方法論記事

知能検査システムによる社会的に飼育されたマウスにおける自動オペラント間欠性アルコール飲酒

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DOI:

10.3791/71345

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2026年6月5日

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1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

このプロトコルは、IntelliCageテストシステムを通じて社会的に飼育されたマウスにおけるアルコール飲酒行動を高スループットで自動評価する方法を提示します。オペラントで断続的な飲酒パラダイムの詳細な方法論と、その結果得られたデータを解析するための実験ファイルとコードが提供されています。

要約

社会的孤立が齧歯類の行動に与える既知の混同があるにもかかわらず、多くの研究者は単独で飼育マウスを用いて、アルコール使用障害(AUD)の前臨床モデルにおけるアルコール嗜好評価に依拠しています。このプロトコルは、社会的孤立によるストレスの影響なしにマウスの飲酒行動を高頻度かつ自動で評価できる社会的アルコール飲酒課題を説明しています。IntelliCage検査システムは、最大16匹の同性マウスの同時代オペラントアルコール飲酒行動を評価可能にし、それぞれに皮下埋め込み型無線周波数識別(RFID)トランスポンダーで一意に識別されます。シッパーボトルへのアクセスはソフトウェアで制御されており、マウスごとに個別に調整可能です。この慢性的で断続的な飲酒パラダイムでは、マウスは6週間連続で20%アルコール入りのシッパーボトルにアクセスするためにオペラントな鼻つつきを行います。アルコールボトルは24時間間隔でしかアクセスできず、罰則に配慮のない飲酒を評価するためにキニーネで混ぜることも可能です。各オペラントの角、鼻突き、舐めのデータは自動的に記録されます。詳細な実験手法と記録データを解析するためのオープンソースコードにより、AUDに関連する飲酒行動をますます効率的かつ倫理学的に関連性の高い方法で評価できるようになります。

概要

前臨床モデルでの研究は、アルコール使用障害(AUD)様行動の根底にある神経生物学的メカニズムをより深く理解するために不可欠です。しかし、2本選択1,2や暗闇で飲む3,4,5検査など、齧歯類の飲酒量を手作業で測定する多くの方法は、単独飼育の齧歯類間で液体量を手動で測定する必要があり、これは低スループットで誤りやすい方法です。最近、容量式6,7,8,9,10または光電11,12技術を用いたオープンソースのリックメーターシステムの導入は、アルコール飲酒方法論のスループット、精度、技術的感度において大きな進歩を示しています。しかし、ほとんどの家庭用ケージリコメーターシステムは依然として齧歯類を単独飼育でなければならず、隔離ストレスを誘発します13,14。報告された結果は大きく異なりますが、15,16、単独飼育の際には一般的にアルコールを好む傾向があります(17,18,19,20)。しかし、社会的孤立がアルコール摂取に与える影響は、動物の年齢、性別、居住環境、過去のストレス曝露によって異なります 20,21,22。社会的孤立は、評価されたAUD様行動結果の妥当性を制限するために実験的操作と有意に相互作用する可能性があります。

IntelliCageのテストシステム(TSE Systems 23,24,25)やオープンソースの代替品LIQ PARTI20やFARESHARE26のような新しい完全自動化の自宅ケージモニタリングシステムは、複数のグループハウス動物のリコメトリーと無線周波数識別(RFID)追跡を組み合わせることでこの問題を解決しています。これらの自宅でのモニタリングシステムは、社会的孤立によるストレスの混和なしに、アルコール飲酒行動をより効率的かつ再現性のある数値化することを可能にします。したがって、AUD様の挙動に対する脆弱性に影響を与える実験的操作の高スループットかつ確認的研究に理想的です。その中でも、IntelliCageの検査システムはプログラム可能なオペラントコーナーを組み込んでシッパーボトルへのアクセスを制限し、薬物アクセスがない場合でも探索行動を評価したり、個々の動物のオペラント比率を調整したりできる点で独特です。

ここで著者らは、社会的に飼育されたマウスを対象にIntelliCageテストシステムを用いて実施されたオペラント間欠性アルコール飲酒パラダイムを提示しています27,28。このパラダイムにより、最大16匹の同性マウスのアルコール摂取を長期的かつ自動的に評価し、それぞれが皮下に埋め込まれたRFIDトランスポンダーによって一意に識別されます。以下に説明するように、マウスは固定された比率(FR)-3で鼻を突くように訓練され、シッパーボトルにアクセスします。短い研修期間の後、4つのオペラントコーナーのうち2つのシッパーボトルは20%アルコール(95%エタノール[190プルーフ]、水道でv/v)に交換されます。マウスは水を継続的に得られますが、24時間(12:30から12:30 PM)にわたり断続的にアルコールを摂取できます。アルコールリックは6週間にわたって定量化され、実験の途中で2日間のキニーネ不純物(0.5 mM、1.0 mM)検査を行い、罰則に配慮のない飲酒を評価します。各マウスの訪問、鼻つき、舐めのデータ(図1)を記録し、TSEの独自ソフトウェアで抽出し、オープンソースのパイプライン29を使って解析することでAUDに似た行動の洞察が得られます。

このプロトコルは、IntelliCageテストシステムの他の公開された利用例を補完し、AUD様行動30,31,32,33,34,35,36,37,38,39および他の物質使用障害様行動40,41,42を評価しています。.断続的なアクセススケジュールが齧歯類1、43、44、45、46、47の自発的なアルコール摂取を増加させるという報告と一致し、このプロトコルはほとんどのマウスで高い自発的アルコール摂取をもたらします。それでも、著者らがプロトコル全体で指摘するように、実験パラメータは実験的な問題に対応するために容易に修正可能です。総じて、この手法はAUDのメカニズムを研究者が研究する際に効率的かつ柔軟な解決策を提供します。

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図1:ユニークなRFID識別によるマウスの訪問、鼻つき、舐めの完全自動追跡。 (A) マウスRFIDトランスポンダー埋め込みの漫画図。RFIDトランスポンダーは背頸部に皮下に埋め込まれ、自動ホームケージ監視システムで個別の追跡を可能にします。(B) 自動化されたオペラント間欠性アルコールパラダイムにおけるデータ収集フェーズの概略。動物の識別が読み取られ、角の訪問はRFIDリングアンテナと温度センサーの二重測定値で記録されます。これらはどちらも陽性でなければ訪問を記録できません(左)。その後、マウスはFR-3スケジュールで鼻をつついてシッパーボトルにアクセスするように訓練されます(中)。鼻をつつくと5秒分のシッパーボトルにアクセスでき、その時点でマウスの舐めは静電容量ベースのリックメーター(右)で記録されます。ルーシー・アンダーソンによるBioRenderテンプレートを改造して作成したカートゥーンで、CC BY 4.0(https://BioRender.com/ko79xuy)のライセンス下にあります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

すべての実験手順はNIH施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の人道的ケアと利用に関する公衆衛生局の方針に準拠していました。

1. 装置の準備

注:各IntelliCage試験システムは、最大16匹の同性マウスが住むことができる大型プラスチック製のホームケージ(39 cm x 58 cm x 21 cm)で構成されています。以前のコホートはケージあたり8〜16匹のマウスの規模でした。装置には4つのオペラントコーナーがあり、すべてが上蓋の中央マイクロプロセッサに接続されています。齧歯類の餌は蓋の中央にある大きな金属製ホッパーからアクセスできます。ケージ内では、ネズミが自由に操作可能なコーナーと中央の居住空間を行き来し、そこには寝具や充実材料が設置されています。各オペラントコーナーには小さな円形の入口があり、物理的には一度に1匹のマウスしか入れません。マウスの身元は、RFIDリングアンテナと温度センサーの二重測定値に基づいて読み取り・記録されます。これらはどちらも陽性でなければ訪問が記録されません。各オペラントコーナー内には、マウスに2つのノーズポークポートがあり、それぞれが2つのモーター付きドアのいずれかへのアクセスを制御します。これらのプログラム可能なモーター付きドアは、2種類のシッパーボトルのいずれかにアクセスできるようにしています。研究者はシッパーボトルへのアクセス条件や、静電容量ベースのリコメーターの感度を手動でプログラムします。訪問、鼻つつき、舐めたデータは各マウスごとに個別に記録され、中央マイクロプロセッサを通じてTSEの独自ソフトウェアシステムが読み込まれたコンピュータに転送されます。このプロトコルでは詳しくは触れませんが、各オペラントチャンバーには嫌悪条件付けに使われるプログラム可能なエアパフバルブも含まれています。

  1. プラスチック製の家庭用ケージには、圧縮綿パッド5枚(15.24 x 25.4 cm)、小さな綿の四角い2枚(5.08 x 5.08 cm)、そして寝具やエンリッチメント用のプラスチック掘削構造4枚を装備してください。
    注:圧縮綿のパッドの使用は、(1)よく使われる寝具のほこりや剥がれがドアの機械に干渉するのを防ぐため、(2)動物同士の喧嘩をより容易に識別するためです。
  2. 上部の蓋を、角が作ったものをプラスチックのケージに入れます。
  3. 切断されている場合は、付属ケーブルを使ってすべてのオペラントコーナーを中央マイクロプロセッサに接続し、その後、CANケーブルを使ってTSEソフトウェアがプリインストールされたコンピュータに接続します。
    1. 複数の装置を使う場合は、すべてのケージを同じコンピュータに直列に接続してください。
  4. マイクロプロセッサを電源に接続し、各隅のLEDライトが点灯し、8つのモーター付きドアすべてが動くようにしてください。
  5. 8本のシッパーボトルにそれぞれ250mLの水道水(または他の液体)を満たし、キャップをしっかりと押して密閉をし、その後リコメーターの開口部に優しくねじってリコメーターとしっかりと接続します。
    注:訪問、鼻つつき、舐めの感度はパイロット実験を通じてオプションで最適化可能です。各コーナーの感度を調整するには、「コントローラー」プログラムの「ヘルプ」ファイルにあるメーカーの指示に従ってください。すべての研究では以下の設定が用いられています:訪問816オン/768オフ;ノーズポーク - 21 オン/26 オフ;リコメーター - 69 オン/80 オフ/15 タイムアウト。
  6. フードホッパーに齧歯類の餌を詰めます。
  7. コンピュータの電源を入れ、「コントローラー」アプリケーションを開き、目的の実験ファイルを読み込みます。

2. 動物の調理

注意:動物には行動検査開始の少なくとも1週間前にRFIDトランスポンダーを埋め込み、十分な回復時間を確保してください。少なくとも50日以上経過し、体重が15gを超えるマウスを使用。小型マウスを移植すると、注射時にマウスを傷つけるリスクが高まります。マウスの系統によっては、特にオスの間で集団飼育環境で攻撃性が問題になることがあります。思春期にはすべてのマウスを一緒に飼うことでリスクを軽減しましょう。著者らは成体(~PND 80–150)野生型C57BL/6マウスを用いた研究では有意な攻撃性を観察しませんでしたが、このプロトコルが他の遺伝子型、年齢、飼育環境に一般化できるとは限りません。

  1. マウスに背側頸部にRFIDトランスポンダーを皮下移植し、一意の識別を行います。
    1. すべての実験動物をリストアップしたデータテーブルを印刷し、各動物IDの横にバーコードステッカーを貼るスペースを設けてください。
    2. すべての動物と必要な物資を収集してください:RFIDトランスポンダー、再装填可能なRFIDトランスポンダーインジェクター、イソフルラン誘導装置。
    3. 最初のマウスを誘導チャンバーに入れ、蒸発したイソフルラン(酸素流量計:1.5 mL/min、イソフルラン:1.5〜3.5%)で麻酔し、マウスが大きくしゃっくりのような呼吸をし、つま先のつまみに反応しなくなるまで続けます。
      1. マウスが麻酔状態になるのを待つ間、プリインストールされた針をインジェクターのベースにねじ込み、注射器をゆっくりと排出してマイクロチップが動くのを見ます。
      2. RFIDコードを示すバーコードを印刷されたデータテーブルに、適切な動物IDの隣に貼り付けます。
    4. 誘導チャンバーからマウスを取り出し、事前に装填されたRFIDトランスポンダーを皮下で背頸部領域に埋め込みます。
      1. まずマウスがつまみに反応しないことを確認すると、利き手でない親指と人差し指で肩甲骨の真上をつまみます。
      2. 利き手で注射針をネズミの後頭部の皮下に挿入し、針を背骨の上方かつ平行に持ち上げてマウスを傷つけないようにします。
      3. 注射器の先端をマウスの首根の中に入れ、親指と人差し指でしっかりと固定した状態で、利き手を慎重に動かしてインジェクタープランジャーを押し込むようにします。
      4. RFIDトランスポンダーを排出し、利き手でない方の指を首根茎の周りにつまんだままにして、マイクロチップが注射器の先端から出たときに感じます。
      5. 後髪をつまんだまま、ゆっくりとインジェクターを外してください。インジェクターを完全に外してからだけ、トランスポンダーが落ちないようにスカラフを解放してください。
        注意:麻酔中に皮膚を閉じるために縫合結び目を一つ追加することも可能です。
    5. マウスを元のケージに戻し、麻酔からの回復を観察して完全に歩ける状態まで観察してください。
    6. 部分的な麻痺、足を引きずる、円を描くなど、ターゲット外注射を示す可能性のある身体的障害の兆候がないかマウスを監視してください。障害が24時間以上続くか、動物の健康に深刻な影響を及ぼす場合は、人道的に安楽死させてください。
      1. RFIDトランスポンダーリーダーをマウスの背頸部の上に向けてスキャンし、挿入が成功していることを確認します。
    7. オプションとして、組織サンプルを採取してジェノタイピングを行うこともあります。
      1. 実験用マウスも同様に繰り返します。
  2. 初回のRFIDトランスポンダー埋め込みの翌日、RFIDトランスポンダーリーダーを使って、ネズミがRFIDトランスポンダーを失くしていないか確認してください。もしトランスポンダーを失ったマウスがいれば、新しいトランスポンダーで同じ手順を繰り返し、記録を更新してください。
    注意:通常、マウスのRFIDトランスポンダーが落ちる場合、移植から24時間以内に落下します。これはRFIDトランスポンダーの不適切な設置や、注射部位でのマウスのグルーミング・爪のひきが原因で起こり得ます。以前の注射傷への再注入を避け、3回のRFIDトランスポンダー埋め込み失敗後のマウスは除外してください。
  3. マウスをIntelliCage装置に再収容する前に、すべてのRFIDトランスポンダーが正常に読み取れるか確認してください。すべてのマウスの体重を測り、体重を記録しましょう。

3. 実験ファイルの準備

注:IntelliCageのテストシステムは、TSEが提供するグラフィカルユーザーインターフェースを通じて制御・運用されています。IntelliCageの実験を実行するために使われるアプリケーションは「Designer」、「Controller」、「Analyzer」の3つです。実験の異なるフェーズは、「デザイナー」アプリケーションで設計され、「コントローラー」アプリケーションで実行される異なる実験ファイルを通じて実行されます。実験ファイルの設計と適応方法に関する詳細な情報は以前に説明されています(48,49)。研究で使用された4つの実験ファイル(Habituation.experiment、Water Training.experiment、Intermittent Alcohol.experiment、Open Bar.experiment)のテンプレートがプロトコルの再現を支援するために提供されています。これらのファイルでは、位相変化は12時30分に起こります。著者らがこのタイミングを選んだのは、動物が午前6時から午後6時までの光のサイクルで飼育されていたためです。これにより、飲酒行動を測定するための中断のない暗い段階が可能になりました。しかし、研究者はこの時間帯を「暗闇での飲酒」手順など他の飲酒方法と整合させるために変更したいと考えるかもしれません。

  1. 「Designer」アプリケーションで実験ファイルを設定します。
    注意:テンプレートファイルを扱う場合は、現在のコホートに入る前に4つの例示動物を削除してください。また、実験設計のグループ名を変更し、必要に応じてグループ名を追加してください。新しいグループはすべてテンプレート内のクラスタと同じクラスタから始まるようにしてください。
    1. 「Designer」アプリケーション内のHabituation.experimentファイルを開き、各マウスの動物ID、RFIDトランスポンダーコード、実験グループ/遺伝子型を慎重に入力してください。テンプレートファイルを維持するために新しい名前で保存してください。
      注意:RFIDトランスポンダーコードの誤入力は、データが記録されません。動物を関連する実験グループに割り当てることで、その行動の監視やデータの分析に役立ちます。
    2. 動物情報を動物ファイルとしてエクスポートしてください。
    3. 実験の各段階ごとに、対応する実験ファイルを開き、動物ファイルを読み込みます。適切に保存して名前を変更してください。
    4. 別のコンピュータでファイルを設計する場合は、実験ファイルを携帯用フラッシュドライブにダウンロードして行動室へ運びます。
  2. すべての実験ファイルをIntelliCage装置に接続されたコンピュータにダウンロードし、「コントローラー」アプリケーションで最初のファイルを開きます。すべての情報が正しく読み込まれているか確認してください。
  3. 紙でも電子でも、実験の各フェーズを開始・終了できる日時を記録した実験ログファイルを作成しましょう。これは分析に大いに役立ちます。なぜなら、特定の薬物状態(例えばキニーネ添加アルコール)はIntelliCageのアーカイブファイルに記録されていないからです。

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図2:オペラント間欠的アルコール飲酒パラダイムの実験的タイムライン。 (A) インテリケージ装置の回路図で、四隅のうち二隅にアルコール入りのシッパーボトルがある。(B) 前回の出版物23で使用されたすべての実験段階のスケジュールを示す実験タイムライン。コホート1は間欠的な飲酒後にキニーネ混入アルコール検査を実施し、コホート2および3は混入後に再び断続的な飲酒に戻った。(C) すべての実験段階のソフトウェア変更を示す詳細な実験カレンダー:慣性化、水の訓練、断続的な飲酒、キニーネ混入アルコール検査、「オープンバー」/無料飲酒。「アルコールアクセスオン」モジュール終了後は、少なくとも週に一度ケージ交換が予定されています。ルーシー・アンダーソンによるBioRenderテンプレートを改造して作成したカートゥーンで、CC BY 4.0(https://BioRender.com/ko79xuy)のライセンス下にあります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 実験の実施

注:オペラント的断続的アルコール飲酒パラダイムは5つの段階から成り立っています:(1)慣れ、(2)水のトレーニング、(3)断続的な飲酒、(4)キニーネ混入アルコール検査、(5)「オープンバー」/フリーアクセスの飲酒。実験の各段階は異なる実験ファイルで実行されますが、間欠的なアルコール飲酒試験とキニーネ添加アルコールテストはどちらも Intermittent Alcohol.experiment ファイルで指定されたパラメータを使用します。ケージ交換以外では、実験者は週に少なくとも3回ネズミの健康状態を確認し、ソフトウェアが正しく動作しているか確認すべきです。怪我や体調不良が見つかったマウスは実験から除外すべきです。実験スケジュールの例については 図2を参照してください。

  1. ケージの変更
    注意:ケージ交換は週に最低1回行う。飲酒時は、飲酒の妨げを避けるため、午後12時30分以降の「Water Access ONLY」期間のみこれらの変更を行います。これを促進するために、 Intermittent Alcohol.experiment と Open Bar.experiment ファイルは常に「Water Access ONLY」で始まります。ケージの大きさのため、一人で飼育中のケージを扱うのは難しいです。著者らは、ケージの交換には少なくとも1名の追加研究者を補助することを推奨しています。ケージ交換のたびに24時間必ずマウスをチェックし、ソフトウェアが正しく動作しているか、ケージ交換のストレスによる攻撃や喧嘩が起きていないか確認してください。
    1. ケージ交換を始める前に、新しいきれいなプラスチックケージに新しい寝具や巣材を用意してください。8つのシッパーボトル/ケージそれぞれに、水道水またはアルコール20%(水道水で95%エタノール[190プルーフ]、v/v)を注ぎます。
      注意:必要に応じて、調査員は新しい清潔なケージに古い寝具材を少量追加することができます。これにより既存の集団階層の混乱を最小限に抑え、争いのリスクを下げる可能性があります。
    2. 「コントローラー」アプリケーションでの実験をやめてください。オペラントコーナーにネズミがいないことを確認した後、金属製のフードホッパーを取り外します。一人が金属製のマイクロプロセッサ装置を持ち上げ、もう一人がプラスチックケージをその下から滑らせて引き出せるようにします。正しいマウスの数を確認してください。
    3. 汚れたケージからネズミを一匹ずつ取り出し、RFIDトランスポンダーをスキャンし、体重を記録します。各マウスの怪我や病気の兆候を目視で確認してください。
      注:著者らは、体重を電子スプレッドシート(csv)に記録することを推奨しており、これにより分析パイプラインに読み込みやすくなります。
    4. 体重を記録した後、マウスを一時的に清潔な容器に入れます。
    5. 消毒液を浸した濡れたタオルで上部と角をきれいにしてください。コーナープレートの表面と底の溝を、液体が電子部品に漏れないように細心の注意を払ってください。
    6. 金属製のマイクロプロセッサ装置を十分に持ち上げて、新しく清潔なプラスチックケージを所定の位置に滑らせる。
    7. 新しいシッパーボトルをリコメーターの開口部に優しくねじ込み、リコメーターとしっかり接続します。
    8. マウスを新しく清潔な装置に移します。
    9. フードホッパーを新しく清潔なフードホッパーと新鮮なネズミの餌に交換してください。
    10. 「コントローラー」アプリケーションで同じ実験を再起動するか、新しい実験ファイルを読み込んで開始してください。
    11. プログラムが正しく動作していること、すべてのマウスが訪問、鼻つつき、舐める動作を適切に記録していることを確認してください。
      注意:「コントローラー」プログラムは、動物が12時間以内にリックを記録していない場合、自動的に警告を表示します。
    12. 汚れた機器を掃除する。プラスチックケージ、シッパーボトル、プラスチック製の掘削構造物は、一般的なケージ洗浄システムで洗うことができます。
  2. 第0日目:習慣化
    注意:慣れフェーズは Habituation.experiment ファイルを使って実行されます。この段階では、すべてのシッパーボトルに水道水が入っています。ネズミはオペラント鼻突きなしですべての哺乳瓶に自由にアクセスできます。ネズミが操作コーナーに入るとモーター付きドアが開き、シッパーボトルノズルへのアクセスが現れます。
    1. RFIDトランスポンダーの存在を確認しマウスの体重を記録した後、8本すべてのシッパーボトルに~250mLの水道水を入れ、リコメーターの開口部に優しくねじります。
    2. 最大16匹の同性マウスを準備されたIntelliCage装置に入れます。
    3. Habituation.experimentファイルを「Controller」アプリケーションに読み込み、録画を開始します。
    4. ネズミが操作コーナーに入るときにすべての電動ドアが正しく開いているか、そしてすべての訪問、鼻つつき、舐める動作が各マウスで正常に記録されているかを確認してください。6時間以内にネズミの訪問、鼻つつき、舐められた記録がなければ、.animalファイルで誤りを確認してください。
  3. 1〜3日目:水のトレーニング
    注:水のトレーニングフェーズは Water Training.experiment ファイルを使って実行されます。すべてのシッパーボトルには水道水のみを含み続けてください。このフェーズでは、FR-1でマウスに鼻をつつく訓練を行い、その後FR-3のスケジュールでシッパーボトルノズルにアクセスする訓練を行います。鼻をつつくことに成功すると、電動ドアが開き、5秒間シッパーボトルにアクセスできるようになります。個体マウスが60%以上の成功率に達すると、プログラム期間の残り期間はFR-3スケジュールに移行されます。通常、マウスは24〜72時間以内にFR-3のスケジュールに移行します。「コントローラー」で動物のパフォーマンスを監視してください。動物が72時間以内にFR-3スケジュールに達しない場合は、さらなる実験から除外してください。
    1. 24時間の慣れ後、すべてのマウスが水分補給で怪我をしていないように見えたら、 Habitatuation.experiment ファイルの実行をやめて Water Training.experiment ファイルの実行を開始してください。
    2. 各マウスの訪問、鼻つつき、舐めた動作がソフトウェアによって正常に記録されているか、すべての電動ドアが正しく開いているかを確認しましょう。
  4. 4日目+:断続的な飲酒
    注:断続的な飲酒フェーズは Intermittent Alcohol.experiment ファイルを使って実行されます。この段階では、4つのオペラントコーナーのうち2つのシッパーボトルが20%アルコールに置き換えられます。水とアルコールの角は実験ファイルの「クラスター」機能で事前に指定されています。テンプレートでは、水は1番と3番(「ニュートラル」とラベル付け)に、アルコールは2番と4番(「不正」とラベル付け)に配達されます。ネズミは水を継続的に得られますが、24時間(12:30から12:30)に隔日で断続的にアルコールを飲んでいます。FR-3では全コーナーで5秒のシッパーボトルアクセスが可能です。この段階では、飲酒の妨げを避けるために「水へのアクセスのみ」期間中にケージ交換を行います。研究者は、実験グループが水の訓練中に4つのコーナーすべてをほぼ同等に好むことを確認し、その後に断続的な飲酒用のアルコールコーナーを割り当てるべきです。各コホートでは、実験グループが水の訓練中にほぼ均等に四方の訪問と舐め回しを示しました。このため、著者たちはコーナーの割り当てをコホート間で固定しました。実験者は「コントローラー」プログラムを使って、コーナーを越えたリックやビジングの割合を簡単に確認できます。実験中は定期的にデータを監視し、機器の故障やネズミが特定の角を「独占」しないか確認してください。
    1. すべてのマウスがFR-3スケジュールを達成してシッパーボトルにアクセスした後、20%アルコール(95%エタノール[190プルーフ])を水道水で準備し、v/v;~250mL/ボトル。
    2. Water Training.experimentファイルの実行をやめてください。
    3. オペラントコーナー2と4(または実験ファイルで指定したコーナー、異なる場合は)にあるシッパーボトルを取り出し、それぞれ20%アルコール~250mLに置き換えます。
    4. 新しいアルコール入りシッパーボトルをリコメーターの開口部に優しくねじり、リコメーターにしっかりと繋がるようにします。
    5. Intermittent Alcohol.experimentファイルを読み込み、録画を開始します。
    6. 各マウスの訪問、鼻つつき、舐めた動作がソフトウェアによって正常に記録されているか、すべての電動ドアが正しく開いているかを確認しましょう。
    7. 翌日12時30分以降、プログラムが「Water Access ONLY」から「Alcohol Access ON」モジュールに正常に切り替わったこと、そしてアルコールを含むオペラントコーナーでリックが録音されているか確認してください。
  5. 16日目+:キニーネ混入アルコール検査
    注:キニーネを含んだアルコール検査フェーズは Intermittent Alcohol.experimentファイルを使用して実施されます。この段階では、以前20%アルコールが含まれていた2つのオペラントコーナーのシッパーボトルを0.5 mMに置き換え、その後1 mMのキニーネを20%アルコールの不純化で処罰に敏感にしない飲酒を評価します。これらのキニーネ濃度はそれぞれ0.016%と0.032%のキニーネ(w/v)に相当し、以前にグループ27、28 およびその他の31 群による検査で嫌悪感をもたらすことが判明しています。マウスは水に継続的にアクセスしていますが、24時間間隔でキニーネを混ぜたアルコールに断続的にアクセスしています(すなわち、0.5 mMキニーネを1日、水のみを1日利用するなど)。 1日1.0 mMキニーネを投与。すべての角に対してFR-3のスケジュールでアクセスが可能です。本研究では、マウスが16日または24日間連続して断続的なアルコール摂取を行った後にこの段階を行った。水の日には、不純物検査の合間にケージ交換を行い、ストレスによる混雑影響を避けるため行われませんでした。この実験の段階の後、マウスは「オープンバー」や自由アクセスの飲酒を開始するか、または再開してリバウンド飲酒を評価するために断続的な飲酒に戻ることができます。
    1. 0.5 mMおよび1 mMのキニーネ不純アルコール20%(95%エタノール[190プルーフ]、水道水でv/v;~250 mL/ボトル)を準備します。
    2. ケージ交換を行い、すべてのシッパーボトルを取り除いてください。
    3. 各シッパーボトルのアルコールコーナーに、0.5 mMのキニーネ添加20%アルコール溶液を~250 mL充填します。
    4. 新しいアルコール入りシッパーボトルをリコメーターの開口部に優しくねじり、リコメーターにしっかりと繋がるようにします。
    5. Intermittent Alcohol.experimentファイルを読み込み、録画を開始します。
    6. 各マウスの訪問、鼻つつき、舐めた動作がソフトウェアによって正常に記録されているか、すべての電動ドアが正しく開いているかを確認しましょう。
    7. 12時30分以降、プログラムが「Water Access ONLY」から「Alcohol Access ON」モジュールに正常に切り替わったこと、そしてオペラントコーナーにアルコールを含むリックが録音されているか確認してください。
    8. 翌日のアルコール日の正午30分までに、アルコールコーナーの各ボトルを1 mMのキニーネ添加20%アルコール溶液で~250 mLに入れ替えてください。ボトルの切り替えのために実験を中止する必要はありません。
    9. 次のアルコールデーの正午30分までに、混入アルコール入りのシッパーボトルを取り出し、それぞれ20%の純アルコール~250mLに交換してください。
  6. 20日+:「オープンバー」/飲酒無料アクセス
    注意:非オペラントコントロールとして、1日の「オープンバー」または無料飲酒を1日実施することも可能です。このフェーズは Open Bar.experiment ファイルを使って実行されます。この段階では、4つのオペラントコーナーのうち2つのシッパーボトルに20%のアルコールが含まれており、ネズミは24時間(12:30から12:30)にアクセスできます。角に来れば、鼻をつつかなくても扉が開けます。本研究では、マウスは断続的な飲酒段階またはキニーネ添加アルコール検査のいずれかの段階後にこの課題の段階を実施しました。
    1. 必要に応じて、アルコール20%(95%エタノール[190プルーフ])を水道水に調合し、v/v;~250mL/ボトルを準備します。
    2. 次のアルコールデーの12時30分以前には、現在の実験ファイルの実行をやめてください。
    3. 必要に応じて、アルコールの角にあるシッパーボトルを取り除き、それぞれ20%アルコール~250mLに交換してください。
    4. 新しいアルコール入りシッパーボトルをリコメーターの開口部に優しくねじり、リコメーターにしっかりと繋がるようにします。
    5. Open Bar.experimentファイルを読み込み、録画を開始します。
    6. 各マウスの訪問、鼻つつき、舐めの動作がソフトウェアで正常に記録されていること、そしてすべての電動ドアが自由に開いているかを確認してください。
    7. 12時30分以降、プログラムが「Water Access ONLY」から「Alcohol Access ON」モジュールに正常に切り替わったこと、そしてオペラントコーナーにアルコールを含むリックが録音されているか確認してください。

5. データの分析

注意:各実験のデータはプログラムが停止されるまで内部に保存されます。その時点で、圧縮されたデータアーカイブファイルが作成され、ローカルのハードドライブにC:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archivesに保存されます。ファイル名はプログラム開始日と時間で構成され、終了は.zipです。 データアーカイブファイルには、実験に関するすべての関連情報が含まれており、コーナー訪問(開始時刻、終了時間、所要時間、訪問シーケンス)、ノーズポーク(開始時刻、終了時間、持続時間)、リック(開始時刻、終了時間、持続時間)、明暗時刻、温度データなどが含まれます。このデータアーカイブは「アナライザー」プログラムで読み取って解析できます。IntelliCageのデータ出力を解析するための他のオープンソースパッケージも存在します(Ruffiniら、2021年;Gastaldiら、2025年)を発表し、著者らはtidyverseの公開パッケージを用いてRでデータ解析パイプラインを作成し、断続的な飲酒パラダイムのデータを分析しました。パイプラインには複数の品質管理ステップが含まれており、1匹あたりのコーナー占有率の分析、概日リズムの平均的な訪問頻度、鼻つつき、舐める頻度、FR-3のリック獲得率はマウス1匹あたり;そして1匹あたりの1日の舐め回数。さらに、著者らは飲酒指標の脚本に基づく分析も提供しています。基盤は、Quartoマークアップ言語を用いたRノートブックテンプレートファイルで、データファイルを処理し、動物群特有のバリエーションにも適応可能です。解析はRStudioの無料版を使って行われます。RのプロジェクトテンプレートファイルはGitHubリポジトリ29にあります。

  1. 「コントローラー」アプリケーションで出力されたzipファイルやマウスの体重データを含むCSVファイルを含むすべてのデータをコンパイルしてください。
    注意:体重を体重で正常化するために、体重を標準化する必要があります。このワークフローでは、各実験ファイルに追加するよりも、重量データを別ファイルにまとめる方が理にかなっていました。最初の列はアーカイブファイルの動物IDと一致する必要があります。
  2. GitHubリポジトリからRプロジェクトのテンプレートをダウンロードしてください。
    1. 実験に合わせてプロジェクト名を変えてください。
    2. このテンプレートには、解析の仕組みを示すサンプルデータファイルがdata/C1サブフォルダに収録されています。アーカイブファイルをパーソナライズされたデータアーカイブに置き換えましょう。
  3. RStudioを起動してプロジェクトを開いてください。
    1. RStudioの右下にあるウィンドウのファイルセクションで、qmdフォルダに移動してIC_template.qmdファイルを開きます。
    2. テンプレートファイルを複製し、実験に合わせて名前を変えます。
    3. 複製ファイルのYAMLヘッダー部分と初期コードチャンクのメタデータを調整します。
    4. RディレクトリのIC_Commons.Rファイル内のグループ名を実験グループと一致するように調整してください。(テンプレートはコントロールとLBNの2つのグループを用いています。)
  4. ノートファイルを実行してください。
    注意:より詳細な指示はGitHubリポジトリの README.md ファイルに記載されています。

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図3:訓練および断続的な飲酒期における全マウスのオペラントコーナーへのアクセスが比較 的であること。コホート1マウス23では、(A)慣れと水の訓練中の各マウスの1日あたりの総時間と(B)最初の4日間の断続的な飲酒(n = 15 F、16 M)を比較したヒートマップ。濃い赤色は1日にコーナーにいる時間が長くなることを示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:ネズミは概日リズムに沿った訪問、鼻つつき、舐めを行い、FR-3スケジュールでオペラントなシッパーボトルへのアクセスを成功裏に獲得する。コホート1マウス23では、テスト開始から最初の8日間のセッション期間中のオペラントコーナー訪問(A)、鼻つつき、(C)舐めの平均密度が見られます。(D) 水の訓練中に各マウスがFR-3比率で成功して舐めるまでの時間。(E) 慣れ訓練および水の訓練中のマウスの訪問成功率(= 舐めた回数/総訪問数の割合)と断続的な飲酒の最初の4日間(右)の比較。円の記号は女性(n=15)を示します。四角い記号は男性(n = 16)を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5:マウスは訓練中と断続的な飲酒期にほぼ同じ1日の舐め速度を行っています。(A)メス(n = 15)および(B)オス(n = 16)コホートのうち、1マウス23匹、慣れと水の訓練(4日目から0日目)での1日の水(青)とアルコール(赤)舐めの合計数と断続的な飲酒(1〜4日目)を比較しました。Cは制御育成、LはLBN育成を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図6:幼少期の逆境にさらされたマウスは、オペラント間欠性アルコール飲酒パラダイムにおいて対照群より多くのアルコールを飲む。 (A) 8日間の断続的なアルコール摂取期間中、対照群(左)とLBN育て(ピンク、右)マウスの1日あたり平均アルコール舐め数(g;週単位測定)。(B)キニーネ混入前後の体重で標準化された1日あたりの平均アルコールリック数(0.5 mM、1 mM)。(C) 1日あたりの平均アルコールリック量を体重で正規化した1日あたりの密度プロット(FR-0「オープンバー」アルコールアクセス日)。円の記号は女性(n=15)を示します。四角い記号は男性(n = 16)を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

著者らはIntelliCagesを用いた自動ホームケージテストを用いて、初期の逆境(ELA)がAUD様行動に対する脆弱性にどのように影響するかを評価しました27。逆境を誘発するために、彼らは資源不足のモデルである有限な寝床と巣作り(LBN)パラダイムを用いました。これは予測不可能で断片的な母性ケアを引き起こすモデルです 51,52,53,54,55,56。この研究は、社会的隔離によるストレスの交絡影響なしに、社会的に飼育されたマウスにおけるELAがアルコール飲酒行動に与える影響を評価する点で新しいものでした。これは、成人期の社会的孤立がELA曝露マウスに差異的な影響を与えることが知られていることを踏まえる重要な点です。最大のスループットを得るために、著者らは4つのIntelliCage装置(男女ごとに2つ)で同時に飲酒行動を測定しました。

著者らは、生データの徹底的な品質管理から分析パイプラインを開始しました。ここに含まれているプロットは、発表された研究23のコホート1(n = 15 F、16 M)からの代表的なデータを示しています。すべての解析とプロット作成のためのスクリプトはGitHubリポジトリ29に含まれています。実験第0日目はケージチェンジによりデータ収集が妨げられたため除外されています。データ探索と品質管理の考慮事項として、著者らはすべてのマウスが訓練段階(図3A)および断続的な飲酒段階(図3B)の両方でほぼ平等にすべてのオペラントコーナーにアクセスできるようにしました。これにより、ネズミがオペラントの角を「独占」し、他のネズミがシッパーボトルにアクセスするのを防ぐ重大な影響は除外されます。著者らは次に、マウスが実験日数を通じて予想される概日リズムで訪問、鼻つつき、舐めを行っていることを検証し、すべてのマウスがモジュール開始から6時間以内にFR-3比率で最初の舐めに成功したことを検証しました(図4D)。水のトレーニングフェーズの終わりには、すべてのマウスが比較的高い舐め成功率(=舐め回数/総訪問数の割合)を達成し、水の訓練終了時には訓練が成功していることがさらに確認されました(図4E)。

慣れ、水の訓練、断続的な飲酒開始の間、マウスはほぼ同等の数の1日の舐めを維持していました(図5A–B)。一部のマウスは実験的水トレーニング開始時(例:P241260-1日目)に1日の総舐め回数が減少しましたが、ほとんどのマウスはFR-1およびFR-3の鼻突きスケジュールを素早く習得し、基準的な舐め速度を維持しました。したがって、マウスが水中トレーニング中に過度の脱水症状を経験した可能性は低いです。すべてのマウスはFR-3スケジュールを適切な速度で学習しました。実験1日目に断続的な飲酒が始まると、ほとんどのマウスが飲酒を選びましたが、その頻度は異なりました。一般的に、マウスはアルコールを摂取しても1日の総舐め回数を有意に増やしませんでした。代わりに、マウスはアルコール摂取量の増加に対応するために水舐めの回数を減らしました。

断続的な飲酒日々のコホート1マウスは体重に対して1日のアルコール舐め量が大きく変動しました(図6A)。著者らは、LBNパラダイムを受けたマウスはクロスフォスター対照群よりも有意に体重が軽かったことを発見しました23。したがって、飲酒のグループ差を調べる際、彼らは体重で1日のアルコールリックを標準化し、著者らはケージチェンジ中に体重を週ごとに評価しました。LBNで育てられたマウスは、断続的な飲酒(図6A)およびキニーネの混入(図6B)の両方で、対照群よりも体重あたりのアルコール量が多いことが一般的でした。この傾向は、非オペラントオープンアクセスの1日でも維持されました(図6C)。コホート1のこれらの結果は、ELA曝露マウスが断続的アクセス中にクロスフォスター対照群よりも体重あたりのアルコール量を一貫して多く飲んだと報告している結果と一致しており、特に男性23で顕著でした。

自動化された自宅ケージ監視システムの効率性により、発表された研究では、社会的に収容されたELA曝露齧歯類において、男女両性を含む非常に豊富なサンプルサイズでアルコール飲酒が増加していることが確認されました(n = 54人の対照群、43 LBN)23。これらの結果は、逆境の子ども時代の経験歴を持つAUD患者に見られるAUD様行動のモデル化における一歩であり、ELA後のAUD脆弱性増加の根底にある神経生物学的研究のメカニズム研究への道を開きます。

ディスカッション

著者らがELA27 に曝露されたマウスのAUD様行動をIntelliCagesを用いて堅牢に評価し、過去のトランスジェニック系統28の研究に例として、自動ホームケージモニタリングシステムはAUDの前臨床モデルを研究するための効率的かつ柔軟なソリューションを提供します。最大16匹の共養マウスを同時に評価することで、社会的孤立によるストレスの混乱を回避しつつ、アルコール飲酒方法のスループットを大幅に向上させます。オペラント的・断続的な飲酒パラダイムは、実験者が1~5〜6週間の間に過度飲酒、時間の経過によるエスカレート、罰を与えない飲酒など、AUD様の複数の側面を調査することを可能にします。このパラダイムはAUD様の行動を評価する方法を一つ提供しますが、この設計は断続的な飲酒をより慢性的に測定したり、空気の吸い込みに対する罰感度の低い飲酒の検査や、可変オペラント比率の追加など、さまざまな可能性に容易に適応可能です。総じて、自動化された自宅ケージモニタリングシステムは、AUD様の挙動を評価するためのスループットと特異性を大幅に向上させ、新規の基礎回路や治療法の特定を促進します。

すべての技術と同様に、著者は時折機械的・技術的な故障を経験します。システムを監視なしで稼働させたい誘惑はありますが、調査官は装置の正常な動作を確保するために定期的に監視し続けることが極めて重要です。磁気扉の機械的な故障が時折起こり、マウスがシッパーボトルにアクセスできなくなることもありました。適切な清掃とメンテナンスが行われれば、これはまれに起こり、データ収集への影響も最小限でした。誤りを迅速に特定するためには、シッパーボトルの液体量の減少を監視し、「コントローラー」アプリですべての動物の舐めが全ての隅々で記録されているか定期的に確認することが重要です。より詳しいアドバイスとして、増田氏らがIntelliCages48のセットアップとメンテナンス方法について優れた説明を紹介しています。

また、闘争やその他の混乱行動を監視するために、動物の行動を定期的に観察することも不可欠です。著者らはC57/BL6マウスでこのパラダイムを扱った際に大きな問題はなかったものの、より攻撃的な遺伝子型のオスを共存させることで重大な問題が生じました。特にケージ交換後は、乾いた血や足を引きずる動物、その他の喧嘩の兆候を定期的に観察しましょう。これらの兆候に気づいたら、問題のある動物をすぐに排除し、さらなる実験から除外してください。提供されたコードの「個別マウスパフォーマンス」セクションを使って、攻撃性が個々のマウスの飲酒行動にどの程度影響を与えたか、またどの程度影響したかを評価してください。影響を受けた日はすべて分析から除外してください。前述の通り、著者らはプロトコルが異なる遺伝子型や居住環境に一般化できるとは保証できません。

関連して、著者らは時折、マウスが何時間も同じ隅で寝たり占拠したりすることで、オペラントの隅を「独占」する問題に直面していました。この動作により、他のネズミがその隅のシッパーボトルにアクセスできなくなります。こうした状況は、分析で適切に考慮されなければ飲酒結果を混乱させる可能性があります。提供されたコードの「コーナー占有(訪問時間)」および「個別マウスのパフォーマンス」セクションを使って、「独占」がマウスの行動に十分な影響を与え、特定の実験日を除外するかどうかを判断してください。一般的に、実験中に社会的行動を記録または定量化できないことが、この自動モニタリングシステムの大きな制約となっています。

最後に、高度な神経科学的手法がますます一般的になるように、自動ホームケージモニタリングシステムは大量のデータを生成します。ここで示された29や他者が開発したようなオープンソースコード(63,64)を通じて、実験者は出力データを整理・分析するための複数のツールを利用できます。ただし、ここで示すプロトコルの変更にはコードの適応が必要となります。さらに、ここに示されていない膨大なアウトプットデータの宝庫に対して、多数の追加分析が実施される可能性があります。

例えば、研究者はアルコール摂取量(マウス重量1kgあたりのアルコールg)を定量化することに関心があるかもしれません。著者らはこれについて簡単に論じ、GitHubリポジトリ29で分析を行うための予備的なコードを提供しています。ここで、著者らはカシア・ラドワンスカらの計算と一致する1.94 μL/リックのリックから体積への換算係数を用いています。このリック換算係数は、他の分野のアルコール消費量の推定に使われてきましたが、実際には水の摂取量を測定して計算されました。したがって、水とアルコールの表面張力の違いにより、20%のアルコール摂取量を正確に測定できるとは限りません。他の研究者は3 μL/lick 31,34,36,38というリック換算係数を用いており、この測定の解明の必要性が強調されています。マウスが異なるサイズの舐めをする可能性も排除できず、この計算はさらに複雑になります。研究者がアルコール摂取量(g/kg/day)を正確に測定したい場合、著者らは実験デザインに沿ったリックから体積への換算係数を計算することを推奨しています。

結論として、自動化された自宅ケージモニタリングシステムの進歩とアクセスの拡大は、AUDの研究者に臨床前段階でのアルコール飲酒評価のための新しく改良されたツールを提供します。このようなオペラント間欠的アルコール飲酒パラダイムは、実験者がAUD様の複数の側面を、従来の方法論よりもはるかに高いスループットと高い行動学的関連性で同時に評価することを可能にします。IntelliCageのテストシステムとオープンソースの代替手段20,26を通じて、研究者はAUDに適合する飲酒行動をより効率的かつ柔軟に調査し、効果的な介入策の特定を加速させることができます。

開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NIH)のNIH内部研究プログラム(V.A.A.、ZIA AA000421からの資金提供を受けて支援されました。ZIA MH002987)。このプロトコルの開発にご協力いただいたミリアム・ボカースリー、アヌー・マスケリ、エリン・マレーに感謝申し上げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
エタノール、190プルーフデコン・ラボラトリーズ2801G
IntelliCageテストシステムTSEシステムズhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/2000P静的ケージ1基(Tecniplast、2000P001)などが含まれています。4つのマウスハウス(テクニプラスト、ACRE011)、8つのシッパーボトル(テクニプラスト、ACBT0252)とキャップ(テクニプラスト、ACCP3521)
IntelliCageソフトウェア(「デザイナー」「コントローラー」「アナライザー」)TSEシステムズhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/バージョン 3.6.9.0
アイソパッド、6インチ×10インチブレイントリー・サイエンティフィック社ISO 6105圧縮綿繊維パッド(15.24 x 25.4 cm)
イソフルランバクスター10019-360-40
イソフルランVXP&トレード;ウェルフィル・ヴェポライザー獣医91305535
実験用齧歯類の食事LabDiet5001
中密度の確実なマウス/ラット誘導チャンバー ワールド・プレシジョン・インスツルメンツEZ-178
巣アンカーレNES 3600小さな綿のスクエア(5.08 x 5.08 cm)
OHAUSコンパス&トレード;CXスケール - 2,200グラム×1グラムウリネH-8110マウスの体重測定について
PC + ディスプレイスーパーマイクロhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/IntelliCageテストシステムの一部として販売
RFIDトランスポンダー(1.25 x 7 mm)TSEシステムズ290000-IC-60400
RFIDトランスポンダーインジェクターAVIDAVID2028
RFIDトランスポンダーリーダーTSEシステムズ290000-IC-50800
RStudioポジットhttps://posit.co/download/rstudio-desktopバージョン 2026.01.1+403;Tidyverse(2.0.0)およびQuarto(1937年9月1日)と共に
トライポーア使い捨てビーカーコンソリデーテッド・プラスチックス45317マウスの体重測定について

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