統合失調症におけるSUCNR1およびGPR37L1のバイオインフォマティクスおよび定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応解析

サマリー

本研究は、GSE54913統合バイオインフォマティクス解析、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)検証、および独立したコホートにおける言語記憶との相関解析を通じて、SUCNR1およびGPR37L1統合失調症関連分子マーカー候補として評価します。

要約

統合失調症は、多数の遺伝的感受性要素を関与させる重度で複雑かつ多因子的な精神障害であり、重大な障害、罹患率、死亡率を引き起こします。病態生理や病因の理解は大きく進んでいるものの、統合失調症の特定の診断バイオマーカーは依然として捉えていません。本研究は統合失調症に関連する候補分子マーカーの特定を目的としました。公開されたマイクロアレイデータセットGSE54913で統合バイオインフォマティクス解析が実施されました。Gene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路解析により、最も有意に濃縮されたGO用語はチャネル活性に関連しており、受動的な膜貫通トランスポーター活性、イオンチャネル活性、ゲートチャネル活性、基質特異的チャネル活性などが含まれていました。KEGGの濃縮経路の上位5つは、インスリン分泌、cAMPシグナル伝達経路、ヌクレオチド切断修復、TNFシグナル伝達経路、グルタチオン代謝でした。検証は武漢榮軍有府病院の独立したサンプルセットを用いた定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて実施されました。qRT-PCR結果はマイクロアレイ解析とほぼ一致していました(Pearson r = 0.89、95% CI:0.66–0.97)。タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析により、GO用語の「イオンチャネル活性」と有意に関連してKEGG経路の「インスリン分泌」に富む2つのハブ遺伝子SUCNR1とGPR37L1が特定されました。さらに、SUCNR1の発現は言語記憶スコアと負の相関を示しました(r = -0.54、P = 0.015)、GPR37L1発現は正の相関(r = 0.59、P = 0.0034)でした。これらの発見は、SUCNR1およびGPR37L1発現の変化が統合失調症と関連している可能性を示唆し、さらなる研究のための分子マーカー候補となる可能性があります。

概要

統合失調症は、原因不明の慢性的かつ複雑な精神障害であり、重度の脳機能障害、認知障害、心理社会的欠損を特徴と^します。世界で2,100万人以上に影響を及ぼす大きな世界的な健康負担となっています^。診断および治療的アプローチは過去50年間で大きく進化してきましたが、主要な病因は依然として不明瞭であり、重大な障害、罹患率、死亡率に関連する長期的な転帰も著^{しく改善されていません}。したがって、潜在的な重要な遺伝子や調節標的を特定することは不可欠です。

統合失調症の病態生理は完全には解明されていませんが、遺伝的多型性や発現変異に広く起因すると^{されています。}例えば、エストロゲンα遺伝子の遺伝的変異は、代替遺伝子調節や転^{写処理を通じて}統合失調症の感受性に影響を与える可能性があります。同様に、NRG1の機能的プロモーター変異体は統合失調症と関連し、タイプIII NRG1アイ^{ソフォーム6}の発現低下と相関しています。死後研究では統合失調症の脳におけるPDE4Bアイソフォームの発現が有意に減少し、その予測可能性を示唆しています⁷。その他の候補には、シナプスドーパミンレベルを調節しバイオマーカーとして機能するドーパミントランスポーター(DAT)、小胞性モノアミントランスポーター(VMAT2)、モノアミンオキシダーゼ(MAO)など^{があります。}さらに、TCP1は統合失調症9におけるアクチンの不適切な折りたたみによって細胞骨格の欠損に寄与^{する可能性があります。}したがって、統合失調症の病因における遺伝子発現プロファイルの解明は、リスク予測、機構的理解、治療評価に関する洞察をもたらす可能性があります。

近年の計算的手法は、統合ネットワーク解析と機械学習手法を通じて疾患関連遺伝子の同定を進展させています(10,11,12)。多くの遺伝学的研究にもかかわらず、統合失調症の臨床実践に翻訳された信頼できる血液ベースの診断バイオマーカーは存在しません。このギャップを埋めるため、本研究では統合バイオインフォマティクス手法を用いて、統合失調症患者と健康対照群の血液由来トランスクリプトミクスデータを含むGSE54913データセットを再解析しました。このデータセットが選ばれた理由は、(1) 末梢血液サンプルが低侵襲かつ臨床的に実用的であること、(2) 公開されている統合失調症マイクロアレイデータセットの中で比較的大きなサンプル数を含むこと、(3) 生データが再解析可能であることからです。本研究の目的は、(1) GSE54913統合失調症患者と健康な対照群を用いて遺伝子の発現に差をつけること、(2) 機能豊か化およびPPIネットワーク解析を行い、ハブ遺伝子を特定すること;(3) 独立したコホートにおけるqRT-PCRによる候補遺伝子の発現を検証すること;(4) ハブ遺伝子発現と言語記憶パフォーマンスの相関を探ること。著者の知る限り、SUCNR1およびGPR37L1を統合失調症の血液ベースの分子マーカー候補として初めて特定した研究です。

プロトコル

本研究は武漢榮軍有福病院倫理委員会(プロジェクト識別コード、YF-IRB202310215)により承認され、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施されました。参加者全員が中国系コミュニティの住民であり、書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。

被験者と血液採取
統合失調症と診断された成人10名と、3世代以内に精神疾患の家族歴がない健康な対照ボランティア10名が登録されました。統合失調症患者の対象基準:(1) DSM-5基準に基づく統合失調症の診断で、2名の独立した上級精神科医によって確認されていること;(2) 18歳から65歳;(3) 血液採取の少なくとも4週間前から抗精神病薬の変更がないこと;(4) 書面によるインフォームド・コンセントの提供意欲。除外基準:(1) 併存する主要な医療疾患(例:糖尿病、心血管疾患、がん);(2) 過去6か月以内の薬物乱用または依存;(3) 知的障害;(4) 妊娠または授乳。健康な対照群の対象条件:(1) 精神疾患の個人または家族歴(3世代以内)がない;(2) 現在または過去に抗精神病薬の使用がないこと;(3) 年齢および性別が統合失調症グループに適合している;(4) 重大な病気がないこと。統合失調症患者の平均疾患期間は6.8年±12.5年、全患者は安定型抗精神病薬を服用しており(リスペリドン6名、オランザピン4名)、平均PANSSの総合スコアは76.4±12.3でした。対照群は年齢(±5歳)と性別(各グループに男性5人、女性5人)でマッチングされました。言語記憶はホプキンス言語学習テスト改訂版(HVLT-R)の総想起スコアを用いて評価されました。すべての被験者は2025年1月1日から7月31日まで武漢榮軍有府病院から募集されました。基準人口統計は 表1にまとめられています。

サンプルサイズは、効果量1.2、効果量1.2、α = 0.05、検出力(1-β)= 0.80の両側独立 t検定のサンプルサイズ計算ソフトウェアを用いて決定され、グループあたり最低9名の被験者を算出しました。

静脈血はEDTA抗凝固管に採取され、遅延なく処理されました。末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配培地を用いた密度勾配遠心分離によりサンプルから分離されました。簡単に、リン酸塩緩衝生食塩水(PBS、pH 7.4)で血液を1:1で希釈し、密度勾配培地に層状に重ね、ブレーキを外した状態で400× g で20°Cで30分間遠心分離しました。遠心分離後、PBMCを含むインターフェースは慎重に新しいチューブに移されました。細胞はPBSで2回洗浄され、それぞれ洗浄後に300 × g で4°Cで10分間遠心分離し、最終的なペレットはPBSに懸浮させられました。生存可能性はトリパンブルー色染料排除法を用いて評価され、生存率≥95%の細胞を含む製剤のみが使用されました。分離されたPBMCは分割され、最大3か月間−80°Cで保存され、その後RNA抽出が行われました。

マイクロアレイデータ
研究のワークフローは 図1に示されています。マイクロアレイデータセットGSE54913 GEOデータベースからダウンロードされました(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。このデータセットが選ばれた理由は、(1) 末梢血液サンプルからのトランスクリプトミックデータを含み、低侵襲かつバイオマーカー発見に臨床的に有効であること、(2) 公開されている統合失調症マイクロアレイデータセットの中で比較的大きなサンプルサイズ(患者18名、対照群12名)を含みます。(3) 生データが再解析のために利用可能であった。GEOの記録によると、これらのサンプルは血漿ではなく末梢血単核細胞(PBMC)から採取されました。以前のバージョンでの「プラズマサンプル」という元の説明は誤りであり、現在は訂正されています。

データ前処理および差異発現遺伝子(DEG)スクリーニング
生データ(.CELファイル)はマイクロアレイの前処理ソフトウェアで前処理されました。バックグラウンド補正はロバストマルチチップ平均(RMA)法を用いて行われ、その後分位元正規化とlog2変換が行われました。遺伝子注釈のないプローブセットは除外されました。サンプル全体で>20%の欠損値を持つプローブは除外されました。残りのプローブの欠損値は、欠損値補完ソフトウェアで実装されたk-近傍アルゴリズム(k = 10)を用いて帰合されました。GEO記録によれば、すべてのサンプルが一度に処理されたため、バッチ効果は存在しませんでした。前処理後、17,200個の遺伝子の発現値が下流解析のために取得されました。統合失調症患者と健康対照群間のDEGは、差異発現解析ソフトウェアを用いて特定しました。偽発見率(FDR)が0.05、絶対フォールド変化(FC>)が1.2、P<0.05<、異なる発現が認められた遺伝子が見なされました。統合失調症は複雑な精神疾患であり、個々の遺伝子発現の違いが劇的ではなく微妙なことが多いため、比較的低いFC閾値(絶対FC>1.2)が選ばれました。

GOおよび経路濃縮解析
機能豊か解析ソフトウェアを用いて、遺伝子オントロジー(GO)用語および京都の遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路に関する機能豊か解析が実施されました。背景遺伝子セットは、前処理を通過したすべての遺伝子(17,200個)で構成されていました。生のP値が0.05<濃縮項および経路が報告されました。GOおよびKEGGの濃縮出力には生のP値が使用されたため、これらの結果は探索的なものとして解釈されるべきです。

PPIネットワーク解析およびハブ遺伝子同定
タンパク質間相互作用データベースを用いてPPIネットワークを構築し、閾値として合計相互作用スコア>0.9を設定しました。ネットワークはネットワーク可視化ソフトウェアで可視化されました。ハブ遺伝子はDegreeアルゴリズムを用いたハブ遺伝子同定プラグインを用いて同定されました。最も高い度数スコアを持つ上位10ノードがハブ遺伝子として選ばれました。キーハブ遺伝子のサブネットワークは、デフォルトパラメータ(度数カットオフ=2、ノードスコアカットオフ=0.2、Kコア=2、最大深度=100)を持つサブネットワーク抽出プラグインで抽出されました。

全RNA単離とqRT-PCR測定
βアクチンは内部参照(ハウスキーピング)遺伝子として用いられました。サンプル間でのβアクチン発現の安定性は、統合失調症群と対照群間でCt値に有意差が認められなかったことが確認されました(P > 0.05)。相対定量化は2^−ΔΔCt 法を用いて行われました。すべての反応は三重に行われ、計算には平均Ct値が用いられました( 表2のプライマー配列を参照)。上位10個のDEGs(5つはフォールド変化により最も有意にアップレギュレーションされ、5つは最も顕著にダウンレギュレーション)が選ばれ、マイクロアレイデータの全体的な信頼性を確認するために初回qRT-PCR検証が行われました。その後、 SUCNR1 および GPR37L1 は3つの基準に基づいて重点的に検証のために選定されました。(1) PPIネットワーク解析でハブ遺伝子として特定された(次数≥7);(2) これらは上位濃縮GOの「イオンチャネル活性」およびKEGG経路「インスリン分泌」と有意に関連していました。(3) 両者は統合失調症における既知の薬物標的であるGPCRsをコードしています。

統計解析
正常性はシャピロ–ウィルク検定で評価されました。概ね正規分布(P > 0.05)を示す変数は、2群比較には学生の t検定、2群以上を含む比較には一方向ANOVAを含むパラメトリック手法を用いて解析しました。正規性仮定が満たされない場合は、必要に応じてマン–ホイットニーU検 定またはクル スカル–ウォリス検定が用いられた。すべての統計検定は両側のものでした。複数比較(例:ANOVA事後分析)では、ベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率(FDR)法を適用し、FDR閾値を0.05としました。相関解析では、2つの相関のみが行われたため、多重比較補正は適用されませんでした。生のP値は慎重に報告されます。

結果

DEGの特定と階層的クラスタリング
GSE54913データセットの分析により、統合失調症患者と対照群の間で473の差異発現遺伝子(DEGs)が確認され、うち357はアップレギュレーション遺伝子、116はダウンレギュレーション遺伝子でした(図2A,B)。これらのDEGの階層的クラスタリングにより、統合失調症のサンプルと対照群を区別しました(図2C)。

DEGの機能豊化解析
GO濃縮解析により、チャネル活動に関連する用語が特定され、受動的な膜貫通トランスポーター活性、イオンチャネル活性、ゲートチャネル活性、基質特異的チャネル活性(生P<0.05; 表3)。KEGG経路解析では、インスリン分泌、cAMPシグナル伝達経路、ヌクレオチド切除修復、TNFシグナル伝達経路、グルタチオン代謝が上位に富む経路であることが確認されました(生P<は0.05; 図3C および 表4)。

qRT-PCRによるトップDEGの検証
上位5つのダウンレギュレーション遺伝子(HCN3、OLFML2A、NOX1、MRGPRX1、BRIP1)および上位5つのアップレギュレーション遺伝子(CCL22、PNMA2、TBX20、ERAS、C12orf68)はqRT-PCRで検証されました。検証済み遺伝子および対応するマイクロアレイのlogFC値は 表5に記載されており、qRT-PCRの検証結果は 図4に示され、生のCt値は 補足表S1に示されています。qRT-PCRフォールドの変化は、10遺伝子すべてのマイクロアレイデータと方向性一致(Mann-Whitney U 検定で全

SUCNR1 および GPR37L1 の発現差も確認されました(図5A、B)。

PPIネットワーク解析
PPIネットワークはすべてのDEGから構築されました(相互作用スコア>0.9; 図6A)。結合度に基づく上位10のハブタンパク質は、RTP5(次数=14)、CXCL1(次数=8)、CXCL10、GPR37L1、HCAR1、OPRL1、P2RY4、SSTR4、SUCNR1(次数=7)、およびATM(次数=5)でした(図6B および 表6)。主要なハブ遺伝子のサブネットワークは、デフォルトパラメータを持つサブネットワーク抽出プラグインで抽出されました。サブネットワーク抽出アルゴリズムにより、RTP5、CXCL1、CXCL10、GPR37L1、HCAR1、OPRL1、P2RY4、SSTR4、SUCNR1を含む密連結クラスターが特定され、クラスタスコアは6.2となりました。ATMはコアクラスターとの接続性が低かったためサブネットワークには含まれていませんでした(図6C)。

言語記憶とSUCNR1/GPR37L1の関連
統合失調症患者では、健康な対照群と比較してSUCNR1発現が有意に上昇し、GPR37L1発現が減少しました(図5A,B)。SUCNR1の発現は言語記憶スコアと負の相関を示しました(r = -0.54、95%信頼区間:-0.79から-0.13、R² = 0.287、P = 0.015;一方GPR37L1表現は言語記憶スコアと正の相関を示しました(r = 0.59、95% CI: 0.20から0.82、R² = 0.349、P = 0.0034;図5D)。相関分析は統合失調症患者10名と健康対照10名を含む全20名の被験者に対して実施されました。サンプル数20で、相関係数が|r|> 0.6 α = 0.05。サンプル数が控えめであることから、これらの相関関係的結果は予備的なものであり、より大きな独立コホートでの検証が必要です。

データ可用性声明
本研究で解析されたGSE54913データセットは、Gene Expression Omnibusから公開されています。生のqRT-PCR Ct値は補足表S1に記載されています。解析スクリプト、DEG出力ファイル、濃縮結果、PPIネットワークファイル、図のソースファイルは https://sandbox.zenodo.で利用可能ですorg/records/514960 または 10.5072/zenodo.514960。

図1:フローダイアグラム:データ収集、前処理、解析、検証。GSE54913から取得したPBMCのmRNAマイクロアレイ解析。DEGに対してGO機能解析および経路富集解析が行われました。フォールド変化でランク付けされた上位10遺伝子が選ばれ、qRT-PCRを用いたマイクロアレイデータの検証が行われました。PPIネットワーク解析により2つのハブ遺伝子が特定されました。最後に、SUCNR1とGPR37L1の2つのハブ遺伝子の生体外解析が実施されました。略語:DEGs = 差異発現遺伝子;mRNA = メッセンジャーRNA;PBMCs = 末梢血単核細胞;qRT-PCR = 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;PPI = タンパク質間相互作用。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:DEG選択と階層的クラスタリング解析。 (A) DEGの火山プロット。横軸はlog₂(褶曲変化)、縦軸は–log₁₀(P値)を表します。緑と赤の点は差異発現遺伝子を表し、黒点は非差異発現遺伝子を表します。(B) ダウンレギュレーションおよびアップレギュレーションされたDEGの数。(C) 差異発現遺伝子のヒートマップ。赤はアップレギュレーション、緑はダウンレギュレーションを示します。略称:DEGs = 差異発現遺伝子。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3: DEGのGOおよびKEGG濃縮解析。 (A,B)GO濃縮および(C)KEGG濃縮は生のP値に基づいて示されています。略語:DEGs = 差異発現遺伝子;GO = 遺伝子存在論;KEGG = 京都遺伝子・ゲノム百科事典;BP = 生物学的過程;CC = 細胞成分;MF = 分子機能。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4: qRT-PCRを用いた上位10遺伝子のマイクロアレイデータの検証。 (A) トップ5のDEGをダウンレギュレーション。(B)トップ5のDEGを上位調整。データは平均±標準誤差です。P値は対応するパネルに示されています。略語:DEGs = 差異発現遺伝子;qRT-PCR = 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:統合失調症患者および健康対照群における SUCNR1 および GPR37L1 発現。 (A) QRT-PCRによって決定された SUCNR1 および(B) GPR37L1 発現。言語記憶と(C) SUCNR1 および(D) GPR37L1 発現との相関。データは該当する場合±平均の標準誤差として示されています。相関のP値は対応するパネルに示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6: タンパク質間相互作用ネットワーク解析。 (A) タンパク質間相互作用データベースを用いて解析したPPIネットワーク。(B) PPIネットワーク内の関連度でランク付けされたタンパク質。(C) サブネットワーク抽出解析後にネットワーク可視化ソフトウェアを用いて可視化したサブネットワーク。略称:PPI = タンパク質間相互作用。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

可変	対照群(n = 10)	統合失調症患者(n = 10)
年齢(年)	36.5 ± 10.6	44.5 ± 9.5
女性、n(%)	5 (50)	5 (50)
1日の睡眠時間(h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
体格指数(BMI;kg/m²)	25.2 ± 4.1	22.9 ± 2.3
言語記憶スコア	61 ± 18	30.2 ± 10.8
データは平均±標準偏差または数値(%)として提示されます。

表1:統合失調症患者および対照群の基底特性。

遺伝子記号	フォワードプライマーシーケンス(5'→3')	逆プライマーシーケンス(5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGGGGGGG	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	カグカガ	AATATTTGGGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTAGTGGGAG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACAGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGAGGCCTTGC
ブリップ1	カガトガ-タグトガ	CGTCCTCCGGAGCCCTCTCTTAG
CCL22	TCCATCATCTTCTCTCTCTCTCTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCGGTGGTTTTT
TBX20	ガッガアグトガガグッカグッカッcc	あ、ガッカッカッタッタッ、
時代	AGTCTATTATTTCGGGCACC	CCTTCGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAGAat	GCACAGGAAGCAAGTCAG
βアクチン	CTAAGGCCAACCGTGAAAG	GCATACAGGGACACACACAGAG
qRT-PCR:定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。

表2:qRT-PCR用のPCRプライマー。

ゴーID	用語	生のP値	伯爵
GO:0015267	チャネル活動	0.000000056	13
GO:0022803	受動的な膜貫通トランスポーター活性	5.78E-08	13
行け:0005216	イオンチャネル活動	0.000000127	12
行け:0022839	イオンゲート付きチャネル活動	0.000000131	11
行け:0022836	ゲート付きチャネル活動	0.000000136	11
行け:0022838	基質特異的チャネル活動	0.00000017	12
GO:0005261	陽イオンチャネル活動	0.00000668	9
行け:0015276	リガンドゲートイオンチャネル活性	0.000315	5
GO:0022834	リガンドゲートチャネル活性	0.000315	20
行け:0022890	無機陽イオンの膜貫通トランスポーター活性	0.000487	20
GO:0008324	陽イオン膜貫通トランスポーター活性	0.0009	18
GO:0099094	リガンドゲートカチオンチャネル活性	0.00128	16
GO:0005244	電圧ゲート付きイオンチャネル活性	0.001382	16
GO:0022832	電圧依存性チャネル活動	0.001382	18
行け:0046873	金属イオン貫膜トランスポーター活性	0.001836	21
GO:0022824	送信機依存イオンチャネル活動	0.002762	19
ゴー:0022835	送信ゲート付きチャネル活動	0.002762	13
注:P値は生のもので調整されていません。有意性は生のP<0.05と定義されました。

表3:差異発現遺伝子(生P < 0.05)の遺伝子オントロジー解析。

身分証	概要	生のP値	伯爵
HSA04911	インスリン分泌	0.007066	6
HSA04024	cAMPシグナル伝達経路	0.010661	10
HSA03420	ヌクレオチド切除修復	0.013724	4
HSA04668	TNFシグナル伝達経路	0.023694	6
HSA00480	グルタチオン代謝	0.02466	4
HSA04740	嗅覚伝達	0.032104	15
HSA05222	小細胞肺がん	0.03572	5
HSA00590	アラキドン酸代謝	0.035991	4
HSA04080	神経活性リガンド-受容体相互作用	0.037546	12
HSA05031	アンフェタミン依存症	0.045653	4
HSA05203	ウイルス発がん	0.046404	8
HSA04933	糖尿病合併症におけるエイジレイジ信号伝達経路	0.04831	5
注:P値は生のもので調整されていません。有意性は生のP<0.05と定義されました。

表4:京都遺伝子・ゲノム百科事典遺伝子の濃縮解析(生P<0.05)。

遺伝子記号	正式なフルネーム	logFC	生のP値
ダウンレギュレーション
HCN3	過分極活性化環状ヌクレオチドゲートチャネル3	-1.489	0.0001
OLFML2A	オルファクトメジン様タンパク質2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPHオキシダーゼ1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Mas関連Gタンパク質結合受容体X1	-1.526	0.0003
ブリップ1	ファンコニ貧血群Jタンパク質	-1.699	0.0018
アップレギュレーション
CCL22	C-Cモチーフケモカイン22	2.517	0.0041
PNMA2	副腫瘍性Ma抗原	2.159	0.0062
TBX20	Tボックス転写因子 TBX20	1.866	0.0001
時代	GTPase時代	1.846	0.0008
C12orf68	184を含むコイルコイルドメイン	1.839	0.0002
注:logFCおよび生のP値はマイクロアレイの差分発現解析からのものです。

表5:アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション遺伝子のフォールド変化によるトップ10DEGランキング。

遺伝子記号	概要	コ遺伝子(n)	P値
RTP5	受容体トランスポータータンパク質5	14	0.000276
CXCL1	成長制御アルファプロテイン1	8	0.011423
CXCL10	C-X-Cモチーフケモカイン10	7	0.046144
GPR37L1	プロサポシン受容体GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	ヒドロキシカルボン酸受容体1	7	0.046572
OPRL1	ノシセプチン受容体1	7	0.039753
P2RY4	P2Yプリノセプトル4	7	0.001279
SSTR4	ソマトスタチン受容体タイプ4	7	0.006742
SUCNR1	サッカー受容体1	7	0.000105
ATM	セリンタンパク質キナーゼATM	5	0.004961
PPI:タンパク質間相互作用;DEGs:差異発現遺伝子。

表6:DEGsのPPIネットワークで同定されたトップ10のハブ遺伝子。

補足表1:本研究の生qRT-PCR検査量、完全なバイオインフォマティクス解析ワークフロー、処理結果(DEG、GO/KEGG、PPI)をダウンロード するにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

統合失調症は、多数の遺伝的感受性因子を関与させる重篤な多因子疾患です。^13,14。その病態生理の理解は進展していますが、信頼できる診断バイオマーカーはまだ不足しています。本研究では統合バイオインフォマティクス手法により、統合失調症患者の血液サンプルから473のDEGが特定されました。GOおよびKEGG解析では、インスリン分泌、cAMPシグナル伝達、ヌクレオチド切断修復、TNFシグナル伝達、グルタチオン代謝など、チャネル活性関連の項および経路における濃縮が強調されました。PPIネットワーク解析では、SUCNR1およびGPR37L1がハブ遺伝子として特定され、その発現は言語記憶のパフォーマンスと関連しており、統合失調症に関連する分子マーカーとしての関連性が示唆されました。

「チャネル活動」GO用語の強化は、これまでの統合失調症研究と一致しています。電位依存性カルシウムチャネル(例:CACNA1C、CACNB2)およびカリウムチャネル(例:Kv3、Kv2.1)は統合失調症の感受性および神経興奮性に関与していることが示唆されています15,16。同様に、特定された主要なKEGG経路は既存の文献と整合しています。初期統合失調症では高インスリン血症およびインスリン分泌異常が報告されています¹⁷。cAMPシグナル伝達経路は、疾病の病態生理とますます関連しています¹⁸。ヒストン変異型H2AX修飾を含むヌクレオチド切除修復機構も19,20,21,22に関与する可能性があります。さらに、TNFシグナル伝達とグルタチオン代謝は統合失調症の病因と関連しています^23,24。

言語記憶障害は統合失調症における主要な認知障害であり、発症時に存在し、機能的転帰と関連しています。ホプキンス言語学習テスト改訂版(HVLT-R)は、言語学習と記憶の十分に検証された指標です。候補マーカーの発現と言語記憶パフォーマンスの相関を評価することは、統合失調症における認知障害の主要な決定要因であるため、臨床的関連性を確立するのに役立ちます。

qRT-PCRで検証された上位10のDEGはマイクロアレイデータと一致していましたが、主要なGO/KEGGの所見とは大きく一致しませんでした。対照的に、 SUCNR1 (アップレギュレーション)および GPR37L1 (ダウンレギュレーション)は「イオンチャネル活性」と有意に関連しており、「インスリン分泌」が濃縮されていました。両遺伝子はGタンパク質結合受容体(GPCRs)をコードしており、これは抗精神病薬の重要な標的であり、イオン^{チャネル活性を}調節します。

SUCNR1(GPR91)は代謝ストレスとインスリン分泌^{および抵抗性と}関連しており^、インスリン抵抗性は統合失調症のリスク因子として知られています²⁸。GPR37L1は脳内で高発現する孤児受容体であり、小脳の発達と^{運動機能に}関与しており、パーキンソン病³⁰および腎ナトリウム輸送³¹に関与していることが示唆されています。統合失調症におけるその役割はイオンチャネル活性の調節を伴う可能性があります。

言語記憶障害は統合失調症の中核的特徴であり、遺伝的リスクや疾患の重症度を反映しています^32,33。SUCNR1発現の逆相関と言語記憶スコアとのGPR37L1表現の正の相関は、統合失調症におけるこれらの関連性の可能性をさらに支持しています。

いくつかの制限点を認めておくべきです。まず、検証コホートのサンプルサイズ(グループあたりn=10)が小さく、統計的検密力と一般化可能性を制限しました。第二に、すべての統合失調症患者は抗精神病薬を服用していたため、観察された発現の変化は疾患病理ではなく薬剤の影響を反映している可能性があります。今後の研究には、薬剤未経験の初発患者も含めるべきです。第三に、検証コホートはRNAシークレットの確認がなかった。より大きな独立コホートでのトランスクリプトーム全体シーケンスが推奨されます。第四に、横断設計はバイオマーカーレベルと疾患進行の因果関係の評価を排除しています。第五に、言語記憶との相関分析は探索的であり、再現性が必要である。第六に、GSE54913データセットはRNA-seqよりも感度が低いマイクロアレイプラットフォーム上で生成されました。今後の方向性には、病気および治療の経過に伴うSUCNR1およびGPR37L1レベルの追跡、統合失調症の病態生理におけるこれらのGPCRsのメカニズム的役割を解明する機能的研究、そしてこれらのバイオマーカーに対する臨床的に検証されたアッセイの開発が含まれます。

まとめると、この統合解析はSUCNR1およびGPR37L1発現の変化が統合失調症および言語記憶能力と関連していることを示唆しています。これらの遺伝子は統合失調症に関連する分子マーカー候補である可能性があります。しかし、制限としては比較的小さなサンプルサイズと、言語記憶による統合失調症の重症度の部分的な評価が挙げられます。これらの発見を検証するためにさらなる研究が必要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction