シロイナ根における発生および環境ストレスにおける核形状とクロマチン動態の定量的ライブセルイメージング

サマリー

このプロセスは、シ ロイナ ナの蛍光標識核およびクロマチンマーカーラインと共焦点顕微鏡を用いて、シロイ ナナ の根の核とクロマチンの動態を同時に記録し、発生や環境の兆候に応じてこれらの動態の変化を調査します。

要約

核は真核生物の特徴的な細胞小器官です。古典的な教科書的な静的核の見解とは異なり、核の形状は生きた細胞では動的です。核の形状の変化や変形は、動物細胞のがんや植物の環境ストレスの特徴です。核膜タンパク質はクロマチンと相互作用して遺伝子発現を調節します。残念ながら、非生物的ストレスが核の形状、運動、クロマチン動態に与える影響についてはほとんど知られていません。この問題に対処するため、共焦点顕微鏡と粒子追跡ソフトウェアを用いて、制御下および非生物的ストレス条件下のシロイナズナの根における核およびクロマチンの動態を定量化するパイプラインを開発しました。この共焦点イメージング法は、核外膜タンパク質とクロマチンという二重蛍光標識マーカーラインを用いて、モデル植物Arabidopsis thalianaの根の生細胞イメージングを制御および塩ストレス条件下で行います。これらの撮影された映像は、TrackMateプラグインの助けを借りて、オープンソース画像処理ソフトウェアFiji/ImageJを用いて核およびクロマチンの動態を定量的に分析します。この方法を検証するために、対照根および塩ストレス根におけるクロマチン移動を画像化・定量化し、塩ストレス条件下でクロマチン速度の低下を示しました。この手法により、植物の発育や環境ストレス中の根核形状やクロマチン動態の定量的なライブセルイメージングが可能となり、非生物的ストレス要因による核およびクロマチンの動態変化の解析が可能になります。

概要

核の形状は細胞タイプや発生時によって変動します。^シロイヌズナの根^1,2。例えば、核の形状は能動的に分化する分子星組織領域において球形です。分裂組織領域とは異なり、根の遷移帯および伸長帯の核は球形が少ないです。さらに、分化細胞内の核、例えば根毛は狭い根毛基部を通過し、^3,4,5の細長い核に積極的に変換されます。核の形状や動きの動的な変化^は細胞の機能に極めて^{重要です。}核形状の欠陥は、核運動の減少などの機能障害を引き起こします^1,3。哺乳類細胞では、細胞および核の形状変化は遺伝子発現やタンパク質合成の変化と直接相関^{しています8。}

間期では、細胞のDNAがクロマチンとして組織されます。クロマチン内のDNAはヒストンの周りに束縛されており、発現を変化させるためにDNAを締めたり緩めたりします。同様に、クロマチンの核外膜に対する位置や核末端への近接も遺伝子発現9において^{重要です。}浸透圧などの環境ストレスは核形状を変化させ、その結果、A. thaliana ^rootsの触覚感応遺伝子の発現を変化させます。この文脈では、生細胞タイムラプスイメージングによる核形状とクロマチン動態の研究が重要です。核動力学の重要な側面の一つは、核の移動速度であり、細胞内の核位置が遺伝子発現を駆動し、核の再配置には核の動き¹¹が必要となります。核内でのクロマチン移動速度も同様に重要であり、遺伝子の核内での位置は遺伝子発現を決定する上で極めて^{重要です。}

それ以前は、核形状とクロマチンの動態は別々に画像化・定量化されていました。その結果、核形状とクロマチン動態の関係は未解決のままでした。核とクロマチンを同時にイメージングすることで、それらの相互位置を観察でき、核の回転や核内クロマチンの動きなど、他に示せない動きを明らかにすることが可能です。この手法では、蛍光タグ付けされた外核膜タンパク質WPPドメイン相互作用タンパク質1(WIP1)¹³ およびセントロメリックヒストロンH3(CENH3)¹⁴ ダイナミクスによるクロマチンを同時に制御および塩ストレス条件下で可視化・定量化する生細胞イメージング技術を提示し、非生物的ストレッサーによる核およびクロマチンダイナミクスの変化の解析を可能にすることを目的としています。この手法を可能にするために、 A. thalianaのWIP1-GFP/CENH3-mRFP系統を生成しました。さらに、オープンソースのImageJ/FijiソフトウェアのTrackMateプラグインを用いて、クロマチン動態を定量的に研究しました。ここで示した蛍光線とクロマチンダイナミクスの二重解析技術を塩ストレス条件下で検証し、応力条件によるセントロメリック焦点の形態と動力学に変化があることを発見しました。この簡素かつ再現性の高い手法は、シ ロイナズナ の根における核およびクロマチンの動態を様々な非生物的ストレス条件下で高スループットで追跡するのに理想的です。

プロトコル

1. A. thaliana の苗木の栽培

1. 成長培地の調製
   1. 1リットルのビーカーに800mLの純水をかき混ぜ皿の上に置きます。ビーカーにかき混ぜ棒を加えます。
   2. 攪拌板を600rpmで作動させます。
   3. ビーカーにショ糖10gを加えます。
   4. ビーカーにムラシゲとスクーグ(MS)培地を2.16g加えます。
   5. 1リットルの培地ボトル2本にそれぞれ5mgの寒天を加えます。
   6. 1本のボトルには「1/2 MS」、もう1本には「100 mM NaCl」とラベルを付けてください。
   7. 両方のボトルの蓋にオートクレーブテープでラベルを貼ってください。
   8. 「100 mM NaCl」とラベル付けされたボトルに5.84 gのNaClを加えます。
   9. ビーカーに1リットルの純水を入れます。
   10. ビーカーを攪拌盤に戻し、ショ糖とMSが溶けるまで待ちます。
   11. ビーカーの中身を1リットルの目盛りシリンダーに注ぎます。
   12. 各ボトルに500mLの目盛りシリンダーの内容物を注ぎます。
   13. オートクレーブ培養培地と250mLの純水、121°Cで60分の液体サイクルを用います。
       注意:メディアや水をオートクレーブする際は、爆発を防ぐために蓋を緩めておくようにしてください。
   14. 成長培地の蓋をねじ直してください。
   15. 培地のボトルを7回逆さにして、寒天が全体に十分に分布するようにしてください。
   16. 成長培地は必要なら4°Cの冷蔵庫で保存し、電子レンジで液状化します。
2. 成長板と種子の設置
   1. フローフード内で、ピペットガンを使って50mLの成長培地を10枚のプレートそれぞれにピペットします(図1A)。
   2. 培地が固化する間、70%エタノール1mLをマイクロ遠心分離機チューブに10分間注ぎ込み、WIP1-GFP×CENH3-mRFP種子をクリーンにします(図1B)。
      注意:エタノールを扱う際は、周囲に火がついていないことを確認してください。
   3. 10分後、フローフード内でエタノールを取り出し、種子を1 mLのオートクレーブ水で2回洗い流します(図1C)。
   4. 培地が固まったら、1000μLピペットを使い、洗浄した種子を1枚の培養皿に14個ずつ2列に分けて配置します(図1D)。
   5. フローフードを出る前に、プレートに永久マーカーでラベルを貼り、マイクロポアテープで封印してください(図1E)。
3. 発芽中の苗木
   1. 成長板をアルミホイルで包み、4°Cの冷蔵庫で最低2日間冷温層化します(図1F)。
   2. 冷房層化後は、冷蔵庫からプレートを取り出し、成長ライト(~80 μmol/^{m 2}/s)の下で垂直に4日間置いてください(図1G)。
   3. プレートの半分をフローフード内の100 mM NaCl成長培地に移し、プレートを封印してラベルを付けます(図1H)。
   4. 画像撮影前に2日間育成ライトの下で育成プレートを設置します(図1I)。

2. A. thaliana 根核およびクロマチンの生細胞イメージング

1. スライド準備
   1. ピペット60μLの純水をガラススライドに注ぎます(図2A)。
   2. 6日目の A. thaliana の苗根を3本水に置きます(図2B)。
   3. 葉を覆わずに根の上に22mm×22mmの#1.5スライドカバーを敷きます(図2C)。
2. 共焦点顕微鏡の設定
   1. レーザー露光時間を1000ms(1秒)に設定します。
   2. レーザーコンバイナーでは、488nmレーザーを緑色蛍光タンパク質(GFP)用に50%、561nmレーザーを赤色蛍光タンパク質(RFP)用に50%に設定します(図2D)。光学ズームなしの20×対物レンズによる画像。10分以上録画する場合は、光漂白を減らすために強度を下げてください。
   3. Zスライスのステップサイズを0.3 μmに設定します。
   4. インターバルを1分、合計時間を10分に設定します。
3. イメージング
   1. ルートを特定し、最大20枚のZスライスを選択して16ビット画像をキャプチャします。
   2. タイムラプスを始めろ。
   3. タイムラプスをロスレス圧縮でTIFFファイルとして保存します。
   4. データをコンピュータに移して分析します。

3. データの追跡と分析

注意:TrackMateがプリインストールされているオープンソースソフトウェアImageJ(推奨バージョン1.54)のフィジー版が必要です。

1. 初期化
   1. OpenImageJ/Fiji。
   2. .vsiファイルをクリックして、メインのImageJ/Fijiアプリケーションウィンドウ(図3A)にドラッグしてください。
   3. 「 バイオフォーマットのインポートオプション 」というタイトルのプロンプトが表示されます。右下の 「OK 」をクリックします(図3B)。
   4. 「 バイオフォーマットシリーズオプション 」というタイトルのプロンプトが表示されます。 シリーズ1 を選択し、左下の 「OK 」をクリックしてください(図3C)。
      注意:ファイルの読み込みに1分かかることがあります。特に多くのZレイヤーやタイムポイントがある場合はなおさらです。
   5. 画像が開いたら(図3D)、メインのImageJウィンドウで画像>カラー>分割チャネルへナビゲートして信号を分割します(図3E)。これにより、GFP標識核用とRFP標識クロマチン用という2つの別々のウィンドウが作成されます(図3F)。
2. クロマチン前処理
   1. どちらのウィンドウがクロマチンに対応しているかを特定します。
   2. クロマチンウィンドウ(図3F)をクリックし、メインのImageJウィンドウからZプロジェクトの>スタック画像(図4A)を操作> Zプロジェクト操作を適用してください。
   3. 投影タイプを 最大強度 に変更し、 すべての時間フレーム が有効であることを確認し、 確定をクリックしてください (図4B)。
   4. Ctrl+Shift+Cを押すか、メインのImageJウィンドウから画像>明るさ/コントラスト調整>コントラストメニューを開きます(図4C)。
   5. 2本目のバー( 最大値とラベル付け)を左にスライドさせ、クロマチンがはっきり見えるまで(図4D)。
3. クロマチンの追跡
   1. プラグイン(図5A)へ移動します。
   2. プラグインメニューの下矢印をクリックすると 、トラッキング オプション(図5A)にスクロールできます。
   3. トラッキングをクリックしてからTrackMateをクリックします。
   4. 初期設定が表示されます。キャリブレーション設定が正確であることを確認し、 次に クリックします(図5B)。
   5. 閾 値検出器 を選択し、「 次へ 」をクリックしてください(図5C)。
   6. 画像ウィンドウでは、タイムラプスの最後のフレーム(図5D)に移動します。
   7. 強度の閾値の隣で 「オート」をクリックし、「 プレビュー」をクリックします。
   8. 強度の閾値を調整し、「 プレビュー」をクリックします。閾値を繰り返し調整・プレビューし、すべてのクロマチンが含まれ、ノイズが最小限になるまで繰り返し、「 次へ 」をクリックします(図5D)。
   9. 初期の閾値検出が行われます。 「次へ 」をクリックしてください(図5E)。
   10. クロマチンだけが見えるまで手動で閾値を設定し、 次にクリック します(図5F)。
   11. このページでスポットのフィルタリングが可能です。これを無視して「 次へ 」をクリックしてください(図6A)。
   12. 「Simple LAP tracker」を選択し、「次へ」をクリックします(図6B)。LAPトラッカーは、追跡されたオブジェクトが統合や分割されない場合に適用されます。
   13. リンク最大 距離 を 5ミクロン、 隙間閉じ最大距離 を 15ミクロン、隙間 閉じ最大フレームギャップ を 1に設定します。 「次へ 」をクリックしてください(図6C)。
   14. 追跡は行われます。トラックは元の画像ウィンドウに表示されます。 「次へ 」をクリックしてください(図6D)。
   15. このページはトラックフィルタリングが可能です。左下の 緑の+ ボタンを押してフィルターを作成し、 トラック モードでスポット数を選択し、 自動 ボタン(図6E)を押します。
   16. モードが 「上」に設定されていることを確認してください。これにより、すぐに現れたり消えたりするシミを除去できます。
   17. 「次へ」をクリックしてください(図6E)。
   18. 表示オプションページでは、データをcsvファイルとしてエクスポートできます。ページ下部で トラック ボタンをクリックし、 CSVにエクスポート (図7A)を選びます。
   19. このページは組み込みのプロットを可能にします。無視して 「次へ」をクリックします。
   20. 最終ページで、キャプチャオーバーレイで動画を保存し、実行ボタンを押してください。クリックしてから、ファイル>GIFとして保存>に移動します(図7B)。
4. 基本的な速度解析
   1. トラックのCSVをスプレッドシートソフトで開いてください。
   2. TRACK_ID、POSITION_X、POSITION_Y、POSITION_T、FRAME、RADIUS以外のすべての列を削除してください。
   3. 各トラックの位置は順番が乱れています。順序を並べるには、まず上4行を凍結し、新しい列「 TRACK_FRAME 」を作成し、この式をコピーしてその列に貼り付けます:=concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4)))。
   4. TRACK_FRAME列を選択し、右クリックしてから「ソートシートA–Z」をクリックします。各トラック内の場所はこれで順番に整っているはずです。
   5. トラックの中間に欠けているスポットがないか確認するには、新しい列を作成し、次の式を使います: =if(E4>E3, E4-E3, "NA")。各トラックの最初の部分は「NA」を返し、残りは1。
   6. 速度(マイクロン/フレーム)の列を作成し、次の式を貼り付けます:=if(H4="NA", "NA", sqrt(((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2))。ここではピタゴラスの定理を用いて2点間の距離を計算します。
   7. これを速度(マイクロメートル/秒)に換算するには、新しい列を作成し、次の式を貼り付けます:=IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5))。これで秒/フレーム単位を見つけ、それに応じてミクロン/フレームを移動させます。

結果

核外膜およびクロマチン動態のライブセルイメージング
外核膜タンパク質WIP1-GFPとセントロメリッククロマチンCENH3-mRFPを含む二重蛍光マーカーラインを生成しました(図8)。4日齢の苗は対照プレートまたは100 mMナカリ含有プレートに2日間移植されました。2日間の潜伏後、塩処理に対して明確な根の成長抑制が観察されており、以前に報告された¹⁵。対照根と塩処理根の両方を用いて、生細胞イメージングや5〜10分間のタイムラプス動画を撮影し、取得間に1分の間隔を置きました(補足ビデオ1および補足ビデオ2)。対照群とは対照的に、塩処理された根細胞はストレスを受けており、中心子の焦点は対照条件下よりも大きく見えます(図8)。これらの観察は、細胞レベルで塩分ストレスが根に与える影響を明確に示しています。

ディスカッション

ここで提示された方法は、クロマチンの動態を追跡するのに理想的です。過去の別々の画像法を用いた生細胞イメージング法と比べて、核とクロマチンの同時イメージングにより、核とクロマチンの動態関係を探ることが可能になります。これにより、核の回転や核内クロマチンの移動など、他では証明が難しい動きが明らかになることがあります。

生細胞イメージング法として、プロセス全体を通じて一貫した蛍光線を持つことが非常に重要です。フォトブリーチがタイムラプスの間に信号を妨害する場合は、レーザーの出力と露光時間を短縮すべきです。これは、タイムラプスの長さを延ばす方法を変更する場合に特に重要です。画像取得において、スピニングディスク共焦点顕微鏡は高いフレームレートと光漂白の低減により、レーザー走査型共焦点顕微鏡とは対照的にライブセルイメージングに理想的です。画像処理中、クロマチンの分割も重要なステップ¹⁶です。したがって、ユーザーはすべての時間点にわたって分割されたクロマチンドットが分割されているこ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
½ Murashige and Skoog (MS) media	bioWorld	30630058
3M micropore tapes	Amazon	A-1530-0
Acqusition software	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cover slip	Genesee	29-116
Glass slide	Genesee	29-101
Image/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscope	Olympus/Evident	IX83
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Spinning disk	Yokogawa	CSU-W1
Square petri dishes	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987