ホエイプロテイン飲料曝露後のナノハイブリッド樹脂複合材料の表面微細硬度変化を評価する標準化された in vitro 手順

サマリー

このプロトコルは、ホエイプロテイン飲料が樹脂複合材料の微細硬度に与える影響を評価するための標準化された in vitro 法を記述しています。このアプローチは、循環浸漬とビッカース試験を用いて食事曝露の制御された評価を可能にし、栄養飲料と修復バイオマテリアルの相互作用を調査するための再現可能なモデルを提供します。

要約

この in vitro 研究の目的は、異なるホエイプロテイン飲料が3つのナノハイブリッド樹脂複合材料の表面微細硬度に与える影響を評価することでした。合計90点の円盤状試料が3つのナノハイブリッド樹脂複合材(1材料あたりn=30)から作製され、浸漬媒体に応じて3つのグループ(n=10)に細分されました:ホエイ濃縮液、ホエイアイソレート、蒸留水です。標本は1日2回、10分間、30日間浸けられました。表面微細硬度はベースラインおよび浸漬後にビッカース微小硬度テスターを用いて測定し、硬度変化はΔVHNとして計算されました。データは二方向反復測定、ANOVAおよび事後検定を用いて分析されました。分析の結果、複合型、浸漬溶液およびそれらの相互作用がΔVHN値(p < 0.0001)に統計的に有意な影響を与えることが明らかになりました。最も高い硬度損失はホエイ濃縮物に曝露された注入複合物(ΔVHN:10.4 ± 2.1)で観察され、蒸留水に保存された高濃度複合物(ΔVHN:0.9 ± 0.4)で最も低い変化が記録されました。ホエイ濃縮物への浸漬は、蒸留水と比較してすべての複合材料で有意に大きな硬度損失をもたらしました(p < 0.05)。ホエイアイソレートは、高充填複合物を除くすべての複合材料で有意な硬度損失を引き起こしましたが、この複合物では統計的に有意な差は認められませんでした(p = 0.076)。これらの発見は、ホエイプロテイン飲料が樹脂複合材料の表面微細硬度を低減する可能性があり、劣化の程度は材料組成と飲料の配合の両方に依存していることを示しています。

概要

樹脂複合樹脂修復物の長期的な成功は、機械的負荷、食事への曝露、化学分解など複雑な口腔環境の課題に対する耐性に依存しています^1,2。ナノハイブリッド樹脂複合材は、特に表面微細硬度という良好な美観的・機械的特性から広く使用されており、これは摩耗や構造劣化に対する重要な指標^{となります。}

過去の研究では、果汁、炭酸飲料、エナジー飲料などの酸性飲料への曝露が、表面微小硬度を低下させ、表面の強度を変化させることで複合樹脂修復物に悪影響を及ぼすことが示^{されています。}これらの劣化効果は、pH、曝露時間、充填剤とマトリックスの組成など複数の要因によって影響を受けます。しかし、既存の多くの実験モデルは高酸性溶液に依存しており、現代の食習慣で直面する化学的課題を正確に反映していない可能性があります。

一方、ホエイプロテイン飲料は栄養価が高く、フィットネス志向^{の人々の間で}消費量が増加していることから広く人気を集め^{ています。}ほぼ中性のpHであるにもかかわらず、これらの飲料には乳糖、タンパク質、その他の有機成分が含まれており、樹脂マトリックスと相互作用して材料の安定性に影響を与える可能性があります。したがって、その効果を評価するには酸性度だけでなく有機組成や繰り返し曝露パターンも考慮するプロトコルが必要です。

このプロトコルの全体的な目標は、ホエイプロテイン飲料、特に濃縮および分離配合がナノハイブリッド樹脂複合材料の表面微細硬度に与える影響を評価するための標準化かつ再現可能な in vitro 方法を提供することです。この方法は、循環浸漬による日々の食事曝露の制御されたシミュレーションを可能にし、in vitro 試験条件の実験的関連性を向上させます。

従来の酸性飲料曝露モデルと比べて、このプロトコルにはいくつかの利点があります。第一に、ほぼ中性pH条件下での材料劣化の調査が可能となり、酸による影響を超えた物質の応答を評価することが可能になります。第二に、サイクリックイマージョン設計は実際の消費パターンをよりよく反映しています。第三に、この手法は充填剤含有量や樹脂マトリックス組成などの構造特性に基づく異なる複合材料配合の比較評価を促進します。

このプロトコルは、栄養的に関連した条件下で修復材料の化学的安定性を評価する研究者や、食事成分と歯科バイオマテリアルの相互作用を調査する研究に特に適しています。また、代替飲料の配合、表面処理、新開発の複合材料の試験にも応用されることがあります。

プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 試料の準備

1. 3つのナノハイブリッド樹脂複合材料から合計90個の円盤状試料を準備します(1つの材料あたりn=30個)。
2. 標準化された寸法を確保するため、円筒形の透明シリコン型(直径6mm×厚さ2mm)を使用して試料を製作します。
3. 複合材料を1回の厚さ(厚さ2mm)で型に入れ、透明な顕微鏡スライドで表面を覆って平らな面を作ります。
4. 青色LED光硬化装置(≈440–480 nmの発光スペクトル)を用いて、表面から約1mmの位置に設置し、出力強度1000 mW/^cm ²で20秒間重合します。
5. 各重合サイクルの前に放射計で硬化光強度を確認し、光の照射を一定に保ちましょう。
6. 準備済みの試料を蒸留水で37°Cで24時間保存し、重合後の状態と初期経口条件の模擬を行います。
   注:標本は37°Cの蒸留水で最大24時間保存され、その後さらに加工されます。

2. 仕上げおよび研磨手順

1. すべての試料の表面は酸化アルミニウム含浸研磨ディスクで仕上げ・研磨します。表面の標準化を確保するために、すべての研磨手順は一人のオペレーターによって実施されるべきです。
2. 研磨を順次に施し、中円盤、細ディスク、超微粉ディスクを水冷で約10,000rpm、軽圧と一方向回転運動で10秒間行います。
3. 研磨ディスクは5試料ごとに交換し、研磨効率を安定させ、表面の標準化を確実にします。
4. 研磨の各工程の後、蒸留水で10秒間汚れを落とすすぎ、次のディスクに進む前に5秒ほど優しく自然乾燥させます。
5. 各標本の未研磨面に固有の識別コードをマークし、後続の検査で一貫した向きを確保しましょう。
6. 試料は37°Cの蒸留水で24時間保存し、その後の基準となる微小硬度試験を行います。
   注:標本は37°Cの蒸留水で最大24時間保存され、基準値検査が行われます。

3. 基準微細硬度測定

1. 既に公開されたプロトコルに従い、ビッカース微小硬度試験^機11を用いてベースラインのビッカース微小硬度試験(VHN)を実施します。
2. 200gの負荷をかけて15秒の滞留時間をかけます。
3. 標本ごとに少なくとも1mmの間隔で3回のくぼみを入れます。各試料の中央表面にへこみを入れてエッジ効果を避けてください。
4. 平均ベースラインVHNを計算します。
5. 変動を最小限に抑えるために、単一の校正済みオペレーターによる測定を行います。
   注: 標本は37°Cの蒸留水で最大24時間保存されてから浸漬されます。

4. 浸漬媒体の準備

1. 市販の粉末を使って、ホエイプロテイン濃縮液(WC)とホエイプロテインアイソレート(WI)の2種類のホエイプロテイン製剤を準備します。
2. 25gのホエイプロテインパウダーを200mLの蒸留水(0.125g/mL)に溶かして浸漬液を準備します。
3. 実験室用のシェーカーで溶液を60秒間混ぜ、完全に溶けるまで続けます。
4. 泡の形成を最小限に抑え、均質性を確保するために、室温で5分間溶液を平衡させます。
5. 浸漬前に校正済みのデジタルpHメーターを使って各溶液のpHを測定・記録してください。
6. 各浸漬サイクルの前に新鮮なホエイ溶液を準備し、化学組成を均一に保ちタンパク質分解を防ぎます。
7. 各サイクルで完全な浸漬を確保するために、1個の試料につき10mLの浸漬液を使用してください。

5. 浸水手順

1. 各複合群を3つのサブグループ(n = 10)に分けます。
2. 指定された溶液に標本を1日2回、10分間浸けます。繰り返しの1日の摂取パターンをシミュレートするために設計された既存の in vitro 飲料曝露モデルに基づいて、浸漬時間と頻度を選択します⁷.
3. 各浸漬サイクルの後、標本を蒸留水ですすいで、人工唾液に10分間浸して短期間の唾液曝露を模擬します。
4. 試料は次の曝露サイクルまで37°Cの蒸留水に保管します。
5. この手順はホエイにさらされたグループにのみ適用してください。実験期間中、対照群を蒸留水(DW)で37°Cで連続的に維持します。
   注意:浸漬プロトコルはサイクルの合間に一時停止し、翌日に再開しても実験の一貫性に影響はありません。
6. 30日間、イマージョンプロトコルを続けてください。

6. 浸漬後のマイクロ硬度測定

1. 標本を蒸留水ですすいで、やさしく乾燥させます。
2. 同じパラメータ(200g、15秒)でビッカースの微細硬度試験を行います。
3. 3つのへみを記録し、浸水後の平均VHNを計算します。
4. 各標本のΔVHNを決定します。

7. 統計解析

1. ビッカースのマイクロ硬度値を繰り返し測定ANOVAモデルで解析し、対象内因子は基準点および浸水後、複合型と浸水解を被験者間の因子とします。
2. 適切な場合は、各試料ごとの微細硬度変化の大きさを表す記述的な結果指標としてΔVHN値を計算します。
3. Tukeyの誠実に有意な差(HSD)検定を用いて事後ペアワイズ比較を行います。
4. すべてのグループ平均に対して95%信頼区間を計算します。
5. ANOVA結果に対して部分エタ二乗(η^2p)を用いた効果量を報告します。
6. ウェルチ のt検定を用いてホエイプロテイン溶液のpH値を比較してください。
7. 統計的有意なレベルを p < 0.05に設定します。
8. 絶対的なΔVHN値に加え、以下の式を用いて微細硬度変化率を計算します:[(ベースラインVHN −浸水後VHN) / ベースラインVHN] ×100。

結果

記述統計

複合溶液の組み合わせの平均ΔVHN(±SD)値は 表1に示されています。

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樹脂複合材料	解決策	ΔVHN(平均± SD)	95%信頼区間	n
EA	蒸留水	0.9 ± 0.4a	0.61–1.19	10

ディスカッション

本プロトコルは、ホエイプロテイン飲料が樹脂複合材料の微硬度に与える化学的影響を評価するための標準化されたアプローチを提供します。重要なステップには、均一な試料製造、制御された光硬化条件、標準化されたビッカース試験パラメータが含まれます。試料の寸法と硬化強度を一定に保つことが不可欠であり、変動によって変換度や機械的安定性に影響が及ぶことがあります。さらに、浸漬時間と温度を厳密に制御することで再現性が保証され、水の吸収やポリマー緩和プロセスに伴う変動性が低減されます^12,13。

研究目的に応じていくつかの修正が適用されることがあります。例えば、浸漬の頻度や持続時間を調整して異なる露^光条件をシミュレートできます7.トラブルシューティングの考慮点としては、微細硬度試験中の脱水を避け、凹み間の間隔を十分に保って測定干渉を防ぐことが含まれます。表面の不規則さから硬...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルミニウム酸化物研磨ディスク	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Turkey	5714	中程度、細かい、超細かい、仕上げと研磨に使用
分析用天びん			材料の計量に使用
人工唾液溶液	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Turkey		浸漬サイクル間の保管に使用
デジタルpHメーター	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA	HI2211	飲料のpH測定
蒸留水	未指定	該当なし	制御溶液および試料の保管に使用
ガラス製顕微鏡スライド	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, China	7102	複合体配置時の平らな試料表面の取得に使用
目盛り付きシリンダー	未指定	該当なし	液体量の測定に使用
高充填ナノハイブリッド樹脂複合体（EA）	Estelite Asteria（Tokuyama Dental, Tokyo, Japan）	10942	修復材料として使用、充填剤含有量と樹脂マトリックス組成が異なる
インキュベーター	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany	UN55	37 °Cでの保管に使用
注射用ナノハイブリッド樹脂複合体（GUI）	G-ænial Universal Injectable（GC Corporation, Tokyo, Japan）	12365	修復材料として使用、充填剤含有量と樹脂マトリックス組成が異なる
実験用ビーカー	未指定	該当なし	ホエイタンパク質溶液の調製に使用
実験用シェーカー	未指定	該当なし	溶液の混合と均質化に使用
LED光硬化ユニットとラジオメーター	Woodpecker LED硬化ユニット（Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, China）	FD-300	重合と光強度の検証
マイクロモータハンドピース	FX205, NSK Ltd., Kanuma, Japan	C1056002	研磨手順で使用
中程度に充填されたナノハイブリッド樹脂複合体（FU）	Filtek Universal（3M ESPE, St. Paul, MN, USA）	6570A2	修復材料として使用、充填剤含有量と樹脂マトリックス組成が異なる
シリコンモールド	未指定	該当なし	直径6 mm×厚さ2 mmの円形、試料の製造に使用
ビッカース硬度計	HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan	HMV-G31	ビッカース硬度数（VHN）テスト
ホエイタンパク質濃縮粉末	ホエイタンパク質イチゴ風味、Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey		乳糖含有量：~1–2%、タンパク質含有量：~85–90%
ホエイタンパク質分離粉末	ホエイタンパク質チョコレート風味、Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey		乳糖含有量：~4–6%、タンパク質含有量：~70–80%