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研究記事

Piezo1は、機械的ストレス誘発線維芽細胞分化を通じて硬化性ECMの再構築を促進します

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DOI:

10.3791/71340

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2026年8月11日

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1Department of Ophthalmology and Visual Science, Eye and ENT Hospital, Shanghai Medical College, Fudan University, 2NHC Key Laboratory of Myopia, Chinese Academy of Medical Sciences, and Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University, 3Department of Ophthalmology, Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4Department of Ophthalmology, Shanghai Eye Diseases Prevention and Treatment Center, Shanghai Eye Hospital, Tongji University School of Medicine, 5Jinfeng Laboratory, 6Department of Cell Biology, Zunyi Medical University, 7Shanghai Nineth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 8State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、ラット眼圧亢進モデルとヒト強膜線維芽細胞におけるin vitro機械的ひずみ、作動薬/阻害剤、siRNA実験を組み合わせ、強膜外マトリックス再構築時にピエゾ1発現が上昇し、筋線フィブロブラストの分化に機能的に関与していることを示しました。

要約

機械的緊張誘発性筋線維芽細胞分化は、緑内障における強膜細胞外マトリックス(ECM)リモデリングの重要なメカニズムです。しかし、強膜線維芽細胞内での機械的ひずみが生化学的信号に変換される過程は、依然として十分に解明されていません。本研究は、強膜ECM再構築中の機械的ひずみ誘発性筋原線芽細胞分化の文脈で、細胞増殖と分化におけるPiezo1の役割を調査しようとした。本研究デザインは、1週間のラット眼圧高血圧モデルからのin vivo発現観察と、10%を0.5 Hzで最大24時間持続させる周期的機械的伸縮、および原発性ヒト強膜線維芽細胞(HSF細胞)におけるPiezo1(作動薬Yoda1、阻害剤GsMTx4、およびsiRNAノックダウン)の薬理学的調節を用いたin vitroメカニズムアッセイを組み合わせています。私たちの発見は、ピエゾ1が強膜組織およびHSF細胞で発現していることを示しています。生体内群では、眼高血圧ラットの強膜で1週間後にPiezo1タンパク質レベルが有意に増加し、これはI型コラーゲン(COL1)およびα平滑筋アクチン(α-SMA)の発現上昇と一致しました。in vitro実験では、機械的伸縮(8〜24時間)によりHSF細胞内のピエゾ1発現がアップレギュレーションされました。さらに、Yoda1によるPiezo1の活性化(24時間)はHSF細胞の増殖を促進し、α-SMAおよびCOL1の発現を促進しました。逆に、Piezo1のノックダウンまたは阻害はCOL1の発現を抑制し、機械的負荷下での筋線維芽細胞分化を妨げました。さらに、Piezo1の活性化はYes関連タンパク質(YAP)発現のアップレギュレーションをもたらし、一方で機械的ひずみ誘発のYAP発現はPiezo1のノックダウンまたは阻害時に低下しました。まとめると、本研究の発見は、Piezo1が緑内障の文脈における強膜における主要なECM成分の機械的ひずみ誘発に関与し、さらなるin vivo検証を必要とする潜在的な治療標的となる可能性を示唆しています。

概要

緑内障は、網膜神経節細胞(RGC)および視神経頭(ONH)軸索の進行性変性を特徴とする不可逆的な失明の主な原因であり、2020年には世界中で7,600万人が影響を受けています。眼内圧(IOP)の上昇は緑内障の最大のリスク因子3であり、現在では眼内圧の低下が緑内障の発症と進行を遅らせる唯一の選択肢です。緑内障の損傷の主な部位は、RGC軸索が眼から出る構造です。IOPの上昇はONHに機械的ひずみと置換を誘発し、層状クリブローサ(LC)内のRGC軸索の変性を引き起こし、最終的に緑内障性視神経障害5,6へとつながります。

乳頭周囲強膜(PPS)はONHの主要な荷重を支える組織であり、PPSの力学的特性がIOP誘発機械的ひずみに対するONHの応答を決定します7,8。有限要素モデリングおよび生体外研究により、LCの生体力学的ひずみは強膜剛性に依存しており、PPS剛性の向上がLC 9,10のひずみ低下に寄与することが確認されました。次に、PPSの剛性11,12と厚さ13の変化がONHのIOP関連の生体力学的特性を変化させ、緑内障視神経損傷に対する感受性をさらに変化させることができます14,15。生体力学的研究では、死後の人間の眼において緑内障性強膜の眼硬性が正常な強膜より大きく、ヒト緑内障モデルおよび実験動物モデルの両方で一貫して乳頭外膜の強硬が観察されています(18,19,20)。これらのデータは、緑内障中の眼圧によるONH変形の減少による強膜の硬化が保護的反応である可能性を示唆しています。

強膜組織の生体力学的特性は、線維芽細胞によって合成される細胞外マトリックスの組成によるものです21。最近の証拠は、眼圧の増加による機械的ストレスが強膜内に存在する強膜線維芽細胞を活性化し、筋線維芽細胞分化を促進し、ECMの再構築を引き起こす可能性を示唆しています。機械的緊張誘発性筋原線芽細胞変質は緑内障における強膜ECM再構築の重要な過程ですが、その機械的ひずみがどのようにして強膜線維芽細胞における生化学的信号や細胞応答に変換されるかは明確ではありません。

ピエゾ1は、心臓や肺の皮膚を含む複数の臓器の線維化に関与する、新しい異なる非選択的陽イオン感受性チャネルファミリーのメンバーです26,27。機械的ひずみは細胞内のPiezo1チャネルを活性化し、Ca2+の流入増加を引き起こすことがあり、これによりカルシウム依存性シグナル伝達が行われ、線維芽細胞の増殖、運動性、分化を含むさまざまな細胞活動を調節します29,30。最近の研究では、機械的負荷下でピエゾ1が線維芽細胞の増殖、運動性、分化を刺激することで皮膚線維化過程を促進することが明らかになりました31。本研究は、ラット眼圧高血圧モデルにおけるピエゾ1発現の記述的in vivo研究と、周期的機械的負荷下での一次ヒト強膜線維芽細胞を用いた機構的in vitro研究の2つの補完的な構成要素を含みます。我々は、機械的ストレインがPiezo1を活性化し、YAPシグナルを通じて強膜線維芽細胞における筋原維芽細胞の分化およびECM成分の発現を促進すると仮説を立てました。

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プロトコル

オスのスプラグ・ドーリーラット(生後8週)は復旦大学小児病院実験動物センターから採取されました。すべてのラットは自由に飼育され、SPF条件の22±1°C、昼夜12時間サイクルで飼育されました。すべての動物実験は、眼科および視覚研究における動物利用に関するARVO声明に準拠し、復旦大学小児病院の倫理審査委員会および倫理委員会(2022JS-EKYY-019)によって承認されました。一次ヒト強膜線維芽細胞を誘導するために用いられたヒト強膜組織は、機関のガイドラインに従いドナーの強膜から採取され、関連するすべての手技は復旦大学の機関審査委員会(2024-YS-187)によって承認されました。

実験設計

本研究では、機械的ストレスを介して概念的に結びついたin vivoおよびin vitroの両方のアプローチを用いて、Piezo1が強膜ECM再構築に与える影響を検証しました。in vivoでは、ラット眼圧高モデルを用いて、高眼圧下でのPiezo1発現を調べました。in vitroでは、緑内障における強膜が経験する機械的ひずみをモデル化するためにヒトの一次性強膜線維芽細胞に周期的機械的伸縮を加え、薬理学的作動薬(Yoda1)、阻害剤(GsMTx4)、およびsiRNAノックダウンを用いてPiezo1活性を操作しました。

実験的慢性眼高血圧症(OHT)モデル

合計18頭のオスのSDラットが使用されました。各ラットでは、右目に炭酸体注射をして眼高血圧(OHT)を誘発し、対側の左眼が対照群(NT)として機能しました。実験全体を3回独立した生物学的複製が実施され、各グループに合計18個の目が得られました。実験単位は個別の目でした。IOP測定およびウェスタンブロット解析を行う研究者は、グループ割り当てに対して盲検化されました。

前述の実験的な慢性OHTモデルをラットで作成しました25。ラットには10%クロラール水和物で麻酔され、トロピカミドによる瞳孔拡張後、前眼房にカルボマー溶液(0.3%、20 μL)を注入しました。感染を防ぐために塩酸クロテトラサイクリンが適用されました。IOP測定は3日目と7日後にリバウンドトノメーターで実施されました。モデルが確立されたとみなされてから1週間後に強膜から組織が採取されました。

強膜組織は前述の詳細な25で単離されました。麻酔後、ラットは経心的に4%ホルムアルデヒドをPBS中に灌流しました。余分な眼窩組織を解剖し、前節構造(角膜、虹彩、水晶体)と硝子体を慎重に除去しました。網膜と脈絡膜は内側の強膜壁から優しく削り取られました。後方強膜組織は病理的なH&E染色によって採取・同定されました。

細胞培養

原発ヒト強膜線維芽細胞(HSF細胞)は、ヒトドナーの強膜から確立された細胞株でした。各実験には3つの独立した生物学的複製(3人の異なるドナーからの細胞)が使用されました。HSF細胞はDMEMで維持され、胎児用牛血清15%とペニシリン-ストレプトマイシン1%を標準培養条件下(37°C、5% CO2、加湿大気)で維持されました。培養は4日ごとに分割され、すべての実験で5番から9番の間のHSF細胞が用いられました。HSF細胞は、コラーゲンタイプIおよびα平滑筋アクチン細胞マーカーを用いた免疫蛍光法によって確認されました。

機械的刺激の応用

サイクリック機械的伸縮システムは、機械的サイクリックストレッチを生み出すために用いられました。6ウェルプレートでコラーゲン被覆された柔軟な底板を持つHSF細胞には、2×105 cells/mLのシーディング密度が用いられました。ストレッチグループ細胞は、前回の研究で記述されたように、振幅10%かつ0.5Hzの周期的伸縮にさらされました。ストレッチプレートで培養し、静的を残した細胞が対照群として機能しました。ピエゾ1 siRNAノックダウン実験:細胞は機械的伸ばす前に48時間にわたりピエゾ1 siRNAまたはネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクションを受けました。トランスフェクション後、細胞は24時間にわたり周期的に機械的伸縮を繰り返しました。4つのグループが含まれました:(A) ストレッチなしのsiRNA管控細胞群;(B) ストレッチでsiRNAトランスフェクト細胞を制御すること;(C) 伸縮のないピエゾ1 siRNAトランスフェクト細胞;(D) 伸縮したピエゾ1 siRNAトランスフェクト細胞。ピエゾ1阻害剤(GsMTx4)実験:細胞に対して機械的伸ばしの前後に5μMのGsMTx4を処理しました。4つのグループが含まれました:(A) ストレッチなしの未治療細胞;(B) 未処理の伸縮細胞;(C) 伸縮なしのGsMTx4処理細胞;(D) 伸縮を伴うGsMTx4処理細胞(GsMTx4が全域に存在)。ピエゾ1作動薬(Yoda1)実験:細胞を5 μM Yoda1の存在下で24時間培養しました。2つのグループが含まれました:(A) 未治療(車両)対照群;(B)ヨーダ1で処理された細胞。

ウェスタンブロッティング

タンパク質レベルは、通常の手順の後にウェスタンブロッティングで評価されました。簡単に言えば、RIPAバッファーで硬化膜または培養線維芽細胞サンプルを溶解しました。タンパク質(20μg)はSDS-PAGEで分離され、その後ニトロセルロース膜にブロットされました。その後、5%BSAで常温で1時間ブロッキングし、その後適切な一次抗体とともに4°Cで一晩潜伏しました。使用された抗体には、ピエゾ1抗体、コラーゲンI型、α平滑筋アクチン、YAP、GAPDHが含まれていました。Piezo1抗体は、製造元によってラットおよびヒト組織におけるウェスタンブロットおよび免疫蛍光に対して検証されており、ノックアウト/ノックダウンデータは製品シートに記載されています。TBSTで3回洗浄した後、適切なHRP結合二次抗体(抗ウサギ抗体または抗マウス抗体)を室温で1時間培養しました。その後、画像解析ソフトウェアでバンド強度を測定し、各ターゲットバンドの信号を同じレーンのGAPDH信号に正規化しました。得られたデータは制御条件に対するフォールド変化として表されます。

細胞増殖

細胞増殖は、提供されたプロトコルに従い比色生存能力アッセイで評価されました。各ウェルにテトラゾリウム化合物(10 μL/mL)を加え、標準培養条件下(37°C、5% CO2)で2時間培養しました。その後、450nmで吸収が測定されました。

小さな干渉RNAトランスフェクション

前述の通りにピエゾ1 siRNAトランスフェクションが行われました。配列は以下の通りです:Piezo1-siRNA、5'-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3'(意味)、5'-UACUUGAGAGAUCUCUCUCUCUCCUTT-3'(反意味)、陰性コントロール(NC)siRNA、5'-GUGAGCUCUAUCACUCCAUTT-3'(意味)、5'-AUGGUAUAGACGCUCACTT-3'(反意味)。

免疫蛍光

免疫蛍光法では、培養細胞に4%パラホルムアルデヒド(室温20分)で固定し、0.1%トリトンX-100(40分)で透過させ、10%BSAでブロッキングしました。組織切片は室温で4%パラホルムアルデヒドに一晩固定され、その後透過化とブロッキングが行われました。標本はPiezo1およびα-SMAに対する一次抗体とともに培養されました。その後、蛍光色素共役の二次抗体(緑色標識抗マウス抗体(α-SMA用)と赤色標識抗ウサギ抗体(Piezo1用)をそれぞれ1:500の希釈で適用しました。核はDAPIでカウンターステインされ、蛍光顕微鏡で画像を撮影しました。

作動薬および阻害薬治療

HSF細胞は、過去の研究に基づき5μMのGsMTx4および5μMのピエゾ1作動薬Yoda1で処理されました。

統計解析

各実験は三重に分けて実施されました。結果は平均±標準偏差(SD)として提示されます。2つのグループの比較には、両側の学生t検定を適用しました。複数群比較を一方向ANOVAとTukeyの事後検定で行いました。データの正規性はシャピロ・ウィルク検定で検証され、分散の均質性はレヴェーン検定で評価されました。統計的有意性はp < 0.05と定義されました。すべての統計解析は専用の統計ソフトウェアで実施されました。

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結果

ピエゾ1はラットの強膜組織およびHSF細胞で発現します

まず、ラットの強膜組織(in vivo)および培養ヒト強膜線維芽細胞(in vitro)におけるPiezo1の発現を調べました。組織特異的発現を検証するために、BioGPS遺伝子注釈データベースが使用されました。BioGPS解析により、ピエゾ1は網膜色素上皮、虹彩、角膜、カップなど様々な眼組織で高度に発現していることが明らかになりました(図1A)。in vivoでは、免疫蛍光によりSDラットの強膜組織におけるPiezo1発現が確認されました(図1B)。ピエゾ1とα-SMAの共局在は、ラットの強膜組織およびHSF細胞でin vitroで観察され、強膜線維芽細胞におけるピエゾ1の発現を示しています(図1B)...

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ディスカッション

眼圧(IOP)の上昇は視神経頭および層状篩に機械的負担を誘発し、網膜神経節細胞の変性に寄与します38,39。乳頭周囲強膜(PPS)は、ONHの生体力学に影響を与える主要な荷重組織です。過去の研究では、機械的ストレスが強膜線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化および細胞外マトリックス(ECM)の再構築を引き起こし、強膜硬性を引き起こすことが示されています41。IOPに関連する機械的力によるECMリモデリングは緑内障治療の有望な標的となる可能性がありますが、機械的力によるECMリモデリングの分子メカニズムは完全には解明されていません。IOPは静水圧と眼壁内の壁張力(伸縮)の両方を生み出します。本研究では、Flexcellシステムを用いて循環的機械的伸縮を適用することを選びました。このアプローチはIOPによる機械負荷の伸縮成分を分離し、ひずみの大きさ、頻度、持続時間を正...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係がないと宣言しています。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(助成金番号82401257)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer)Solarbio, Shanghai, China—20 μL
10% chloral hydrateMacklin, Shanghai, China—3 mL/kg
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibodyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA —
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibodyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA—
BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I)Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA—
Chlortetracycline hydrochlorideZhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China—
COL1 primary antibodyNovus Biologicals, CO, USA—
DMEMGibco, Grand Island, NY, USA—
FBSGibco Life Technologies, Australia—
GAPDH primary antibodyBioworld, MN, USA—
GraphPad Prism version 8.4Inc., San Diego, CA, USA—
Nikon Eclipse E800 microscopeNikon, Melville, NY, USA—
Nitrocellulose membranesPierce, Rockford, IL, USA—
Penicillin-streptomycinHyclone, South Logan, UT, USA—
Piezo1 primary antibodyNovus Biologicals, CO, USA—
Rebound tonometer (TonoLab)Icare, Espoo, Finland—
RIPA bufferThermo Fisher Scientific, Shanghai, China—
The Flexcell FX-5000 Tension SystemFlexcell International Corporation—Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells.
TropicamideBausch Lomb Freda, Shandong, China—
YAP primary antibodyCell Signaling Technology, Danvers, USA—
α-SMA primary antibodyAbcam, Cambridge, UK—

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