています。乳がんにおける腫瘍の初期発生は、通常、TP53、PTEN、RB1、NF1などの複数の腫瘍抑制遺伝子の協調的な不活化に依存しており、単一遺伝子の変異だけでは正常な乳腺上皮の悪性変化を促すには不十分です。この過程には細胞極性の喪失、構造的混乱、制御不能な増殖が伴います ^6,7,8。

コメットアッセイ(単細胞ゲル電気泳動、SCGEとも呼ばれる)は、単一細胞レベルでDNA損傷を評価する古典的な方法です。この技術は1978年にリドバーグとヨハンソンによって初めて導入され、その後オストリングとヨハンソンによって改良され、DNA二本鎖断線を検出するための中性彗星アッセイを確立しました。1988年、シンらはアルカリ電気泳動条件を取り入れ、DNAの単一鎖断線、非塩基性部位、アルカリ不安定病変の検出を可能にし、アッセイの^{適用範囲を大幅に}拡大しました。彗星アッセイの基本原理は、DNA電気泳動移動度がDNAの完全性に依存するということです。アガロース埋め込みと細胞膜やタンパク質の除去による溶解の後、損傷したDNA断片は電気泳動中に陽極に向かって移動して「彗星尾」を形成しますが、負荷部位近くには完全なDNAが残り「彗星頭」を形成します¹⁰。尾の長さ、尾部DNAの割合(尾部DNAの割合)、オリーブ尾端といったパラメータにより、DNA損傷の半定量的または定量的な評価が可能となり、時間経過実験設計を用いてDNA修復能力を評価することができます。高感度、サンプル入力量の低さ、そして比較的手続きの簡便さから、彗星アッセイは遺伝毒性学、がん生物学、薬物反応研究、特に化学療法薬や放射線療法によるDNA損傷の評価、腫瘍細胞耐性機構の評価に広く利用されています。このアッセイは実験条件や手順の変動に非常に敏感であり、再現性や実験室間比較可能性は標準化されたワークフローと自動画像解析に依存します¹¹。近年では、ハイスループットイメージングソフトウェア、オルガノイドモデル、遺伝子編集システムの導入により、コメットアッセイのDNA損傷や修復メカニズムの調査、腫瘍治療反応の評価における有用性がさらに高まっています。

従来のDNA損傷アッセイ(γ-H2AX免疫蛍光染色やフローサイトメトリーなど)と比較して、コメットアッセイは単一細胞レベルで物理的なDNA鎖切断を直接定量する手段を提供します。この方法論は特定のタンパク質発現や抗体特異性に依存しないため、細胞周期状態の変動やDNA損傷応答経路の異常による偽陰性結果を効果的に排除します¹²。さらに、従来の二次元単層培養とは異なり、本研究で用いられた三次元オルガノイドモデルは、in vivo腫瘍の複雑な空間構造、細胞外マトリックス相互作用、薬物浸透勾配をより忠実に再現しています。従来の細胞株モデルは人工薬物の過剰曝露による遺伝子毒性を過大評価することが多いですが、オルガノイドプラットフォームは臨床生理学的条件に密接に似た微小環境内でDOX誘発DNA損傷を評価するため、このスクリーニングパラ^ダイムの信頼性と翻訳価値を大幅に高めています。

本研究で確立されたDNA損傷評価のためのオルガノイド統合彗星アッセイには大きな利点がありますが、その実用的な実装には、サンプル入力に関連するいくつかの技術的制約や適用パラメータを慎重に考慮する必要があります。このプロトコルでは、オルガノイドの徹底的かつ穏やかな酵素解離が求められ、非常に有効性の高い単細胞懸濁液が得られます。基底膜マトリックス100μLあたり15,000〜20,000個の原発乳がん細胞(~200細胞/1μL)のシーディング密度は、強固な球形成に必要な細胞間パラクリンシグナル伝達を維持しつつ、高密度や急速な栄養枯渇による中心壊死を防ぎます。治療ウィンドウに関しては、過剰な細胞死(>20–30%)を防ぐために、DOX濃度と曝露時間の慎重な校正が必要です。致死性薬物曝露は大量の「ハリネズミ」彗星を生み出し、これが正当なDNA損傷信号を曖昧にし、データの解釈を混乱させます。アッセイの限界に関しては、標準アルカリ彗星アッセイの本質的にスループットが低いため、ハイスループット薬物スクリーニングには不十分です。さらに、この技術は、ゲルの接着安定性、アルカリのアンワインド時間、電気泳動の均一性などの実験手順の厳格な標準化を要求します。なぜなら、わずかな操作偏差でも重大なシステム誤差を引き起こす可能性があるからです。

結論として、本プロトコルはヒトのBCO(BCO)を確立し、コメットアッセイを用いてDOX誘発DNA損傷を定量化する可能性を示しています。完全に確立されたBCOに対して8μM DOX処理を行った後、コメットアッセイを用いてDNA損傷を評価しました。このアプローチにより、DOX誘発DNA損傷の安定的かつ直接的な評価が可能となります。

プロトコル

本研究は蘇州武中人民病院倫理委員会(承認番号20251w03)により承認され、医療倫理基準に従って実施されました。本研究のすべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. ヒューマンBCOの構築

1. 乳がん組織の輸送と貯蔵
   1. 新鮮に切除したヒト乳がん組織を、事前に冷却された保存液(4°C)に直ちに置きます。
      注意:輸送中は組織が完全に浸かっていることを確認してください。
2. 乳がん組織の機械的解離
   1. すべての手順はバイオセーフティキャビネットで行ってください。乳がん組織を6cmの培養皿に入れ、無菌メスと鉗子を使って見える脂肪組織を除去します。
   2. 6cmの培養皿にPBS3mLを加え、組織を3回洗います。
   3. リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)を吸引して廃棄します。
   4. ステップ1.2.2と1.2.3をさらに2回繰り返します。
   5. 乳がん組織を無菌外科用ハサミで1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移し、約2×5mmの小さな断片に切断します。
3. 乳がん組織の酵素的消化
   1. 1.5 mLのマイクロ遠心分離管に1 mLのオルガノイド解離液を加え、懸濁液を15 mLの遠心分離機管に移します。
   2. さらに8 mLのオルガノイド解離溶液を15 mLの遠心分離機チューブに加えます。
   3. 15mLの遠心分離チューブを37°Cで40分間培養します。
   4. 消化中は10分ごとにシェイカーのチューブを1分間攪拌します。
   5. 40分後に15mLの遠心分離管に6 mLのPBSを加えて消化を終了させます。
      注意:酵素活性を止めるために消化混合物に直接PBSを加えてください。
4. 原発乳がん細胞の単離とオルガノイド埋め込み
   1. 100μmのセルストレーナーを50mLの遠心分離機チューブに置きます。
   2. 細胞ストレーナーに1mLの完全培養培地を加えます。
      注意:完全な細胞培養培地は、基礎培地500mL、胎児用牛血清50ml、ペニシリン・ストレプトマイシン5mlを使用して準備してください。
   3. 15mL遠心分離チューブから消化組織懸濁液1mLを吸引し、細胞ストレーナーに塗布します。
   4. ステップ1.4.3を繰り返し、サスペンション全体がストレーナーを通過するまで続けます。
   5. 細胞ストレーナーをさらに1mLの完全培養培地で洗い流します。
   6. 50 mLの遠心分離チューブを350 × gで4°Cで3分間遠心分離します。
   7. 吸引して上清液を捨てます。
   8. 細胞ペレットを1 mLの完全培養培地に再懸浮させ、1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移します。
   9. サスペンションを370× gで4°Cで5分間遠心分離します。
   10. 吸引して上清液を捨てます。
   11. 基底膜マトリックス100μLを1.5 mLのマイクロ遠心分離チューブに加え、十分に混合します。
       注意:基底膜マトリックス100μLあたり15,000〜20,000個の原発乳がん細胞のシーディング密度(200細胞/1μL)を維持してください。これにより細胞間パラクリンシグナル伝達が維持され、強固な球状形成が促進され、中枢壊死を防ぎます。
   12. 基底膜マトリックス-セル混合物を24ウェルプレートの各ウェルに25μL投与します。
   13. 24ウェルプレートを逆さまにして37°Cで10分間インキュベートし、基底膜マトリックスの重合を可能にします。
   14. 24ウェルプレートの各ウェルに500μLのBCO培養培地を加えます。
       注意:独自製剤を用いた市販の即使用培地を用いる培養BCOは。
   15. プレートを37°Cの加湿インキュベーターで5% CO₂で培養します。
       注:細胞外マトリックスにシード後、BCOは適切な3D構造の発達を可能にするために7〜10日間培養されました。オルガノイドは、密度が高く球状の3D形態を示し、平均直径約50〜100μmに達し、中心性壊死の兆候がなかったことで、完全に定着し薬物治療の準備が整ったと見なされました。これらのエンドポイント基準が満たされた後、BCOはDOXで治療されました。

2. 彗星アッセイを用いたBCOにおけるDOX誘発DNA損傷の検出

実験プロトコルは確立されたガイドラインを基に改良され、特定の^{実験室条件}に合わせてさらに最適化されました。

注意:DOXを取り扱い手順(乾粉計量、ストック溶液調製、作業液の連続希釈を含む)は、認証済みクラスIIの生物安全キャビネットまたは化学換気フード内でのみ実施してください。開放的な実験台での操作は厳格に避けてください。二重のニトリル手袋を着用し、すべての処置中は薬剤を光から守ってください。最後に、すべてのDOX汚染消耗品(例:ピペットの先端やマイクロ遠心分離機チューブ)を「細胞毒性廃棄物」として厳格に分離し、専門的な処分に用いること。これらの物品を日常的な生物有害廃棄物と混ぜてはいけません。

1. BCOのDOX治療
   1. 使った培地を吸引して廃棄します。
   2. 各ウェルに500μLの新鮮BCO培養培地を加えます
   3. 各ウェルから培地4μLを抽出し、廃棄します
   4. 各ウェルに1 mM DOXストック溶液4 μLを加えます。
      注:最終作業濃度8μMを定めるには、標準希釈式を用いて必要な在庫量を算出します:C₁V₁ = C₂V₂。 ここでC₁は初期DOXストック濃度(1 mM)、C₂はターゲット濃度(8 μM)、V₂は最終井戸体積(500 μL)を表します。V1を解くと4μLが得られます。したがって、プロトコルでは1 mMのDOXストック4 μLを1ウェルあたり残りの496 μLの培養培地に加え、均一な分布を確保するために十分に混合する必要があります。
   5. プレートを37°Cのインキュベーターで5%のCO₂で2時間培養します。
2. BCOの解離
   1. 24ウェルプレートからBCO培養培地を吸引して廃棄します。
   2. 各ウェルに500μLのオルガノイド解離液を加えます。
   3. 基底膜マトリックスやオルガノイド構造を完全に破壊するために、ピペットを上下に繰り返し動かします。
   4. プレートを37°Cで5%のCO₂で10分間培養します。
   5. 各井戸から得られた懸濁液500μLを15mL遠心分離機管に移します。
   6. 350 × gで4°Cで3分間遠心分離します。
   7. 吸引して上清液を捨てます。
   8. 15 mLの遠心分離管に1mLの完全な培養培地を加えて細胞ペレットを再懸浮させ、その後得られた懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移します。
   9. 350 × gで4°Cで3分間遠心分離します。
   10. 吸引して上清液を捨てます。
       注:遠心分離後、オルガノイドペレットは遠心分離機管内に残ります。
3. 細胞再懸濁とアガロース埋め込み
   1. 金属加熱ブロックを95°Cまで予熱します。
   2. 低融点(LMP)アガロース1mLを金属加熱ブロックに入れ、10分間培養して完全に融解させます。
   3. 100μLの溶融した0.5%低融点アガロースを1.5mLのマイクロ遠心分離チューブにピペットし、BCOsを含みます。
   4. すぐにサンプルを37°Cの水槽に移し、10分間平衡させます。
   5. よく混ぜ、すぐに細胞-アガロース懸濁液50μLを顕微鏡スライドにピペットします。
4. 細胞溶解とDNAアンワインド
   1. スライドを冷溶液に浸し、4°Cの暗闇で12時間培養します。
   2. スライドを溶解液から取り出し、すぐにアルカリ性の緩み液に浸します。
      注:アルカリ性アンワインド溶液を準備するには、4.975 mLの超純水に0.6 gのNaOHを溶かし、その後200 mM EDTAを250 μL加えます。アルカリ電気泳動バッファーを準備するには、12gのNaOHを995mLの超純水に溶かし、その後200 mM EDTAを5mL加えます。
      注意:コメットアッセイバッファー内のNaOHは非常に腐食性の強い塩基であり、重度の皮膚や眼の火傷を引き起こす可能性があります。溶液調製中は、固体のNaOHペレットをゆっくりと段階的に、連続的な磁気攪拌のもとで水に加えます。乾燥したペレットに直接水をかけてはいけません。激しい発熱反応で腐食性液体が沸騰し飛び散る恐れがあります。さらに、すべての乾燥粉末は化学煙幕フード内で処理し、腐食性の粉塵の吸入を防ぎます。
   3. スライドを溶解液に浸し、暗闇で4°Cで1時間培養します。
5. 電気泳動
   1. アルカリのアンワインド溶液から電気泳動室へスライドを移します。
   2. スライドを完全に浸かるようにするために、電気泳動タンクに1Lのアルカリ電気泳動バッファーを加えます。
   3. 25 V、300 mAで30分間電気泳動を行います。
6. スライド洗浄と固定
   1. スライドを70%エタノール5mLに浸し、室温で5分間培養します。
      注意:エタノールは深刻な可燃性の危険性があります。大量の調製や組織脱水を行う際は、実験環境で強固な換気を維持してください。作戦エリアを、アルコールバーナーなどの火炎や静電気火花を含むすべての発火源から厳格に隔離してください。使用後はすぐに試薬容器を密封し、専用の耐爆可燃性収納棚内に安全に保管してください。
   2. スライドを37°Cのインキュベーターに入れ、15分間乾燥させます。
7. DNA染色とイメージング
   1. 10mLの超純水に1μLの核酸蛍光染色を加えます。
      注意:これらの核酸挿入因子は潜在的な変異原として扱い、厳重な注意をもって取り扱ってください。日常作業場での交差汚染を防ぐために、専用のピペットを備えた「核酸染色ゾーン」を設置してください。溶融アガロースに染料を添加する場合は、危険な染料を含む蒸気の吸入を防ぐため、約60°Cまで冷却してから添加してください。最後に、使用済みの染色液や廃棄物ゲルは、指定された核酸危険容器に厳格に捨ててください。
   2. スライドをステップ2.7.1で準備した染色液に浸し、室温の暗い環境で30分間培養します。
   3. 5mLの超純水で5分間の洗浄を1回行います。
   4. スライドを37°Cのインキュベーターで15分間自然乾燥させます。
   5. 蛍光顕微鏡と緑色励起フィルターを用いて彗星構造を可視化し、赤色蛍光を検出します。

3. データ処理

1. フィジー(公式配布)でOpenCometプラグインを用いて彗星アッセイ画像の自動定量解析を行い、DNA損傷に関連するパラメータを取得します。
   注:統計解析に関しては、この作業は形態が完全な高解像度で明確に画像化された彗星のみを厳密に含み、重なり合いはありません。逆に、スクリーニングプロトコルでは「ヘッジホッグ」や「ゴースト」彗星(頭部が縮小し尾が広がり、重度のアポトーシスや壊死を示す)や、ぼやけたエッジ、細胞のクラスタリング、背景のアーティファクトのある画像は除外されました。
   1. フィジーソフトウェアを開きます(補足図1A)。
   2. メニューバーのプラグイン(補足図1A)をクリックしてください。
   3. OpenComet(補足図1B)を選択してください。
   4. 「入力ファイル」の「ブラウズ」をクリックし、彗星アッセイ画像を選択して分析してください(補足図1C)。
   5. 出力ディレクトリの「ブラウズ」をクリックし、出力ファイルの宛先フォルダを定義してください(補足図1C参照)。
   6. 自動解析を開始するには「実行」をクリックしてください(補足図1C参照)。このステップでデータ処理と分析のワークフローが終了します。
      注:本研究は各実験群について、少なくとも50個の細胞からランダムに選ばれた尾部DNAの割合(%Tail DNA)を定量化しました。その後の統計解析では、グループ平均を比較するために一方向分散分析(ANOVA)が用いられ、 p < 0.05は統計的に有意とされました。

結果

BCOの設立

本研究は一次腫瘍組織標本から乳がんオルガノイドを成功裏に確立しました。培養の初期段階では、多数の単一細胞または小さな細胞クラスターが明確に観察され、細胞は比較的分散して分布しており、明確な三次元球状の組織はありませんでした。一部の細胞は丸いまたはほぼ丸い形態を示し、腫瘍由来の細胞が細胞外マトリックスに適応し生存したものの、まだ安定したオルガノイド構造を確立していないことを示しています(図1A–C)。

24日間の培養期間中、BCO内に細胞密度が増加した領域が現れ、異なる細胞成長状態が共存していることを示しました(図1D)。

複雑な形態構造と特定の分子サブタイプを示す親原発腫瘍の基線的特徴を確立するため、組織病...

ディスカッション

彗星アッセイは遺伝子毒性評価手法における大きな進歩を示しています。単一細胞分解能と電気泳動移動に基づくDNA損傷パターンの直接可視化により、この技術は従来の遺伝子毒性アッセイに比べて明確な利点を提供します¹⁵。

実験手順のいくつかの重要なステップが再現性とデータ解釈に影響を与えます。まず、溶解条件と溶解時間は一貫して維持し、バッチ間の変動を最小限に抑えなければなりません。原発乳がん細胞を扱う際は、さらなるDNA損傷を防ぐために光への曝露を避けるべきです。アガロースゲルはスライド部分を完全に覆い、ゲル剥離を防ぐために水平に保たなければなりません。低融点のアガロースは早期固化を防ぐために氷で扱うべきです。オルガノイドのサイズや細胞解離効率の変動は電気泳動移動やシグナル解釈に影響を与える可能性があります。試料準備時には厳格な管理が必要です。

高感度で操作が簡単であるにもかかわらず、彗星アッセイにはいくつかの制約がありま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	None	15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	BIOFIL	None	50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit Plus	Mogenel Biotechnology	MA-0807T011LP	BCO culture medium
Comet Slide	R&D SYSTEMS	4250-050-03
Dry-bulb thermostat	Hangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.	DH100-2	Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	gibco	C11995500BT	Complete cell culture medium
EDTA	TREVIGEN	4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water Bath	Shanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.	MSY-24	Water bath
Electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645052
Fetal bovine serum	EallBio	03.U16001DC
Fluorescence microscope	WEIDA	IM-300LD4
Forceps	Beyotime	FS019
GelRed	Beyotime	D0140
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical analysis software
ImageJ	National Institutes of Health, NIH	1.54p	Image processing software / image
LMA garose	R&D SYSTEMS	4250-050-02	Low-melting-point agarose
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40	Centrifuge
Lysis Solution	TREVIGEN	4250-050-01	Lysis solution
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	The basement membrane matrix
NaOH	DAMAO	1588
OpenComet software	Open-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singapore	v1.3.1
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L
Penicillin – Streptomycin	Beyotime	CO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032	PBS
Pipettes	Rainin	Pipet-Lite XLS
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S	Organoid dissociation solution