組織から形態計測へ:成マウスの神経および樹状脊椎解析のためのゴルジ・コックスのステップバイステップワークフロー

サマリー

本記事では、成マウスにおけるゴルジ・コックス染色のステップバイステップ方法を説明し、溶液調製、組織浸漬、クリオプロテクション、切片、現像、マウントをカバーします。組織保存と均質で背景の低い染色を重視し、神経の形態を明確に可視化します。この手法は樹状樹をラベル付けし、樹状棘の定量的な形態計測解析を支援します。

要約

健康と疾患における神経形態解析は、脳機能の理解や実験的介入の効果評価に不可欠です。ゴルジ・コックス染色は、完全な神経軸や樹状棘を可視化するための古典的でありながら非常に重要な技術です。しかし、発表されたプロトコルは重要な手順段階でしばしば異なり、重要な方法論的詳細が欠けているため、染色品質に大きなばらつきが生じ、実験室での標準化は時間がかかり困難なものとなっています。ここでは、成体マウスの包括的なステップバイステップのGolgi–Coxプロトコルを提示し、 in vivo での取り扱いや組織処理から画像診断および形態測定データ抽出までの全ワークフローを網羅しています。含浸効率、断面の整合性、信号対雑音比に影響を与える実務的な考慮点や一般的な落とし穴を詳述し、再現性向上のための方法論的指針を提供します。全体として、このプロトコルはニューロン全体、樹状細胞セグメント、樹状棘の信頼性の高い可視化と定量解析を可能にします。このリソースは、より一貫性、透明性、技術的厳密さをもってゴルジ・コックス染色法の実装を促進するとともに、多様な実験室環境に適応させるための明確な枠組みを提供することが期待されています。

概要

ゴルジ・コックス染色法の全体的な目標は、固定された脳組織^1,2,3,4における樹状突起や樹状棘を含む完全な神経形態の高解像度可視化を可能にすることです。この技術により、複雑な神経回路内の個々のニューロンの詳細な構造解析が可能となり、シナプス可塑性、神経発達、神経変性、経験依存構造再構築の研究に特に価値があります^5,6。

ゴルジベース法の開発と継続的な使用の根拠は、その独自の能力で、まばらで完全な神経細胞の受血を生じさせるという点にあります^1,2。この方法は1873年にカミロ・ゴルジによって最初に記述され、1891年に^{コックスによって}改良^{されました。この}方法は、限られたニューロンのサブセット内でクロム酸銀の沈殿に依存し、重複する標識3を避けて完全な形態的再構築^{を可能にします。}ゴルジ–コックス修飾は、元のゴルジ法で使用された硝酸銀を塩化水銀に置き換え、組織の浸透性と染色の一貫性を向上させ^ます。蛍光タンパク質発現、ウイルストレーシング、染料充填法などの他の神経細胞標識技術と比較して、ゴルジ・コックス染色にはいくつかの利点があります。遺伝子操作、立体誘導注射、特殊な顕微鏡機器を必要としず、明視野顕微鏡^1,2で高コントラストの樹状突起棘の可視化が可能です。現代の蛍光法は細胞型特異性を提供しますが、ゴルジ・コックス染色は偏りのない形態学的サンプ^{リングや遺伝子}組み換えツールが利用できない種や実験条件下での使用において特に有利です。

より広範な文献では、ゴルジ型手法が学習^と記憶5、ストレスおよび精神疾患¹¹、加齢¹²、アルツハイマー病¹²、¹³、¹⁴の神経変性疾患の研究において樹状脊椎密度と形態の定量化に広く用いられています。数十年にわたり使用され続けていることは、構造神経解剖学における信頼性を示しています^。この方法は、脳組織の樹状状構造や脊椎形態を解析する研究者に特に適しており、全細胞の可視^{化が必要な場合}です。実験群間の比較形態学的研究に適しています。しかし、細胞型特異性、ライブイメージング、または分子共局在を必要とする研究者は、蛍光または遺伝的に符号化された標識法の方がより恩恵を受ける可能性があります^9,10。

プロトコル

本研究では成虫の野生型B6129SF2/Jマウス(n=3)が使用されました。しかし、成虫の段階では両性を用いて同様の染色が可能です。すべての実験的手技は、生命倫理委員会の事前承認を受けています。(#117.A、メキシコ国立自治大学神経生物学研究所(INb)

1. 解の準備

注意:塩化水銀は非常に有毒で腐食性があります。手袋、白衣、目の保護具を着用し、化学換気フードの中で持ち物を取ってください。廃棄物はラベル付きの有害廃棄物容器に捨ててください。二クロム酸カリウムおよびクロム酸カリウムは有毒かつ発がん性のある酸化物質です。化学換気フードの中で取り扱い、皮膚への接触や吸入を避けてください。

1. ストック含み込み溶液を準備してください
   1. 重い2クロミン酸カリウム15g。300mLの二重蒸留水に溶かし、5%(w/v)の溶液を得る。
   2. 15gの塩化水銀の重さです。300mLの二重蒸留水に溶かし、5%(w/v)の溶液を得る。
   3. クロメートカリウム15gの重さです。300mLの二重蒸留水に溶かし、5%(w/v)の溶液を得る。
   4. すべての容器はアルミホイルで包み、室温で光を遮って保管してください。
2. ゴルジ–コックス作業溶液を準備する
   1. 50 mLの二クロム酸カリウム溶液、50 mLの塩化水銀溶液、40 mLのクロム酸カリウム溶液を混ぜます。
   2. 蒸留水100mLを加え、よく混ぜます。
   3. 混合液は室温で48時間、光を遮って孵化させます。
   4. 沈殿物を沈殿させてください。組織の浸漬には上清液のみを使用してください。
      注:ゴルジ・コックス溶液は光から保護されて保存すれば最大1か月間保存可能です。試薬の廃棄を減らし溶液の鮮度を確保するために、実験に必要な在庫溶液と最終的なゴルジ–コックス溶液の必要な量のみを準備してください。沈殿物損失後に20mLの使用可能な上清を得るために、脳あたり少なくとも23 mLを準備してください。
3. クライオプロテクタント溶液を準備してください
   1. ショ糖300gを、無水のリン酸塩二塩基ナトリウム、一水和リン酸ナトリウム一塩基、塩化ナトリウムで調製した0.1 Mリン酸塩緩衝生塩水(PBS)、pH7.4に溶けます。
   2. 最終的なボリュームを1Lに調整します。
   3. 4°Cで最大1週間保存してください。

2. 組織採取と含水

1. 心内灌流を行う
   1. 動物にペントバルビタールナトリウム(252 mg/kg、独立投与)で麻酔します。ペダルの撤退がないことで十分な麻酔深度を確認してから進めてください。
   2. 約30mLの0.1 M PBS(pH 7.4)で心内灌流を行い、排出物が透明になるまで行い、脳組織からの血液を完全に除去します。固定剤は使用されませんでした。ゴルジ–コックス溶液自体がこのワークフローの固定液として機能します。
   3. 脳を慎重に取り出し、蒸留水で洗い流してください。脳が適切に灌流され、残留血液がないことを確認してください(図1A)。
2. 受胎組織
   1. 脳マトリックスを用いて脳を半球または冠状ブロック(約3mm厚)に分割し、受精を促進します。組織ブロックが小さいほど均一な含浸が可能で変動が低減されますが、大きなサンプルは培養期間が長くなり、染色の均一さが少ないことがあります。
   2. 脳を10mLのゴルジ・コックス溶液に入れます。光から守る。
      注:ゴルジ・コックス溶液10mLの量であれば、成マウスの脳全体に十分です。単一半球またはより小さな冠状ブロック(厚さ~3mm)を使用する場合、組織が完全に浸かっている限り、溶液の体積を比例して減少させることができます。脳全体を使用する場合は、最適な試薬浸透と均一な浸漬を確保するために、関心のある領域を保持しつつ切片することが推奨されます。
   3. 室温で24時間孵育します。
   4. 新鮮なゴルジ・コックス溶液10mLに置き換えます。暗闇の中、22〜25°Cで10〜14日間抱卵します。
      一時停止点:組織をゴルジ・コックス溶液に最大15日間保存し、大きな生存能力を損なうことはありません。
      注:ゴルジ・コックス受精後、脳は暗い黄金色の外観を帯び、非常に脆くなります。したがって、慎重に扱ってください(図1B)。鋼材との化学反応を避けるために、操作にはプラスチックピンセットの使用が推奨されます。

3. クライオプロテクション

1. 組織を10mLのクライオプロテクタント溶液(30%ショ糖(w/v)、0.1 M PBS、pH 7.4、ステップ1.3で調製)に移します。
2. 24時間(4°C)培養します。
3. 同じ温度(4°C)で新鮮なクライオプロテクティブ溶液に交換し、少なくとも4〜7日間培養します。
   一時停止点:切片前に、組織を4°Cで最大3週間冷凍保護液に保存してください。

4. 埋め込みと断面化

1. 組織埋め込み
   1. 8%(w/v)アガロースを熱い蒸留水で準備します。約40°Cまで冷ます。
   2. 組織を埋め込み型に入れ、適切な向きを合わせます。
   3. アガロースを組織に注ぎ、室温で1時間、または4°Cで30分間固化させます(図1C)。
   4. ブロックから過剰なアガロースをトリミングします(図1D)。
2. 切片組織
   1. アガロースブロックをビブラトームステージに接着剤で固定します。(図1E)
   2. 切断室にクライオプロテクタント溶液を充填してください。
   3. 厚さ100〜200μmの切片組織。樹状脊椎解析には画像解析の解像度向上のために薄い断片(例:100–120μm)が推奨され、より厚い断片(例:150–200μm)は全ニューロン再建に用いられることがあります。本研究では、120μmで切断した(図1F)。
   4. 柔らかい筆で区画を集めます。
      注意:ビブラトームの設定は 材料表に記録してください。セクションを取り付けた後は、いかなる状況でもスライドをすすぎないでください。ショ糖は発育段階まで組織を保護します。

5. マウント

1. ゼラチンコーティングスライドの準備
   1. 加熱した蒸留水100 mL(0.5% w/v)に溶かして、0.5 gのゼラチンを溶かしてコーティング溶液を準備します。
   2. ゼラチンが完全に溶けるまでかき混ぜ、溶液を室温まで冷ます。
   3. 硫酸クロムカリウム0.05g(0.05% w/v)を加え、完全に溶けるまで混ぜます。必要に応じて残留泡を除去してください。
   4. ゼラチン溶液をろ過紙でろ過し、未溶解粒子や残留泡を除去し、スライドの均一なコーティングを確保します。
   5. グラススライドは中性洗剤と水で洗い、よくすすぐ後、蒸留水で洗い流します。
   6. スライドを96%エタノールに浸し、目に見える滴が残らなくなるまで浸します。
   7. オーブンで50〜60°Cで30分間、または完全に乾くまで乾かします。
   8. ディップはゼラチン溶液にスライドさせ、余分な溶液を排出させます。
   9. スライドを50〜60°Cのオーブンに30分間、または完全に乾くまで置きます。
   10. 適切な接着を確保するために、コーティングと乾燥のプロセスを少なくとも5回繰り返してください。
   11. 最終乾燥の後、スライドを粉塵のない環境(例:化学煙幕フード内)で室温まで冷やし、清潔で密閉された容器に保管して使用します。
       注意:コーティングするスライド数に必要なゼラチン溶液の量のみを準備してください。試薬量は指定された濃度(w/v)を維持しながら比例的にスケールできます。
2. 柔らかいブラシを使ってゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに断片を置きます
   注意:顕微鏡スライドには少なくとも5層の0.5%ゼラチンコーティングを施してください。スライドは新たに準備し、発生中の組織の完全性を確保してください。このプロトコルでは電気搭載スライドは試験されませんでした。
3. 吸音性の紙をクライオプロテクタント溶液で浸し、切片の上に塗ります。
4. 手のひらで優しく押して気泡を取り除き、組織切片とゼラチンコーティングされたスライドの均一な接触を確保し、その後の処理中の安定した接着を促進します。
   注:優しい圧力は、切片とゼラチン層の接触を最大化し、水性発生時の剥離リスクを減らし、接着性を向上させます。
5. 紙を慎重に剥がし、暗闇で2〜3日間室温で乾かします。
   注意:低湿度環境での乾燥は安定した接着に不可欠です。光からの保護は、クロム酸塩の存在により光に敏感なゴルジ・コックス含浸組織の光化学的変化を最小限に抑えます。さらに、残留アガロースは発育過程に有意な干渉をせず、発育切片の周囲に見られることが観察されます(図2A)。アガロースの存在は、ゴルジ・コックス浸漬組織が非常に脆弱であるため、マウント時の組織の安全な取り扱いを促進します。必要に応じて、スライドにセクションを取り付けた後、余分なアガロースを慎重に手動で除去することも可能です。
   一時停止:スライドは光から守ってください。

6. 開発

注意:キシレンは可燃性で吸入すると有毒です。化学換気フードで取り扱い、火の開け火は避けてください。アンモニアは腐食性があり、刺激的な蒸気を発生させます。フムフードの中のハンドル。

1. 水和物セクション
   1. スライドを蒸留水に5分間浸します。
   2. 新鮮な蒸留水に5分間移します。
   3. 50%エタノールに5分間浸けてください。
      注:50%エタノールの段階は水性状態から脱水段階への徐々の移行を提供し、試薬の浸透を促進し、現像工程前の組織の完全性維持に役立ちます。
2. 染色の発生
   1. 25%アンモニア2体と蒸留水1(2:1、v/v)を8分間混合して、水性アンモニア溶液でスライドを培養します
   2. 蒸留水で5分間洗います。
   3. 蒸留水で5分間洗います。
   4. 蒸留水で5%(w/v)チオ硫酸ナトリウムを暗闇で10分間培養します。
   5. 蒸留水で1分間洗います。
   6. 蒸留水で1分間洗います。
      注意:開発開始後は中断せずに完了してください。
3. 脱水とクリア
   1. スライドを70%エタノールに5分間浸します。
   2. スライドを96%エタノールに5分間浸します。
   3. スライドを100%エタノールに5分間浸します。
   4. スライドをキシレンに移して少なくとも6分間移動させます。

7. 永久的な取り付け

1. 各セクションにはPermount®取り付け用媒材(屈折率~1.52)を適用してください。
   注意:最適な画質を確保するために、取り付け媒体の屈折率は油浸け物レンズと互換性があるべきです。
2. カバースリップは気泡が出ないように慎重に置いてください。
3. 縁をクリアネイルポリッシュで塞ぎます。
4. スライドは室温で暗闇で48時間乾燥させます。

8. イメージング

注:イメージングモダリティや取得構成は顕微鏡ブランドによって異なります。最適な設定は各システムごとに決定されるべきです。

1. 顕微鏡をつけて。
2. 顕微鏡ソフトを開く
3. 顕微鏡ステージにスライドを置く。
4. 1X/0.04 N.A.や4x/0.10などの低倍率対物レンズを用いて脳切面の2Dワイドビュー画像を撮影します(図2A, B)。

9. ニューロン全体のイメージング

1. 10x/0.25 N.A.または20x/0.40 N.A.の対物レンズを用いて、関心のあるニューロンを含む領域の高解像度画像スタックをキャプチャします(図2C)。
   注:解析対象のニューロンは、完全かつ均質なゴルジ・コックスの受血を示し、明確に定義された樹状樹根と最小限の背景染色を示す必要があります。切断突起、不完全な浸漬、構造の重なり、または高い背景信号を持つ細胞は、正確な形態計測解析を確保するために除外すべきです。
2. 画像にピントを合わせ、露出やホワイトバランスを含むカメラ設定を調整します。
3. 画像スタックの上限と下限を設定します。
4. 画像取得ウィンドウ内でステップ距離を0.5μmに設定します。
5. スタック取得用のソフトウェアコマンドを使って画像スタックをキャプチャします。
6. 上記の手順を繰り返して、興味のあるすべてのエリアを捉えましょう。
7. データファイルとすべての画像ファイルを保存してください。外部処理用のTIFFフォーマット。

10. 樹状突起棘のイメージング

1. 適切な明視野顕微鏡で63倍/1.4 N.A.の油浸入対物レンズを用いて、関心のあるニューロンを含む領域の高解像度画像スタックをキャプチャします(図2D)。
   注:本稿では、図2Dに示された樹状棘の高解像度画像を、ツァイスモデルLSM 780の明焦点顕微鏡の明視野モードを用いて取得しました。しかし、他の明視野顕微鏡は63倍の高品質Zスタック画像を得るために使われることがあり、そのパラメータは各研究所で標準化されるべきです。
2. スライドに浸漬油を1〜2滴塗り、対物レンズをスライドの上に置き、対物レンズとオイルが接触するようにします。
3. 画像にピントを合わせ、露出やホワイトバランスを含むカメラ設定を調整します。
4. 画像スタックの上限と下限を設定します。
5. 画像取得ウィンドウ内でステップ距離を0.3μmに設定します。
6. スタック取得用のソフトウェアコマンドを使って画像スタックをキャプチャします。
7. 上記の手順を繰り返して、すべての興味のあるエリアを捉えましょう
8. データファイルとすべての画像ファイルを外部処理用にTIFF形式で保存してください。
   注:ステップ9と10については、もしZスタック取得用のモーター付きステージが搭載されていない場合、マイクロフォーカスを調整して手動で画像を収集できます。しかし、光学セクション間の間隔はあまり正確でない場合もあります。この場合、Zスタックは取得した画像配列から画像処理ソフトウェア(例:ImageJ)で再構築可能です。

11. 形態計測解析

注意:この目的のために様々なアプローチや専門的なソフトウェアプログラムが使用可能です。樹状突起脊椎解析のための無料アクセスツールには、ImageJや本研究のようにPyReconstruct¹⁵があります。PyReconstructおよびニューロン再建および形態計測解析の機能についてのより詳細な説明については、参照元の情報源を参照してください。

1. 樹状棘形態計測解析の手順
   1. ImageJでファイルを開いたら、「 Image > Type > RGB Color」を選択してフォーマットをRGBに変更します。
   2. Zスタックを画像シーケンスに変換するには、ImageJで「ファイル>画像系列として保存」をクリックして>。 各画像シーケンスは後回の分析用に別フォルダに保存してください。PyReconstructでは、画像から新しい>>をクリックして画像シーケンスを読み込みます。
   3. ダイアログウィンドウが表示され、ファイル名の割り当てを促します(例:WTVR1N1 – 野生型車両マウス1、ニューロン1)。
   4. その後、3つの連続したダイアログウィンドウが表示されます。最初のウィンドウでキャリブレーション値(μm/px)を入力します。この情報はZスタックメタデータで利用可能で、ImageJでアクセス可能です。
   5. 2つ目のウィンドウには、各連続する光学断面の厚さ(μm)を入力します。最後に、画像系列は自動的に読み込みを開始します(補足図1A参照)。
   6. 関心のあるセグメントが特定されたら、研究者が定めた包含基準に従ってトレースを行い定量的データを取得します。
   7. 各トレースの種類に別の名前とドメインを割り当てます。ドメインは下のパネルにあり、異なる色の幾何学的形状で表されています(補足図1B)。
   8. 鉛筆ツールを使って、希望のサンプル長に対応する線を描きます。次に、Zツールを使って樹状状セグメントに沿ってZスタックを通る2本目のトレースを生成します。
   9. 初期トレースを使って適切なセグメント長を決定し、「 リスト > Zトレースリスト 」(補足図1B)で検証してください。
   10. Zスタックを進め、最適な焦点を合わせて樹状突起の棘の頭部を特定しましょう。鉛筆ツールを使って、各背骨の最先端の広い部分をなぞります。次に、Zツールを使ってZスタック全体に背骨の首をなぞります(補足図1C、D)。この手順を繰り返し、選択した樹状細胞セグメント内のすべての脊椎の頭部と頸部を追跡します。
2. 背骨頭部の輸出測定
   1. 背骨の頭幅と長さの測定値を含むリストを開きます。これらはそれぞれ「 Lists > Trace List (幅)および Lists > Z-trace List (長さ用)でアクセスできます。
   2. データをコンピュータ上の希望の場所にエクスポートします。対応する測定データを含む2つの別々のExcelファイルが生成されます。
3. 脊椎の形態を分類し、密度を計算します
   1. 以前に生成されたExcelファイルから、脊椎の頭と首の幅と長さの測定値を抽出します。
   2. データは形態分類のために、以下の基準¹⁶に基づいて幅と長さとラベル付けされた列に整理されるべきです:糸足(>2μm)、細い(<2μm)、短茎(長さと頭幅比≤1)、およびキノコ(頭部幅>0.6μm)。(補足図1E)解析された樹状細胞セグメントでは線足がほとんど観察されなかったため、分析には含まれませんでした。
   3. この段階で解析された樹状体セグメントあたりのトゲの総数、トゲ密度(線形μmあたりのトゲ数)、および各スパイン亜型の種類と数が決定されます。この分析に使用されるExcelテンプレート¹⁶ は参照されたソースで入手可能です。この方法を用いて、12か月の雌マウスの海馬CA1領域における基底樹状棘密度を定量化しました。
   4. 定量化されたデータをエクスポートし、データ分析、グラフ作成、統計に特化した科学ソフトウェアアプリケーションでグラフを生成できます。ここで図 3 のグラフはGraphPad Prismソフトウェアで作成されました。

結果

組織の浸漬と切片
ここで述べたゴルジ・コックスプロトコルは、成体マウスの脳組織において信頼性が高く均一な神経染色を生み出しました。ゴルジ・コックス溶液に浸透した後、脳は特徴的な濃い黄金色を獲得し、染色溶液が組織全体に成功的に拡散したことを示しています。振動切断は神経細胞のソーマタおよび樹状突起の構造的完全性を保持しました。

ニューロンの可視化
ブライトフィールドイメージングにより、背景染色が最小限に抑えられ、明確に定義された神経細胞体と樹状アーバーが明らかになりました。個々のニューロンは、二次および三次樹状枝を含む全体を可視化できました。高倍率では樹状節によく分像された棘が見られ、形態計測解析が可能でした。

樹状棘の定量的解析
このプロトコルの定量的構造解析への適用性を示すため、12か月齢の雌マウスの海馬CA1領域の錐体ニューロンで基底樹状棘...

ディスカッション

ゴルジ・コックス染色法は、固定された^{脳組織における}神経形態や樹状棘を可視化する最も広く使われている技術の一つ^です。小さくランダムなニューロンのサブセットを受浸させることで、背景染色を最小限に抑えた完全な樹状樹木の可視化を可能にします。本プロトコルでは、この技術により海馬錐体ニューロンとその樹状突起棘の明確な可視化が可能となり、明視野顕微鏡およびZスタックイメージングを用いた信頼性の高い形態計測解析が可能となりました。このプロトコルで得られる染色品質や神経形態の代表例は図1および図3に示されており、神経細胞構造は組織全体の切片から個々の樹状棘まで多岐にわたります。

いくつかの実用的な改良やトラブルシューティングの方法によって、染色の一貫性を向上させることができます。すべてのゴルジ–コックス溶液は試薬の安定性を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	ライフ・テクノロジーズ	15510-027	CAS 9012-56-6
アンモニア溶液 25%	メルク	208380	CAS 1336-21-6。危険だ。
無水リン酸ナトリウム二塩基性	シグマ・オルドリッチ	S3264	CAS 7558-79-4
明視野顕微鏡	ニコン	エクリプス・シ
硫酸クロムカリウム	シグマ・オルドリッチ	243361
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM 780
デジタルバランス	アキュリス・インスツルメンツ	W3200-1200
埋め込み型	メルク	E6032	寸法:22×22 mm
エタノール	マイヤー	394
実験動物	ジャクソン研究所	2124-01	B6129SF2/Jマウス株
ゼラチン粉末	シグマ・オルドリッチ	G2500
GraphPad プリズムソフトウェア	グラフパッド・ソフトウェア株式会社		バージョン 8.0.2
ImageJ フィジー・ソフトウェア	米国国立衛生研究所		バージョン1.54p、https://imagej.net/software/fiji/downloads
塩化水銀	J.T.ベイカー	2594-01	CAS 7487-94-7。危険だ。
顕微鏡カメラ	ニコン	DS-Vi1
顕微鏡対物鏡(10倍)	ニコン	93183	プラン10倍/0.25 N.A.
顕微鏡対物鏡(1倍)	ニコン	93180	プランUW 1x/0.04 N.A.
顕微鏡対物レンズ(20倍)	ニコン	93184	プラン20x/0.40 N.A.
顕微鏡対物レンズ(4倍)	ニコン	93182	プラン4x/0.10 N.A.
顕微鏡対物レンズ(63倍)	ツァイス	420782-9900-799	プランAPO 63x/1.4 N.A.オイルDIC
顕微鏡スライド	シグマ・オルドリッチ	S8902
一水和リン酸ナトリウム一塩性	J.T.ベイカー	3818-05	CAS 10049-21-5
ネイルポリッシュ	罪深い色	大胆な色	透明
パーマウントマウントマウントメディア	フィッシャー・サイエンティフィック	SP15-500
クロム酸カリウム	プロダクトオス・クビアキューテ;ミコス・モンテレイ	2784	CAS 7789-00-6。危険だ。
二クロム酸カリウム	シグマ・オルドリッチ	207802	CAS 7778-50-9。危険だ。
PyReconstructソフトウェア	テキサス大学オースティン校		バージョン1.19.0、https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
塩化ナトリウム	フェルモン	24912	CAS 7647-14-5
チオ硫酸ナトリウム	プロダクトオス・クビアキューテ;ミコス・モンテレイ	7291	CAS 7772-98-7。危険だ。
ショ糖	J.T.ベイカー(アヴァントール)	4072-05	66.55°比回転、ACS試薬
ビブラトーム	ライカ・バイオシステムズ	VT1200S	速度 20 mm/s、AMPL & ndash;0.60mm
キシレン	CTRサイエンティフィック	CTR05128	CAS 1330-20-7。危険だ。