幹ライディヒ細胞におけるマトリックス剛性の影響を研究するための可変ポリアクリルアミド水素ゲルの製造

サマリー

本プロトコルは、制御された二次元培養系におけるマトリックス力学が幹ライディヒ細胞の挙動に与える影響を研究するため、剛性調整可能なポリアクリルアミド水素ゲルの製造方法を説明しています。

要約

細胞外マトリックス(ECM)の剛性は幹細胞の挙動を決定的に調節します。以前、加齢に伴うマトリックス硬性の病理的増加が幹細胞ライディヒ細胞(SLC)の恒常性を乱し、テストステロンの低下を引き起こすことを示しました。この発見を基に、本研究室で開発された詳細なプロトコルを紹介します。これは、試験官内で精巣 微小環境をモデル化するために、硬度を調整可能なポリアクリルアミド(PA)ハイドロゲルの製造方法として用いています。この方法は、1〜100 kPaの剛性範囲でゲルの再現性を可能にし、生理的から病理的条件までカバーします。主要なステップには、アクリルアミド/ビスアクリルアミドの精密な混合、ゲル膨張の平衡、スルフォ-SANPAHによる表面活性化、SLCの接着と培養を支援するコラーゲンコーティングが含まれます。標的剛性の最適化された配合や、不完全重合や細胞付着不良などの一般的な問題に対するトラブルシューティングのガイダンスを提供しています。 このシステムは、基質の剛性が定義された2次元条件下でSLCの増殖、分化、ステロイドジェニクス機能をどのように調節するかを体系的に調査することを可能にします。生殖生物学を超えて、他の細胞タイプの機械生物学的研究や、硬さ関連機能障害を標的とした治療薬のスクリーニングにも貴重なプラットフォームとして機能しています。

概要

細胞外マトリックス(ECM)の機械的特性は、幹細胞の運命の調節において重要な役割を果たし、増殖、分化、機能維持を含む1,2,3,4。精巣では、加齢に伴うECMの硬直がテストステロン産生の低下に関与しているとされています。しかし、精巣ニッチの生理的剛性範囲を忠実に再現する標準化されたin vitroモデルが存在しないため、基盤となる機械生物学的メカニズムは依然として十分に解明されていません。 若いマウスの精巣組織の生理的剛性は約1〜15 kPaですが、老化や線維化組織は20〜30 kPa以上に達することがあります。

ポリアクリルアミド(PA)ハイドロゲルは、アクリルアミドとビスアクリルア^ミド5,6の比率を変化させることで剛性を正確に調整できるため、細胞とマトリックスの相互作用を研究する多用途なプラットフォームとして浮上しています。コラーゲン被覆ガラスや市販のハイドロゲルなど他の基材と比べて、PAゲルは剛性と生化学的リガンド密度を独立して制御できるため、機械的な手がかりを体系的に解析することが可能です。PAゲル製造に関するプロトコルは複数存在^{しますが、}特にSLCのような希少な一次細胞に対しては、特定の細胞タイプに対する詳細な最適化が不足していることが多いです。

ここでは、マウスSLCの培養に適した、剛性が定義されたPAハイドロゲル(1–100 kPa)の強靭かつ再現性のあるプロトコルを提示します。この方法には、ゲルキャスティング、膨張の平衡化、スルホ-SANPAHによる表面機能化、細胞接着を促進するコラーゲンコーティングのステップバイステップの説明が含まれています。このプロトコルに従うことで、研究者は若(軟)精巣と老化(硬い)精巣の機械的環境を模倣した可変剛性(1〜100 kPaの範囲)の基質を生成でき、剛性依存的なSLC応答の定量的調査が可能になります。このシステムは他の機械感受性細胞タイプにも適応可能であり、硬性に関連する病理を標的とした薬物スクリーニングのプラットフォームを提供します。

プロトコル

すべての動物処置は中山大学の動物管理・利用委員会によって承認されました(承認番号:SYSU-IACUC-2026-B1278)および機関ガイドラインに従って実施されました。

1. 一次マウスSLCの単離および培養

1. C57BL/6マウスの精巣を解剖し、慎重に白鞘を除去します。
2. 睾丸を細かく刻みます。
3. 1 mg/mLのコラーゲン酵素IV型をDMEM/F12で37ºCで15分間培養することで、間質細胞を精細管から解離させます。
4. DMEM/F12に10%の胎児用牛血清を含むものを加え、コラーゲン酵素の活性を抑制します。
5. 室温で1500 × g で3分間遠心分離機に入れます。
6. ペレットをPBSで再懸浮させ、70μmフィルターでろ過します。
7. インフルックス細胞選別機を用いて蛍光活性化細胞選別(FACS)によりCD51⁺細胞を濃縮します。
8. 増殖細胞を、DMEM/F12に1 nMデキサメタゾン、1 ng/mL LIF、5 μg/L インスリン-トランスフェリン-ナトリウムセレナイト、5% 鶏胚抽出物、0.1 mM β-メルカプトエタノール、1% 非必須アミノ酸、1% N2、2% B27、20 ng/mL 塩基線維芽細胞増殖因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、オンコスタチンMを補足した SLC 培養培地に種子をまきました。
9. SLCを標準条件(37°C、5% CO₂)で培養し、ハイドロゲルにシードするための所定密度に達するまで続けます。

2. ジェル鋳造ガラス容器の組み立て

1. ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルの鋳造に使われる特殊なガラス板やスペーサーを注意深く点検・洗浄し、ホコリや損傷、残留物がないか確認してください。
2. メーカーの指示に従ってガラス板、スペーサー、クランプを正しく組み立て、ジェル鋳造時の漏れを防ぐためにしっかりと密閉してください。
3. 組み立てたガラス容器を実験台にしっかりと置き、鋳造の準備をします。
   注:鋳造セットアップは標準的なウェスタンブロット(硫酸塩デデシル硫酸ナトリウム[SDS]-PAGE)ガラス板を使用し、厚さ1.0mmの固定スペーサーを用い、ゲルの再現性と細胞培養に適した平らな表面を確保しています。

3. PAGEゲル混合液の準備

1. 実験設計に従い( 表1参照)、以下の試薬を15 mLまたは50 mLの無菌遠心分離機管に正確に計量します:40%アクリルアミドストック溶液、2%ビスアクリルアミドストック溶液、1M HEPESバッファー(pH 8.5)、無菌ddH₂O。
   注意:アクリルアミドとビスアクリルアミドは神経毒です。ドライパウダーを計量する際は、皮膚への接触や空気中の粒子の吸入を防ぐため、必ず手袋と防塵マスクを着用してください。処置はフムフード内で行うべきです。

4. 起爆剤と触媒を加え、ゲルを鋳造する

1. 混合溶液に次の成分を順次添加します:10%過硫酸アンモニウム(APS):重合反応を開始する開始剤として機能します。N,N,N',N'-四酸化エチルネジアミン(TEMED):重合反応を加速させる触媒として働きます。総ゲル容量が6 mLの場合、10% APSを60 μL、TEMEDを6 μL加えます(スケーリングについては表1参照)。
   注:重合反応はTEMEDを加えた直後に始まります。したがって、その後の手順は迅速に行う必要があります。

5. 混合溶液を注ぐ

1. すぐにピペットで混ざった溶液をガラス容器の一端に沿って一定に注ぎ、泡ができないようにしてください。

6. ゲルの重合を許す

1. 鋳造ジェル容器は室温でそのまま放置します。
   注:重合は通常、室温(20〜25°C)で15〜30分かかります。
2. 未重合ゲル混合物と重合ゲルの間に明確な界面が見え、ゲルが完全に固体になったら次のステップに進みます(容器を傾けてもゲルは流れません)。
3. 鋳造直後、ゲル混合物の上に絶対エタノール(または水を飽和したエタノール)の薄い層を慎重に重ねて、大気中の酸素を排除し、ラジカルポリマー化を妨害します。エタノールはまた、平らな表面を形成するのにも役立ちます。
4. 重合後、板を分解する前にエタノールを除去します。

7. 容器の分解とゲルの収穫

1. クランプを慎重に分解し、プラスチックのくさびやヘラでガラス板を優しくこじ開け、重合したPAGEゲルが片方のプレートに残るようにしてください。
2. 十分な量の無菌PBSを含む培養皿を準備します。
3. ヘラや手袋をした手でガラスプレートからジェルを慎重に剥がし、滑らかにPBSに滑り込ませてください。
4. ジェル入りの皿をPBSで密封し、4°Cで一晩培養します。
   注意:このステップは非常に重要です。新たに調製されたゲルは脱水され、水分を完全に吸収してPBSで最終的なサイズまで膨張しなければなりません。この工程を省略してゲルを直接切断すると、その後の培養培地で拡大が続き、培養井の面積を超えて使用不能になる可能性が高いです。腫れ後のジェルの厚さは1mmです。これは非常に重要です。なぜなら、ゲルの厚さが100μmを下回ると、細胞は下層の剛性培養プレートの硬さを感知し、意図された機械生物学的測定に干渉する可能性があるからです。

8. ゲルを切断し、培養プレートに移す

1. 翌日、4°Cからゲルを採取します。 培養皿のウェルサイズに合う直径の無菌生検パンチまたは刃切り器(例:6ウェルプレート)を用いて、無菌条件下でゲルを切断します。
2. バイオセーフティキャビネット内で、滅菌鉗子を使って切断したゲルディスクを優しく取り、空の無菌培養ウェルの中央に置きます。

9. 初期洗浄と紫外線照射

1. ゲルを含む井戸に十分な無菌PBSを加え、完全に浸透させます。
2. 培養皿を優しく揺らしてジェルの表面を洗い流します。
3. ピペットでPBSを吸引します。
4. この洗いをもう一度繰り返し、合計2回洗い、それぞれ3分間洗います。
5. 洗った後は、ジェルを覆うのに十分な無菌PBSを加えます。蓋を少し開けた状態で培養皿全体をUVランプの下に置き(バイオセーフティキャビネット内または専用のUV架橋器内)、1時間照射して基本的な滅菌を行います。

10. スルホ-サンパ架橋体の活性化

1. バイオセーフティキャビネット内で、井戸からPBSを慎重に吸引してください。
2. 吸引前に、液体の表面張力によるゲルの損傷を防ぐために、ピペットチップでゲルをウェルの壁や底から優しく分離してください。
3. 同じ培養プレート内の別のクリーンウェルに、滅菌鉗子を使ってゲルを移します。
   注意:ゲルを移す際は、まず少量のPBSをクリーンウェルに加えると、ウェル底とゲルの間に閉じ込められた空気の泡を排出するのに役立つだけでなく、追加の洗浄にもなります。
4. 架橋剤作動液の準備:0.2 mg/mLのスルフォ-SANPAH作動液を、滅菌水または推奨バッファー(例:PBS)で希釈して新たに製備します(表 1参照)。
   注意:溶液を光から守ってください。
5. ゲルを覆うのに十分なスルフォ-SANPAH作業液(例:12ウェルプレートなら250μL、6ウェルプレートなら500μL)を加え、ゲルを完全に覆い尽くします。
6. プレートを365 nm波長/120 mJ/cmの² UV光の下に置き、1時間照射します。
   注:このステップはスルホ-SANPAHを活性化し、ゲル表面の官能基に結合できるようにします。

11. 架橋剤の活性化と最終洗浄

1. 照射後、バイオセーフティキャビネット内の井戸からスルホ-SANPAH溶液を吸引します。
2. 十分な無菌PBSを井戸に加え、ゲル表面を軽く洗浄し、PBSを吸引します。
3. この洗浄をもう一度繰り返し、合計2回、各3分間洗浄し、未反応のスルフォ-SANPAHを完全に除去します。

12. ラットテールタイプIコラーゲン作業液の準備

1. 0.02 Mの酢酸溶液を溶媒として使い、ラットテールタイプIのコラーゲンストック溶液を希釈します。
2. 最終的な作業溶液濃度を60〜100 μg/mLに調整します。例えば、コラーゲンのストック濃度が4 mg/mLの場合、15〜25 μLのストックを0.02 Mの酢酸985〜975 μLに加え、1 mLの作動溶液を得ます。

13. コラーゲン被覆と培養

1. 活性化ゲルを含む各ウェルに適切な量のコラーゲン作業液を加えます。6ウェルプレートなら2mL、12ウェルプレートなら1mLです。
2. 培養プレートを優しく回して、コラーゲン溶液がゲルとウェル底部を均等に覆うようにします。
3. プレートを覆い、37°C、5% CO₂のインキュベーターで一晩培養し、Sulfo-SANPAH架橋によってコラーゲンがゲル表面に固定できるようにします。

14. 二次紫外線照射と固定

1. 翌日、プレートを取り外し、約120 mJ/cmの² UVライトで1時間照射します。

15. 結合していないコラーゲンと種子細胞を除去する

1. バイオセーフティキャビネット内で、ウェルからラットの尾タイプIコラーゲン作動溶液を慎重に吸引してください。
2. ウェルに無菌PBSを加え、ジェル表面を軽く揺らして洗浄し、PBSを吸引します。
3. もう一度洗い返し、合計2回洗い、それぞれ3分間洗います。
4. 洗浄後、ジェルマトリックスが完成します。準備済みの幹ライディッヒ細胞を完全なSLC培養培地(ステップ1で詳細な組成)に再懸濁させます。
5. 細胞懸濁液を直接ゲル表面にシードします。推奨されるシーディング密度は2×10⁴ セル/^cm² (例:標準的な6ウェルプレートの場合、1井戸あたり約2 ×^{10 5} セル)です。
6. 培養プレートは37°Cで加湿された5%CO₂インキュベーターで培養します。
7. 最適な細胞生存率とステロイドゲン機能を維持するために、培養培地を48時間ごとに交換してください。

結果

このプロトコルの成功により、1から100 kPaの範囲で明確な剛性を持つポリアクリルアミド水素ゲルが得られ、これらは培養プレートにしっかりと付着し、堅牢なSLCの接着と拡散を支えます。 図1 は、ゲルキャスティングから細胞シーディングまでのワークフロー全体の概観を示しており、プロトコルの主要な段階をユーザーが可視化できるようにします。

ポリアクリルアミド水素ゲル(目標剛性:1、5、15、30、50、100 kPa)の機械的検証は、振動レオメトリー(平行板形状、37°C)を用いて行われました。測定されたヤング率は1.1 ± 0.2 kPa、5.1 ± 0.6 kPa、15.2 ± 2.1 kPa、29 ± 3 kPa、51.7 ± 3.7 kPa、96 ± 6 kPaであり、記載された配合が意図された生理学的および病理学的剛性の範囲をカバーしていることが確認されました。PBSで4°Cで一晩の膨張後、ゲルは平衡寸法に達し、標準的な培養皿ウェルに合わせたカスタム...

ディスカッション

細胞外マトリックスの機械的特性は幹細胞の挙動を調節する上で基本的な役割を果たしますが、生殖細胞でこれらの効果を体系的に研究するためのツールは限られています。我々の先行研究では、加年中の病理学的マトリックス硬化がPiezo1/ROS/Gli1軸を通じた幹ライディヒ細胞(SLC)の恒常性を乱し、テストステロンの低下を引き起こすことが示されました¹⁰。この発見を基に、基質の剛性がSLCの機能を直接どのように調節するかを調査するための標準化され再現可能なプラットフォームを提供するポリアクリルアミドハイドロゲルプロトコルを開発しました。生理的剛性から病理的剛性(1〜100 kPa)までのハイドロゲルを製造できる能力により、研究者は若年および老化精巣の機械的微小環境をin vitroで再現できます。

ポリアクリルアミドハイドロゲルの取り扱いは簡単です。さらに、プロトコルにはUV架橋剤や剛性検証のためのレオメトリーや原子間力顕微鏡などの特殊機器へのアクセスが必要ですが、これらはすべ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸	シグマ・オルドリッチ	カタログ#A6283	ラットテールコラーゲン用希釈剤(0.02 M)
アクリアミド	サンゴン・バイオテック	Cat#A100341-0500	ポリアクリルアミドゲル製剤のためのモノマー
過硫酸アンモニウム(APS)およびnbsp;	サンゴン・バイオテック	Cat#A100486-0100	ゲル重合のイニシエーター
B27サプリメント	インビトロジェン	猫#A1486701	抗酸化物質およびホルモンを豊富に含む定義されたサプリメント;神経細胞および幹細胞の生存率を支持します(2%のV/V)
基礎線維芽細胞成長因子(bFGF)	インビトロジェン	猫#13256029	ミトゲン成長因子;SLC増殖と幹性を促進します(20 ng/mL)
ビスアクリルアミド	上海元業バイオテクノロジー	カタログ#S14002	ポリアクリルアミドゲル用の架橋剤
鶏の胚抽出物	アメリカのバイオロジカルズ	カテゴリー#C3999	成長因子と栄養素の豊富な供給源;SLCの成長と生存率を支持(5% v/v)
ネズミの尾から取れるタイプIのコラーゲン	イェーセン	Cat#40125ES50	スルホ-SANPAH活性化ポリアクリルアミドハイドロゲル表面をコーティングし、SLCの接着と培養を促進します。
コラーゲナーゼタイプIV	ギブコ	カタログ#17104-019	精巣組織消化のためにDMEM/F12に1 mg/mL
CYP11A1 抗体	ジェネテックス	猫#GTX56293	ウェスタンブロッティング用
デキサメタゾン	シグマ・オルドリッチ	分類番号#D1756	グルココルチコイド受容体作動薬;SLCの増殖と幹の維持を支援(1 nM)
DMEM/F12 ミディアム	ギブコ	猫#11320033	消化、洗浄、SLC培養のための基礎培地
表皮成長因子(EGF)	ペプロテック	Cat#AF-100-15	SLC増殖を刺激し、未分化状態(20 ng/mL)を維持します
胎児用牛血清(FBS)	ヴィステック	カタログ#SE100-011	コラーゲン酵素活性を抑制するために10%で使用します
フィジー	該当なし	https://imagej.net/Fiji	画像解析ソフトウェア
GADPH抗体	プロテインテック	猫#60004-1-Ig	ウェスタンブロッティング用
ゲル消化酵素	正確なバイオテクノロジー	Cat#GXDLFA	精巣組織消化およびSLC分離のための酵素混合物
HEPES	シチバ	Cat#SH30237.01	pH 7.0&ndashを維持するためのバッファー;7.4
HSD3&β;抗体	サンタクルーズ	Cat#sc-515120	ウェスタンブロッティング用
インフルックスセルソーター	BD	https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
インスリン-トランスフェリン-セレナイトナトリウム(ITS)	シグマ・オルドリッチ	猫#11074547001	細胞の生存、グルコースの取り込み、抗酸化防御を促進します(5 & μ;g/L)
ノックアウト血清置換(KSR)	ギブコ	カタログ#10828-028	SLC培養培地の血清代替
LIF(白血病抑制因子)	ミリポール	猫#LIF1010	幹細胞の多能性と自己更新を維持するサイトカイン(1 ng/mL)
ネズミの精巣	この論文	該当なし	C57BL/6マウスから分離
マウステストステロンELISAキット	ファイン・バイオテック	カタログ#40203ES80	培養上清液中のテストステロンの定量化のために
マウス:C57BL/6	深圳トップバイオテック	該当なし	精巣採取に用いられるマウス株
マウス:精巣幹ライディヒ細胞(SLC)およびnbsp;	この論文	該当なし	マウス精巣から分離された一次細胞
N2サプリメント	インビトロジェン	猫#17502001	神経および幹細胞培養をサポートする定義された血清フリーサプリメント(1% v/v)
非必須アミノ酸	ハイクローン	Cat#SH30050.03	タンパク質合成および細胞代謝のための窒素供給源(1% v/v)
オンコスタチンM(OSM)	ペプロテック	Cat#300-10T	SLC分化調節およびレイディッヒ細胞成熟に関与するサイトカイン(20 ng/mL)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	猫#10010023	洗浄および再懸濁バッファー
血小板由来成長因子(PDGF)	ペプロテック	Cat#100-14B	細胞増殖、移動、生存をサポートします(20 ng/mL)
プリズム9.0	グラフパッド	https://www.graphpad.com/	統計解析およびグラフ作成のためのソフトウェア
StAR抗体	プロテインテック	猫番号#67130-1-Ig	ウェスタンブロッティング用
スルフォ-SANPAH	マックリン	カタログ#102568-43-4	ゲル表面活性化のための異質汎能性架橋剤
TEMED	フィゲネ	猫#PH0341	重合の触媒
&β;-メルカプトエタノール	インビトロジェン	猫#21985023	酸化ストレスを軽減し、培養中の細胞成長をサポートします(0.1 mM)