人工内膜カナロプラスティ中のヒト目の術中フルオレセインチャネルグラフィーのデジタル解析

サマリー

本研究は、腹内管形成術中のフルオレセインチャネルグラフィーを定量化するための標準化されたオープンソースワークフローを提示し、房水流出パターンの評価や術後眼圧の予測に利用できます。

要約

腹内膜管形成術(AbiC)は、シュレム管の円周拡張によって生理的な房水の流出を促進するために設計された低侵襲緑内障手術です。フルオレセインチャネルグラフィーは、腹外管形成術の術中に流出経路の可視化に用いられてきましたが、AbiCでの定量的応用はまだ評価されていません。本研究は、AbiC中の術中フルオレセインチャネルグラフィーの定量解析のための標準化されたワークフローを導入し、房水流出パターンとそれが手術結果に寄与する潜在的な予測価値を評価することを目的としています。この目的のために、AbiCは蛍光染色粘弾性で実施され、術中で早期および後期のチャネルグラフィー画像を取得しました。オープンソース画像解析ソフトウェアを用いた段階的な画像解析ワークフローが開発され、結膜下の蛍光染色を定量化しました。3つの補完的なアプローチが適用されました。すなわち、角膜周囲の同心円状リングを用いた円周着色強度の測定、分節染色の象限分析、そして小梁メッシュの変化の可能性に対応する焦点染色パターンの定性的評価です。例例として、象限をまたぐ広範かつ均質な蛍光染色が持続的な眼圧低下と薬剤依存性と関連している一方、より良好な予後が少ない眼では限定的かつ異質な染色が観察されました。このワークフローにより、画像解析の専門知識を必要とせずにAbiC中の房水流出を再現可能かつ定量的に評価でき、低侵襲緑内障手術の成功予測にも利用できます。

概要

緑内障は進行性視神経障害を伴う多因子疾患であり、世界的に失明の最も一般的な原因の一つです^1,2。緑内障の病因に寄与する要因は、篩板の構造的脆弱性、眼の灌流障害、遺伝的要因、自己免疫過程などが特定されていますが、唯一修正可能なリスク要因は眼圧(IOP)の上昇です。3,4,5,6,7,8 .最も一般的な亜型である原発性開放角緑内障(POAG)は、流出抵抗の増加により房水の流出が減少し、長期的に^IOP9が増加するのが特徴です。これにより、病気の進行に伴い網膜神経線維の喪失や視野の欠損が生じます。

緑内障の重症度や期間、測定された眼圧に応じて選択されるいくつかの治療法があります。点眼薬による局所的な眼圧低下療法が効果的でない場合や患者が耐えられない場合、レーザー治療や外科的介入^{が実施されることもあります。}トラベキュレクトミーなどの従来のろ過手術に加え、現在ではリスクの低い低侵襲緑内障手術(MIGS)も多種存在しています¹²。これには腹内管形成術(AbiC)が含まれ、これは外膜管形成術とは異なり、強膜の切開や¹³番皮弁の設置を必要としません。腹内膜アプローチは、縫合糸が異物として残ることがないため、はるかに侵襲性の低い手術を提供します。また、この効果はab-externoアプローチと一致し、取り扱いが著しく簡単で合併症も少ないことが示されています(^14,15)。AbiCのもう一つの利点は、将来的な介入のために結膜組織を保存できることです。

この手技では、角膜切開で前方室を評価した後、顕微カテーテルを前角鏡の助けを借りてシュレム管に挿入し、小梁網を切開して360°円状に通過させます。粘弾性はシュレム管と収集管の開口を拡張し、小梁網目¹⁶の局所的な微小破裂を引き起こすことがあります。これらの効果は、眼の解剖学的および生理学に従い、従来の流出経路内の抵抗を減少させ、コレクターチャネルへのアクセスを改善することで房水の流出を促進すると考えられていますが、正確なメカニズムはまだ完全には解明^{されていません。}さらに、AbiCは白内障手術と併用でき、追加の眼圧低下効果をもたらします。この文脈では、流出経路の術中の可視化は、小梁網目網や遠位流出系の機能状態に関する間接的な情報を提供する可能性があります。

外腹管形成術は、すでにフルオレセインを用いた術中チャネルグラフィーと組み合わせて、流出経路^18、19、20を可視化しています。強膜の着色が多くなり、それに伴い房水流出が改善した眼は、手術後1年で眼圧が低下しました。したがって、術中のチャネルグラフィーは手術の効果を予測するために用いることができます¹⁹。私たちの知る限り、これがAbiCにも当てはまるかどうかはまだ調査されていません。本研究の目的は、AbiC中の術中チャネルグラフィー解析のワークフローを評価することです。このワークフローは、結膜下蛍光染色の強度と範囲を初期および後期段階で定量化するために開発しました。これはAbiCにおける蛍光粘弾性の効果の初評価です。

その後、染色部位の定量と個々の房水流出の程度、術後に使用されたIOPまたはIOP低下薬の減少との間に相関があるかどうかを調べることができます。染色が強く、それに伴い乳液の流出量が目に見えるほど、眼圧や薬剤使用量の減少も大きいと仮説されています。象限に分割することで、解剖学的局所によって流出が有意に変化するかどうかを検証します。

長期的には、このワークフローを用いて、AbiCの成功が蛍光染色に基づく予測可能かどうか、また他の必要な外科的治療にも利用可能かどうかを明らかにします。

プロトコル

倫理的声明:

この調査はヘルシンキ宣言に従って実施されました。これは、通常の医療実践の一環として収集された患者データの後ろ向きレビューであり、非介入的と見なされました。前向き治療アプローチは追求されず、すべての治療は標準治療の一環として日常的に行われました。ボン倫理委員会は研究プロトコルを検討し、非介入的デザイン(番号2026-220)に基づくインフォームドコンセントを放棄しました。分析前に患者データは匿名化されました。

1. AbiCおよび術中チャネルグラフィー

注意:マイクロカテーテルを用いたカナロプラスティシステムを用いて、両目にAbiCを行ってください。以下の手順はこの装置の使用について説明します。AbiCは単独の処置として行うか、特に問題のない白内障手術の後にファコエメルシフィケーションによるものとして行われます。

1. 蓋の膣鏡は、後回の分析のためにできるだけ多くの強膜組織が見えるように位置してください。
2. プロキシメタカイン塩酸塩などの局所麻酔を塗布してください。手術する目をヨウ素で消毒してください。パラバルブ麻酔を投与してください。
3. すべての患者に対して顕微鏡の設定を標準化してください。
   注意:AbiCでは、顕微鏡をLED光20%、眼底反射100%、周囲光0%に設定してください。チャンネルグラフィーでは、顕微鏡を100%LED光、0%眼底反射、100%から0%の周囲光に設定します。
4. ツァイス・ルメラ(眼科外科顕微鏡)に設定を適用してください。他の顕微鏡モデルでは設定が異なる場合があります。
   注意:手順が単独であれ組み合わせてであれ、時間的アプローチを用いてください。
5. 側頭座席から2時間離れた位置に1.0mmの分開を1つか2つ、透明な角膜に約1mm入って作ります。
6. 前室を粘弾性で満たします。
7. 患者の頭を外科医の側面から約30度の角度で傾けます。顕微鏡を約30°の角度に傾けます。末梢の虹彩組織に焦点を合わせ、前腔の角度を視界に出します。
8. 粘弾性染料と蛍光染料を混ぜます。
   1. 無菌カニューレを使って0.05 mLのフルオレセインを粘弾性内に非常にゆっくり吸引し、粘弾性内部に単一の洞窟を作ります。
   2. フルオレセインを5〜10分間拡散させます。
   3. 粘弾性注射器のプランジャーをゆっくり押し、フルオレセインで満たされた洞窟を完全に抽出します。
9. マイクロカテーテル装置に蛍光染色の粘弾性装置を充填します。
10. マイクロカテーテルをインジェクターデバイスの先端より先に進めて装置をテストします。
11. 角膜にヒドロキシメチルセルロースを塗布します。腹開を通してAbiCマイクロカテーテルを前方チャンバーに挿入します。角膜にスワン・ジェイコブ・ゴニオプリズムレンズなどのゴニオプリズムを置きます。
12. 装置の先端で小梁網目を切開します。装置の青いアクチュエーターを使ってマイクロカテーテルをシュレム管に進めます。
13. マイクロカテーテルをシュレム管を360°進め、粘性注入器を回して12個の2.5 μLの着色粘弾性ボーラスを送ります。
14. 時計時間に1回2.5μLのボーラスを投与してください。
15. マイクロカテーテルをゆっくり360°後退させながら、12本の2.5μL粘弾性ボーラスを投与します。
16. 前房からマイクロカテーテルを外してください。眼表面からゴニオプリズムを取り外してください。
17. 患者の頭部と顕微鏡をまっすぐな位置に再配置し、標準化されたまっすぐな目の視像を確保します。角膜を洗浄して染料とヒドロキシメチルセルロースを除去してください。
    注意:必要に応じて、表面のシミを綿棒で除去し、表面の変色の誤認を避けてください。
18. ブルーライトフィルターに切り替えてください。チャンネルグラフィーの初期段階をビデオや写真シリーズで記録しましょう。
19. できるだけ多くの強膜組織を拡大して、画像がピントが合っているか確認しましょう。
20. 終わったらブルーライトフィルターをオフにします。
    注意:前房の粘弾性を除去するには、両手洗浄・吸引プローブを使用してください。逆流を防ぐには、腹房穿刺が水分補給されるまでバランスの取れた塩溶液で前腔を洗浄し続けます。
21. セフロキシムを腔内注射してください。
22. ブルーライトフィルターに戻してください。初期段階では、画像撮影から約2分後にビデオや写真シリーズを用いてチャンネルグラフィーの後期段階を記録します。
23. できるだけ多くの強膜組織を拡大して、画像がピントが合っているか確認しましょう。
24. ブルーライトフィルターをオフにして、結膜下からデキサメタゾンを注射してください。

2. 画像エクスポートとデータ保存

1. 顕微鏡ソフト「ツァイスフォーラム」から画像をダウンロードしてください。
2. 顕微鏡ソフトの患者番号に対応する患者フォルダを開き、「エクスポート」ボタンを使って画像を選択したフォルダに保存します。
3. エクスポートした画像を初期段階と後期段階のフォルダに分けてください。
4. 各画像に「Patient No._Eye_Image_No.」という形式で名前を付け、JPEG形式で保存してください。

3. フィジーを通じた結膜下流出の定量化

注意:このワークフローはチャネルグラフィーの初期および後期の両方に適用してください。

1. FIJI²¹(オープンソースの画像解析ソフトウェア)でチャネルグラフィー画像を読み込みます。手術した目だけが見えるように画像をトリミングしてください。「Rectangle Tool」で長方形を描き、メニューから「画像>トリミング」を選択します。
2. 画像上の白から白の角膜径を「直線ツール」で描いてください。鼻から外側縁部まで横に測ってください。 「Analyze > Set Scale > Known Distance (units)」の下で、術前バイオメトリで既知の角膜直径を用いて白から白の角膜直径をスケールに設定します。
3. 「ポリゴンツール」を使って、角膜と強膜の境界を少なくとも24点でマークしてください。必要に応じて、手術の映像や他の相の画像を確認し、角膜の境界をより正確に特定してください。結膜血管や小梁微小破裂の基部などのランドマークを早期段階で利用してください。
4. キーボードの「T」キーを押すか、「画像>オーバーレイ > ROIマネージャーへ」を選択してROIマネージャーを開き、角膜のマーキングをROIとして保存してください。必要に応じて画像を保存しておき、後で分析してください。
5. キーボードの「Del」を押すか、「ROI Manager > More > Fill」を選択して角膜を切り取ってください。
   注意:切り抜き部分が黒く見えるようにしてください。必要に応じて「カラーピッカー」ツールを使って色を調整してください。
6. 「画像>調整」の「カラー閾値」ツールを使って、静止画を白黒のバイナリ画像に変換してください。ツールを開いた後、「デフォルト」をしきい値方法、「Black & White」をしきい値色、「HSB」をカラースペースに選びます。各設定の「合格」ボックスと「暗い背景」ボックスからチェックマークを削除してください。
7. 白い部分が蛍光粘弾性による黄色の染色に対応していることを確認しましょう。必要に応じて「カラーピッカー」ツールを使って調整してください。
8. 画像間の比較性を高めるために、以下の3つの設定オプションのいずれかを用いて二値化画像を標準化します。
   1. 患者全体の標準化設定として、上部バーを「色相」=140、「彩度」=205、「明るさ」=205に設定します。下のバーを「色相」「彩度」「明るさ」=255に設定してください。
   2. 部分的に標準化された設定では、上部バーの「色相」を個別に選び、上部バーの「彩度」と「明るさ」=255に設定します。下バーの「色相」「彩度」「明るさ」を255に設定してください。
   3. 完全にカスタマイズしたい設定は、各画像ごとに上部バーの設定を個別に選びます。下バーの「色相」「彩度」「明るさ」を255に設定してください。
9. 「スタック」関数または直接比較を用いて、二値化画像と元の画像を比較します。
10. 部分的に標準化され、完全にカスタマイズされた設定には、明るい色の部分を表現しつつ、強い色の過剰な表現を避ける最小限の設定を選びましょう。必要に応じて、光の反射や浅い染料を除去してください。「ポリゴンツール」でアーティファクトをマークし、「 Del」を押すか、「ROI Manager >More > fill」を選択してください。
11. 「画像>カラー>カラーピッカー」で塗りつぶし色として黒を選択してください。そうすれば切り抜いた部分が誤って染料としてカウントされないようにします。
12. 画像タイプを 「32ビット」 に変更するには「Image > Type」があります。「Process > Enhance Contrast」で設定を正規化し、「 彩度ピクセルの割合=0.35」に設定してください。
13. 以下に記載したアプローチ1、2、3を使って房水の流出量を定量化します。
    1. 定量的アプローチ1:角膜外の全面積のフルオレセイン染色率を円形に行う。
       注意:この方法を使って、角膜外の円形面積のフルオレセイン染色率を記録してください。
       1. 画像の断面やまぶたの開口部の幅に応じて、先に描いた角膜の境界線の周囲に3つのリングを投影し、それぞれのリングは幅1mmです。
       2. ROIマネージャーで角膜のマークを選択し、「選択>編集> Make Band: 1」を選択してください。
       3. 最初のリングで染色面積の割合を取得します。「Analyze > Set Measurements > Mean Grey Value > OK」を選択し、キーボードの「Ctrl + M」を押すか、「Analyze > Measure」を選択してください。
       4. 開いたテーブルの値を記録してください。
       5. キーボードの「T」を押すか、「Image > Overlay > To ROI Manager」を選択して最初のリングをROIマネージャーに保存してください。
       6. 2つ目と3つ目のリングについては、2単位または3単位で延長し、角膜マークまたは前述のリングの1単位から始めて、ステップ3.13.1.2から3.13.1.5まで繰り返します。
       7. 元の画像を確認して、輪には結膜のみが含まれていることを確認してください。
       8. バイナリ画像を「File > Save As > Tiff」に保存し、「Patient ID_phase_Ring」というフォーマットで名前を付けます。
       9. 対応する結果は「ファイル>名前付け」で保存し、それに応じて名前を付けてください。
       10. 対応するROIマネージャーは「選択解除」をクリックし、「More > Save」をクリックし、それに応じて名前を付けて保存してください。
    2. 定量的アプローチ2:パーセンテージ染色の象限ベース分析
       注意:この方法を使って各象限ごとに染色率を個別に分析してください。
       1. 象限分析を始める前に、ステップ3.1–3.13.1.10を完了してください。
       2. 「Rectangle Tool」を使って、画像のちょうど半分を表すように長方形を描きます。
       3. キーボードの「Del」を押すか、「ROI Manager >More > Fill」を選択すると、画像の半分だけが残ります。
       4. 残りの画像の半分を表すもう一つの長方形を描きます。
       5. キーボードの「Del」を押すか、「ROI Manager >More > Fill」を再度選択すると、元のバイナリ化画像の4分の1が残ります。
       6. 選ばれた角膜が完全に丸くなくても、まず正確に2つの半分を使って、0.25に近い象限を特定しようと試みてください。
       7. ROIマネージャーを通じて最初のアプローチから3つのリングを「選択解除」します。
       8. 「More More > Multi Measure > 1 row per slice」をクリックすると、染色の割合が確認できます。
       9. 開いたテーブルの結果を記録してください。
       10. 残りの3つの象限については、ステップ3.13.2.2 - 3.13.2.9を繰り返します。
       11. すべてのバイナリズドされた象限画像を「File > Save As > Tiff」に保存し、「Patient ID_phase_Quadrant」という形式で名前を付けます。
       12. 対応する結果は「ファイル>名前を付けて保存」で保存し、それに応じて名前を付けてください。
       13. 対応するROIマネージャーは「Deselect」をクリックし、「More > Save」をクリックして保存し、それに応じて名前を付けます。
    3. 定量的アプローチ3:局所的な小梁メッシュ変化に対応する焦点染色パターンの解析
       注意:この方法を使って、小梁網目網の局所的な変化に対応する可能性のある局所的な染色パターンを評価する。シュレム管の進行中、カテーテルは小梁網の内壁に微小な破裂を誘発し、小梁網の内壁の脱出を収集チャネルオスチアに向かわせることがあります。したがって、この手法で初期段階の画像を解析してください。
       1. ステップ3.1から3.4までを完了してください。
       2. 「編集>逆にする」をクリックしてください。
       3. キーボードの「Del」を押すか、「ROI Manager > More > Fill」を選択すると、角膜リング内に存在する小梁微小破裂の単独解析のために強膜組織を削除してください。
       4. 角膜リングの外側が黒くなっていることを確認してください。必要に応じて「カラーピッカー」ツールを使って白黒表示を調整してください。
       5. 角膜ROIの内側に、まずROIマネージャーで角膜ROIを選択し、やや小さいリングを描きます。
       6. 「選択>編集>拡大>-0.2」をクリックすると、角膜リング内に0.2mm細いリングが現れます。
       7. キーボードの「T」を押すか、「画像>オーバーレイ > ROIマネージャーへ」を選択してください。
       8. 「選択>編集>バンドを0.2>」をクリックすると、0.2mm幅のリングが表示されます。
       9. このリングを角膜リングに置き、外縁として両リング間の領域のみを分析できるようにします。
       10. キーボードの「T」を押して、リングをROIとして保存します。
       11. 「画像>色>閾値を調整」を開いてしきい値設定を確認してください。
       12. 部分的に標準化された設定を使いましょう。上バーの「Hue」を個別に選び、上バーの「彩度」と「明るさ」=255、下のバーの「Hue」「彩度」「明るさ」=255に設定します。
       13. 内側のリングで小梁骨折が見える部分を色で満たせる色設定を選びましょう。
       14. 染色部分が二元化画像で白く見えるようにしてください。
       15. 必要に応じて遺物やパロセンテージが作られた場所を削除してください。「ポリゴンツール」でエリアをマークし、「デル」ボタンを押してください。
       16. 「画像>カラー>カラーピッカー」の塗りつぶし色として黒を選択してください。切り抜いた部分が誤って染料としてカウントされないようにするためです。
       17. 「More > multi measure > 1 row per slice」をクリックしてください。
       18. 開いたテーブルの結果を記録してください。
       19. バイナリ化画像を「File > Save As > Tiff」に保存し、「Patient ID_phase_microruptures」という形式で名前を付けます。
       20. 対応する結果は「ファイル>名前を付けて保存」で保存し、それに応じて名前を付けてください。
       21. 対応するROIマネージャーは「Deselect」をクリックし、「More > Save」をクリックして、それに応じて名前を付けて保存します。
14. データ収集のために、Excelのスプレッドシートを開きます。
15. これまでに集めた結果表をすべて1つのスプレッドシートにコピーします。
16. 象限解析の結果については、すべての値を4掛けて、完全な画像の染色を示し、他の手法と比較できるようにします。

図1 はワークフローの概要を示しています。

図1:腹内管形成術(AbiC)後の房水流出を定量化するためのワークフローの概説。 この手技には、術中のフルオレセインチャネルグラフィー画像取得、オープンソース画像解析ソフトウェアを用いた画像処理、画像のバイナリゼーションおよび標準化、蛍光染色パターンの定量解析が含まれます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

18歳以上で緑内障と診断され、AbiC単独または白内障手術と併用して受けた患者が含まれていました。さらに、チャネルグラフィー画像は少なくとも初期または後期段階で利用可能でなければなりませんでした。過去の選択的レーザートラベクロプラスティは除外基準ではなかったため、他の緑内障手術とは対照的でした。さらに、進行した緑内障損傷の患者は研究に含まれていません。

これまでに、2022年3月から2024年6月までの期間に62人の患者から合計86眼を分析に含めることができました。そのうち82眼は白内障手術と組み合わせてカナロプラスティを受けました。ここでは、蛍光染色が認められた眼と限定的な染色のみの目(図2)で、2つの眼の模範的な結果を報告します。最初の患者は手術時63歳で、2つの有効成分を用いた局所眼圧低下療法を受けました。術前の眼圧は20 mmHgでした。AbiC直後の蛍光チャンネル撮影では、3つのリングすべてと4つの象限すべてに顕著な染色が認められました。リングの...

ディスカッション

このワークフローは、AbiC後の房水流出量を定量化するためのオープンソース画像解析ソフトウェアのステップバイステップガイドを提供します。オープンソース画像解析ソフトウェアの機能は、コーディング知識を必要とせず、医師が技術的なサポートなしで適用できる使いやすいテンプレートを提供します。このアプローチは、AbiC後の房水流出を評価し、手術結果に対する潜在的な予測価値を評価するのに役立ちます。直接的な機能的測定を示すのではなく、このワークフローは術中の蛍光分布パターンを体系的に特徴付け、症例間の再現性のある比較を可能にするよう設計されています。顕微鏡のアライメント、標準化された照明設定、画像センタリング、角膜境界の正確な定義に特に注意を払うべきであり、これらの要素は定量分析の再現性に強く影響します。長期的な目的は、術後の眼圧減少がチャネルグラフィー中のフルオレセイン流出の増加と関連しているかどうかを明らかにすることです。

これまでに、蛍光19,22,23,24を用いた流出系のイメージングに焦点を当て

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Balanced Salt Solution	Bausch & Lomb	Ref.: BL705004
Bi-manual irrigation/aspiration probes	Zeiss	Ref.: 303060-0165-000
Cefuroxim	Laboratoires Thééa	PZN: 09755705	薬局で事前に混合
Dexamethasone	Dr. Winzer	PZN: 02192162
FIJI (ImageJ)	n/a	n/a	オープンソースの画像分析ソフトウェア
Fluorescein dye	Alcon	PZN: 01467007
Healon Pro Viscoelastic	Johnson & Johnson	Ref.: 10-3100-12
Hydroxymethylcellulose	Johnson & Johnson	Ref.: 10310012
Iodine solution	Mundipharma	PZN: 03930490
iPrism S gonioprism lens	Glaukos	Ref.: OTB/LH-2
iTrack Advance Canaloplasty System	Nova Eye Medical	Ref.: Track-ADS	マイクロカテーテルベースのカナロプラスティシステム
Lumera 700 Surgical Microscope + Calysto	Zeiss	Ref.: 6726521526	眼科手術用顕微鏡
Proxymetacaine hydrochloride	PUREN Pharma GmbH & Co. KG	PZN: 11055866
Sterile cannula	Braun	Ref.: 4657683