組織因子陽性血小板の全血流量サイトメトリック定量:多中心連携ワークフロー

サマリー

ここでは、多施設研究における組織因子陽性血小板のフローサイトメトリー定量のための調和されたワークフローを示します。このプロトコルは、採血、全血固定、染色、器具の調和に関する標準化された手順を記述しており、検査室の能力に応じて局所または中央で分析を行うことを可能にします。

要約

組織因子(TF)^pos-血小板は血小板集団の一部を表します。最近では、このサブセットが冠動脈疾患患者の心血管死亡率を予測することが示されており、血栓リスク層分けに役立つバイオマーカーとして確立されています。フローサイトメトリーによるTF^ポスプラセットの正確な定量化には、特に技術的なばらつきが測定に影響する多施設研究において、事前分析の取り扱い、染色手順、器具設定の厳格な標準化が必要です。本プロトコルは、異なる技術インフラを持つ検査室間で再現性を確保するよう設計された、循環中のTF^ポジストレトレットの全血フローサイトメトリー評価のための調和されたワークフローを説明しています。この手技には標準化された採血と全血固定が含まれ、 生体内血小板の表現型を保持します。サンプル準備には、現地の検査室の能力に応じて2つの異なる方法が提供されています。フローサイトメトリー施設のないセンターでは、固定サンプルをコアラボラトリーに輸送し、集中染色、採取、分析を行う方法、またはフローサイトメトリー機器と訓練を受けたスタッフを備えたセンターでは局所染色・採取を行う方法です。TF^ポジス血小板の割合の評価は、抗TFスターフルオ488抗体および抗CD41 PerCP-Cy5.5抗体による直接標識により、それぞれ標的タンパク質と血小板集団マーカーを特定します。フローサイトメーターの調和は、同一のサイトメーターモデルの共有取得テンプレートや、異なるプラットフォーム向けのビーズベースのアライメントによって達成されます。ワークフローはさらに標準化されたゲーティングアプローチと集中型データ解析を取り入れ、各サイト間で信頼できるTF^ポジスト血小板測定値を比較できるようにします。代表的な結果は、このワークフローが検証済みの多中心取得設定におけるTF^ポスプラテレットの再現性定量を支援することを示しました。このプロトコルは、血栓リスク層別化におけるTF^ポジス-血小板評価のより広範な応用を促進し、翻訳研究および臨床研究における血小板フローサイトメトリーの標準化をさらに広げる可能性があります。

概要

組織因子(TF)は血液凝固カスケードの主な起爆因子であり、トロンビン生成の重要な決定因子です。TFは内皮下細胞や白血球による古典的な発現に加え、循環血小板1,2,3,4,5とも関連しています。血栓形成の際、メガ核細胞はTFを血小板⁶の一部に移します。生理学的条件下では、循環中の血小板の約20〜30%が開放管系内にTFを含み、血漿因子^VII7から空間的に分離されています。この区画化された状態では、TFは循環する凝固因子から機能的にシールドされ、不活性なままです。したがって、健康な個人の全血をフローサイトメトリーで解析した際に表面TFを検出できる血小板はごく一部に過ぎず、生理学的恒常性を反映しています^2,8。血小板活性化や血栓炎症性不均衡を特徴とする病理的状態は、この平衡を乱し、TFの表面曝露増加を引き起こすことがあります。TF陽性(TFpos)血小板の割合の上昇は、9^{、10、11、12、13、14、15}の血栓性疾患で報告されています。特に冠動脈疾患において、TF^ポス血小板レベルが4%を超えると独立して5年追跡時の心血管死亡率を予測し、TF^ポス血小板の割合が血栓リスクの臨床的に関連性バイオマーカーであることを確立しました¹⁶。

したがって、TF^ポジス血小板の正確かつ再現性のある定量は、トランスレーショナルおよび臨床研究の両面で不可欠です。以前に発表された血小板フローサイトメトリーのTF^ポジス・血小板評価のワークフローは、単一^{センター環境での} このタンパク質の研究を改善し、選択された事前解析または分析ステップの最適化に関する助言を提供しています。しかし、このアプローチは、輸送手順、標準化されたサンプル処理、異なるフローサイトメータープラットフォーム間でのサンプル採取の調和の必要性など、多施設研究に伴う追加の物流的・分析的課題に対応するために特別に設計されたものではありませんでした。さらに、参加センターのインフラや技術レベルの違いも考慮する必要があります。

この文脈において、本プロトコルの付加価値は、標準化された採血と全血固定、柔軟なサンプル処理プロトコル、クロスプラットフォームの取得調和、データ分析による直接染色および集中型品質管理を組み合わせた詳細なワークフローを提供することにあります。

したがって、本研究の目的は、フローサイトメトリーによる全血中TF^ポスプラセット分析の調和的な多施設実装のための運用的枠組みを提供することです。この統合設計により、前分析、分析、器具間変動が低減され、多中心環境下での^TFポス小板の一貫した評価の条件が整います。

プロトコル

すべての献血者は、機関の倫理委員会(No.70/24, CE 18.06.24)によって承認された書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

TF^ポス小板の全血流量サイトメトリー定量のための多施設ワークフローは 図1にまとめられています。以下に詳述するプロトコルは、ユーザーを5つの主要なステップへと導きます。

図1:TF^ポジストレト分析の多中心ワークフロー。全血フローサイトメトリーによる循環TF^ポプラス血小板の多施設評価分析パイプラインの概略図。被験者の登録および採血後、各臨床ユニットで利用可能な技術的資源に基づいてサンプルが固定・処理されます。フローサイトメトリー施設のないセンターでは、固定サンプルをコアラボに送り、染色、取得、分析を行います。フローサイトメーターを備えたセンターでは、標準化された取得テンプレートを用いて現地で染色および取得を行うことができます。機器の調和は、共有テンプレート(同じ機器モデル)、コアラボで生成されたテンプレート(アライメント用に異なるモデルが利用可能)、または直接テンプレートの調和が不可能な場合の蛍光ビーズによる校正によって実現されます。データ分析は標準化されたゲートワークフローを用いて中央集権的に行われます。この図はChatGPT(OpenAI)を使って作成されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. 採血

注:TF^ポジス血小板評価では、最大50μLの全血が必要です。

1. 19ゲージのバタフライ針を使って肘前静脈から末梢静脈血を採取します。止血帯は静脈穿刺の時のみ使用し、針を挿入した直後に解除することで体 外血小板の活性化を最小限に抑えてください。
2. 最初のEDTAチューブは廃棄します。その後、血液を0.129Mのクエン酸ナトリウム真空管に集め、製造者の標高に合わせてチューブを満たし、適切な血液と抗凝固剤の比率を保ちます。
3. 血液と抗凝固剤をしっかり混ぜるために、優しく5回逆転させます。
4. チューブは室温で直立して保ち、攪拌や冷蔵、空気圧輸送を避けてください。
5. 採取後3時間以内にサンプルを処理してください。

2. サンプルの準備

注意:すべての抗体はコアラボラトリーが購入し、同じロットから採取されなければなりません。進行中の研究中にバッチ変更が必要になった場合、新しい試薬バッチは同じアッセイ条件下での並行試験を通じて直接使用中のバッチと連携し、同等の性能が確認された場合のみ採用すべきです。一般的に使用される試薬(例:PBS(リン酸緩衝生食塩水)やPFA(パラホルマルデヒド)は、各参加センターが購入することができます。ただし、製品コードはコアラボラトリーで使用されるものと一致しなければならず、研究全体を通じてバッチの一貫性を維持しなければなりません。

1. サンプルを固定しろ。
   注意:血液処理を始める前に、室温でPBSで4%のPFAを希釈して1%のPFAを準備してください。
   注意: PFAは有毒であり、適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用しながら化学フードで取り扱うべきです。吸入や皮膚・目への接触は避けてください。廃棄物処理:すべてのPFA含有溶液、固定サンプル、汚染消費品を、機関および地域の規制に従い適切にラベル表示された密閉型有害廃棄物容器に収集してください。
   1. バキューテーナーを優しく5回逆さにして血液と抗凝固剤を混ぜます。
   2. 50μLの血液を2mLチューブに移し、1%PFAを含む950μLを含みます。
   3. サンプルを優しく混ぜ、室温で1時間から30分培養します。
   4. PBSを500μL追加します。
   5. 室温で1500 x gで5分間遠心分離機にします。
   6. 上澄液を取り除き、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁させます。
      注意:技術チェックポイント: 遠心分離後、ペレットが見えるか確認してから上澄液を取り除きます。ペレットを乱さずに上澄液を慎重に取り除きます。再懸浮液後、試料が均一で目に見える塊や集合体がないことを確認します。
   7. 固定サンプルは、固定後24時間以内に2〜8°Cに保温された温度管理パッケージでコアラボラトリーへ輸送してください。凍らせないでください。書類の収集時間、固定時間、出荷時間です。
2. フローサイトメトリー解析のためのサンプルラベリング。
   注:抗TFスターフルオ488(クローンHTF1;抗CD142)は組織因子に作用し、一方抗CD41PerCP-Cy5.5は血小板インテグリンαIIbを認識します。染色作業を始める前に、遠心分離機で抗体を17000 x gで+4°Cで5分間投与し、集合体¹⁸を除去します。PBSで希釈した抗TFスター・フルオナ488抗体(1:100)。Anti-CD41 PerCP-Cy5.5は中間希釈を必要としず、製造元が推奨する量で使用すべきです。
   1. 2mLのポリプロピレンチューブを4本準備します。
   2. 各チューブに80μLの固定サンプルを分散します。
   3. 各チューブに表 1 (1日目)に示された適切な量のPBSおよび抗TFスター・フルオナ488抗体を加えます。
   4. サンプルを優しく混ぜます。
   5. O/Nは暗闇で4°Cで培養します。
   6. 翌日(2日目)に、 表1に示された通り、3および4管に抗CD41 PerCP-Cy5.5を追加します。
   7. サンプルを優しく混ぜます。
   8. 暗闇の中、室温で15分間孵育します。
   9. 各チューブに300μLのPBSを希釈します。
   10. 染色されたサンプルはフローサイトメトリー取得まで暗闇で保管します。
       注:サンプルは最大3日間¹⁷°Cで保存可能です。長時間の保存は信号の減衰を徐々に引き起こし、避けるべきです。

		1日目		2日目
いいえ。	チューブID	1×PBS(μL)	アンチTF スターフルア488(μL)	アンチCD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	染色なし	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

表1:TF^ポジス-血小板評価のための染色プロトコル。

3. フローサイトメーター取得の標準化

1. 取得テンプレートの設定(コアラボによる)。
   1. フローサイトメーターA用のテンプレート設定。
      1. ソフトウェアAバージョン2.6を開きます。
      2. 細胞集団を可視化するために、対数スケールでFSC-A/SSC-A点図[全イベント]を作成してください(図2A)。
      3. CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-Aドットプロット[全イベント]をログスケールで作成し、[血小板]ゲート内の血小板を特定します(図2B)。
      4. PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-Aの擬似カラープロット[全イベント]を作成し、スピルオーバー/補償の有無を確認します(図2C)。
      5. [血小板]ゲートでFSC-A/FSC-Hドットプロットを作成し、単一点([シングレット]; 図2D)。
      6. CD41 PerCP-Cy5.5-A/TFスター・フルオナ488-A点プロットを[シングレット]ゲートに作成し、TF^ポスプラトレットを特定します(図2E)。
      7. SSC-Hで閾値を1000に設定してください。
      8. 流量を「遅い」に設定してください。
      9. 正負の事象の最適な識別を確保するためにB525ゲインを315に設定します。必要に応じて使用する器具に応じて調整してください。
      10. B690ゲインは日々のQCに合わせて設定してください。CD41^ポス-血小板集団が陰性背景から完全に解消され、取得時にテンプレート内で設定されたあらかじめ定義された参照ゲート内に収まっている場合にのみ取得が認められます。
      11. 「Export Experiment Template」を使ってテンプレートをエクスポートしてください。
      12. ダウンロード: フローサイトメーターA上のTF^ポジス血小板解析の取得テンプレートは、 補足ファイル1 および 補足図1としてダウンロード可能です。
          注:このマルチパラメトリック解析には必須ではありませんが、スピローバー/補償の検証用プロット(図2C)が含まれています。それでも、このプロトコルで提案されたものとは異なるフルオロクロームの組み合わせを使用するかどうかは検討されるべきです。
   2. フローサイトメーターBのテンプレートを作成します。
      1. 3.1.1で説明されている全取得セットアップを含むプロトコルファイルを作成します。
      2. ソフトウェアB v1.6の「エクスポートプロトコル」機能を使ってテンプレートをエクスポートし、プロトコルファイルを生成します。
      3. 受信機器では、ソフトウェア内の「インポートプロトコル」機能を使ってプロトコルファイルをインポートします。
   3. フローサイトメーターCのテンプレート作成。
      1. 3.1.1で説明されている全取得セットアップを含むワークスペースファイルを作成します。そしてエクスポートする。
      2. 受信機器では、ソフトウェアC v3.1の「コピー」機能を使ってワークスペースファイルをインポートします。
2. キャリブレーションビーズを用いたフローサイトメーターの調和。
   注意:6ピークのレインボーキャリブレーションビーズを使用してください。
   1. 目標価値の定義。
      注意:B525蛍光チャネルの最初のピークの中央値蛍光強度(MdFI)を定義するには、以下の式を用いてください。
      MdFI_CU =
      ここでCUは臨床ユニット機器、RIは参照機器です。
   2. サンプルの準備。
      1. ビーズの小瓶をボルテックス。
      2. サンプルチューブにビーズを5滴加えます。
      3. PBSを1mL加えます。
      4. 5〜10秒のボルテックス。
   3. ビーズの取得。
      1. 対数スケールでFSC-A/SSC-Aドットプロットを作成し、[すべてのイベント]を表示し、[ビーズ]と呼ばれる領域を定義します(図3A)。
      2. [Beads]ゲートにFSC-A/FSC-Hドットプロットを作成し、シングレット[シングレット]を識別する領域を定義します(図3B)。
      3. Star Fluor 488蛍光チャネル(B525)のヒストグラムプロットを作成します。
      4. ヒストグラム上に[シングレット]のみ 表示してください。
      5. 最初のピークの幅全体( 図3Cの領域B)にゲートを描きます。
      6. 統計リボンにはXの中央値(X-Med)値を表示します。
      7. 既存の報酬はすべて削除してください。
      8. 流量を「遅い」に設定してください。
      9. 「ラン」モードで取得を開始してください。
      10. 「取得設定」から、B525の電圧/利得を目標値に基づいて計算したX-Medターゲットに修正します。
      11. その受理基準に達した後にのみ、[シングル]ゲートに10,000件のイベントを記録します。目標範囲に達するまでは研究サンプルを入手しないでください。

補足ファイル1:フローサイトメーターAの^TFポジス・プラテレット分析の取得テンプレートをダウンロード可能。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図1: フローサイトメーターA上の^TFポジス・プラテレット解析の取得テンプレートのスクリーンショット。(A) FSC-AとSSC-Aのドットプロットは、全体のイベント分布を視覚的に示します。(B)血小板はCD41対SSC-Aプロットで同定され、[血小板]としてゲートされる。(C) PerCP-Cy5.5とStar Fluor 488のプロットを含み、潜在的なスピローバーを評価する。(D) FSC-A対FSC-Hプロットを用いて[Bloodlets]ゲート内で二重を除外し、[Singlets]集団を定義する。(E) TF^ポス -プラセットは、PerCP-Cy5.5およびStar Fluor 488蛍光に基づき、[シングレット]ゲート内で同定されます。(F-H)サンプルフローレート(遅い)、一次閾値(SSC)、検出器ゲイン(B525およびB690)などの取得設定がテンプレートで実装されています。取得の設定およびワークフローの詳細は3.1節に記載されています。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

図2:TF^ポスプラセットの同定のための取得テンプレートとゲート戦略。 (A) FSC-A/SSC-A ドットプロット(ログスケール)で、検出されたすべての事象を示します。(B) 血小板集団を特定するために用いられるCD41-A/SSC-A点図。(C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488擬似カラープロットは、スペクトルスピルオーバーおよび補償要件を評価するために使用されます。(D) [血小板]ゲート内のFSC-A/FSC-Hプロットで、ダブルレットを除外しシングレットを定義する。(E) TF^ポスプラセット同定に用いられた[シングレット]におけるPerCP-Cy5.5/Star Fluor 488点プロット。括弧内に表示される統計フィールドは、サンプル取得時にテンプレートを適用すると自動的にサンプル固有の値で埋め込まれます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ビーズを用いた機器の校正手順。 (A) ビーズイベントを識別するために用いられるFSC-A/SSC-Aプロット。(B) 集合体を除外しシングレットを定義するために用いられるビーズイベント内のFSC-A/FSC-Hプロット。(C) スターフルオフルオ488のヒストグラムで、ビーズピークを示し、中央値蛍光強度の決定のために最初のビーズピークにゲートを適用。視覚化された統計は代表的なものとみなされます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. TF^ポジス・血小板解析のためのフローサイトメトリーサンプル採取

1. FCMテンプレートを使って購入しましょう。
   1. ソフトウェアA内の 「インポートテンプレート」 機能を使って取得テンプレートをインポートします。
   2. ステップ2で準備したサンプルを入手してください。
   3. データ記録前に、血小板ゲートとシングレットゲートが参照図の形状と一致しているか確認してください。必要に応じてゲートを調整してください。
   4. 5〜10秒の安定した流れで記録を始めます。[Singlets] gate ( 図2D参照)内に20,000件のイベントを記録する。補償されていない.fcsファイルを保存し、Core Laboratoryに転送してください。
2. FCMテンプレートなしの取得。
   1. セクション3.1で報告された取得ワークシートを再現し、5つのプロットとゲート階層:TF/CD41象限>すべてのイベント>血小板単粒>を含みます。
   2. SSC-Hで閾値を1000に設定してください。
   3. 流量を「遅い」に設定してください。
   4. B525の電圧/利得を3.2.3で定義したように設定してください。
   5. ステップ2で準備したサンプルを入手してください。5〜10秒の安定した流れで記録を開始します。[シングルレット]ゲート内で20,000件のイベントを獲得しましょう。補償されていない.fcsファイルを保存し、コアラボに転送してください。
      注意:日々のQC計器が合格した場合のみ取得が認められます。20,000 CD41^陽性小板の目標値に達しない場合は、最低10,000 CD41^陽性血小板イベントを取得してください。

5. データ分析

注:以下に説明する分析ワークフローは、集中型データ処理と品質管理を担当するコアラボラトリーの活動を支援することを目的としています。

1. 新しい解析ワークシートを開き、.fcsファイルを読み込みます。
2. 各サンプルに対して、 図2に示すように分析テンプレートを作成します。同一でないプラットフォームの場合は、同じゲート構造と統計出力を持つ同等のプラットフォーム固有のテンプレートを使用します。
3. ゲートがあらかじめ定義された散乱特性とシングルレット識別戦略に従って血小板集団を正しく特定しているか確認してください(図4A、B、D)。
4. 擬似カラープロット(全イベント)を用いてスピローバーや補正の有無を確認します(図4C)。
   注:フルオロクロムのスターフルオフル488はスペクトル放射が520 nmであるのに対し、PerCP-Cy5.5は676 nmのスペクトル放射であるため、重なりがなく補正が不要な理由が説明されています。
5. Star Fluor 488ドットプロット(図5)に以下のゲートシーケンスを適用します。
   1. 染色なし: 染色されていない対照群を用いて、背景のTF^ポジイベントが血小板イベントの0.01%以下に保たれ、血小板自己蛍光を除外する象限を定義します(図5A)。
   2. TF: 染色されていないサンプルで定義された象限座標を適用し、単一染色サンプルの^TFポジス信号を識別します(図5B)。
   3. CD41:単一の染色されたCD41サンプルを用いて、血小板の背景蛍光を除外する象限を定義します(図5C)。
   4. TF/CD41:同じ象限座標を適用して、TF/CD41染色サンプルのTF^ポジス信号を識別します(図5D)。
      注:最終的なTF^ポジストレトパーセンテージは、解析ソフトウェアで生成された統計から得られ、ゲート化された血小板集団のTF^ポジット象限内に該当するCD41^ポジスイベントの割合として報告されます。
6. ファイル名識別、試薬バッチ数、固定から取得までの間隔、出荷温度、イベント数、外れ値蛍光分布の集中型品質管理を行います。局所的な取り扱い、輸送、固定タイミング、取得設定の記録された逸脱を示すファイルはフラグ付けし、中央で確認し、研究ごとの逸脱管理計画に従い除外または再確認すべきです。

図4:TF^ポジット・プラセット分析のための逐次ゲーティング戦略。 代表的な分析ワークフローは、.fcsファイルを読み込みした後の血小板集団の同定を示しています。(A-B)血小板集団の正しいゲートを確認する点点図。(C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488擬似カラープロットはスペクトルスピルローブの評価に使用されました。(D) 血小板ゲート内のFSC-A/FSC-Hプロットを用いて、ダブルレットを除外しシングレットを定義する。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:データ解析用のテンプレート。 (A)染色されていない対照群の代表的なドットプロットを用いて、ベースラインの自己蛍光と象限位置を定義しました。(B) TF単一染色サンプル;(C) CD41 単一染色サンプルで象限の位置を定義する。(D) TF/CD41 二重染色サンプルで、TF^ポジス血小板分析に使用。数値は代表サンプルにおける^TFポジスト血小板の割合を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

このワークフローは、異種な技術インフラを持つセンターが多施設研究に参加し、TF^ポスプラセットの定量化を目的に設計されました。 図1 は、全血フローサイトメトリーによって循環中のTF^ポスプラテレットを測定することを目的とした多施設研究を支援するための組織ワークフロー図を示しています。参加センターの技術資源に応じて異なるサンプル準備手順が実施されます。具体的には、(i) 臨床ユニットにフローサイトメトリー施設や訓練を受けた人員がない場合、全血サンプルは採取直後に固定され、その後コアラボラトリーに送られ、集中染色、取得、分析が行われます。(ii) あるいは、フローサイトメトリー設備を備えたセンターが、局所的に染色および取得を行う場合もあります。この場合、データ取得はコアラボラトリーによって定義された統一されたワークフローに従って行われます。機器モデルがコアラボラトリーで使用されているものと一致した場合、取得はコアラボラトリーが提供する標準化されたテンプレートを用いて行われます。異なる機器モデルを使用する場合、調和はテンプレート転送(コアラボラトリーで機器のアライメントが利用可能な場合)や、サンプル採取前のビーズベースの校正手順によって達成されます。その後、標準化されたワークフローに従ってサンプルを取得・分析することができます。

以下の代表的な結果は、ワークフローの実現可能性やキー調和ステップを示すためのものであり、正式な多施設アッセイ検証を提供するものではありません。信頼できるTF検出を確保するため、染色戦略はまずスペクトル適合性と信号安定性を評価しました。血小板は抗CD41 PerCP-Cy5.5を用いて同定され、TF検出はStar Fluor 488に結合した抗TFモノクローナル抗体に依存していました。検出チャネル間の蛍光スピルオーバーの有無を確認するために単一染色対照群が用いられました。 図6Aに示すように、CD41 PerCP-Cy5.5単一染色サンプルではStar Fluor 488チャネルで検出可能な信号は発生しませんでした。一貫して、二重染色サンプルで測定された^TFポスプレートレットの割合は、TF単一染色サンプルと同等でした(図6B)。

図6:染色特異性の検証。 (A) 単一染色の抗CD41 PerCP-Cy5.5サンプルをPerCP-Cy5.5/Star Fluor 488ドットプロットで解析し、シグナル特異性を検証。(B) TF単一染色サンプルとTF/CD41二重染色サンプルで測定されたTF^ポジス血小板の割合は、個別ペア測定(ドット)および平均±標準差(n=18人の独立被験者)として示されます。データはWilcoxonマッチペア符号順位検定で解析されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。提案されたアッセイの分析感度は、n=200人の健康被験者のサンプルで評価されました。生物学的に空白サンプルを用いた場合、計算された空白の限界(LoB)は0.39%、検出限界(LoD)は0.77%、定量限界(LoQ)は1.12%であり、CVに関連する最低レベル≤20%と定義されました。ゲーティング戦略のオペレーター間再現性は、事前定義された分析テンプレートを用いて6人のオペレーターが分析した40の独立したサンプルで評価され、ICCは0.985(95%信頼区間:0.978-0.990)となりました。

全血固定後のTF検出の安定性は、固定サンプルを縦方向に染色することで評価されました。固定日(D0)に染色されたベースラインサンプルと比較して、固定後最大4日間(D3-D4)のTF^ポス血小板レベルは安定し、D3-D4ではD0レベルと比べて約22%(TF^ポジストレートの相対パーセンテージ77.8%±7.2%)の非有意な減少のみを示しました。染色がD5-D6で行われた場合、^{TFポジスト}血小板の検出率は53.8%±20.7%に有意に低下しました(^{TFポジスト}血小板の相対パーセンテージ; p< 0.0001; 図7)。これらの結果は、固定サンプルは固定後4日以内に信頼性が高く、信号損失はわずかで済むことを示しています。

図7:サンプル固定後の時間経過分析。 固定後異なる時点で測定されたTF^ポス血小板の定量は、x軸に示されています:D0 = 採血日;D1 = 1日目;D2 = 2日目;D3-4 = 3日目または4日目;D5-6 = 5日目か6日目。データはD0(n=7〜10人の健康被験者、指定された固定後時刻間を評価)と比較してSDの相対パーセンテージの平均±で表現されています。データはAnovaを用いて分析され、その後ダネットの多重比較検定が行われました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

調和された取得ワークフローの性能は、その後、異なるフローサイトメトリープラットフォームで評価されました。テンプレートベースの調和は、FACSLyricおよびMACSQuant機器を基準サイトメーターとして初めて評価されました。外部施設に設置された同モデルの追加機器が試験プラットフォームとして使用されました。安静血小板を含む全血サンプルは、標準化された取得テンプレートを用いて参照機器および検査機器の両方で採取されました。 図8A、Bに示すように、参照サイトメーターとテストサイトメーターで類似のTF^ポジスト血小板パーセンテージが得られ、共有型の再現性が確認されました。

図8:共有取得テンプレートを用いた機器間再現性。 参照およびFACSLyric(A)またはMACSQuant(B)検査で取得したn=6人の健康被験者から全血中測定されたTF^ポスチュレートのパーセンテージ。これらは、複数の機器に共通の取得テンプレートを適用して取得したものである。データは個別の決定(ドット)と平均±SDで表現されます。データはペアt検定で解析されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

最後に、ビーズベースのハーモナイゼーションが評価され、異なる構成の楽器を整列させました。基準機器としてサイトメーターAを使用し、試験機器としてFACSymphonyを使用しました。アライメントは、FACSymphonyの488nm検出器電圧を調整し、ビーズの蛍光強度があらかじめ定められたターゲット範囲内に収まるまで調整することで、6ピークのレインボーキャリブレーションビーズを用いて行われました。アライメント前後のビーズピーク分布を示すヒストグラムプロファイルは 図9Aに示されています。その後、校正前後に検査機器で全血サンプルを採取しました。調和以前は、TF^ポスプレートの割合は両プラットフォーム間で異なっていました。ビーズベースのアラインメントの結果、値は参照サイトメーター(図9B)で得られたものとほぼ一致し、クロスプラットフォーム調和と再現可能なTF定量が成功したことが示されました。

図9:ビーズを使った楽器の調和。 (A) 機器アライメント前後(赤ピーク)および後(緑ピーク)取得された6ピークレインボーキャリブレーションビーズの代表的な蛍光ヒストグラム。(B)調和前後(前後)で検査機器で取得したn=6人の健康被験者から作成された安静サンプルのTF^ポプラス血小板の割合。比較のために参照機器で得られた測定値を示します。データはペアt検定で解析されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

このプロトコルは、多施設での実装に特化した全血フローサイトメトリー定量のためのステップバイステップワークフローを提供します。従来の血小板フローサイトメトリー分析に基づくワークフローに比べて、血液採取や全血固定からサンプル標識、サンプル採取前の機器調和、中央集権分析およびデータ品質管理に至るまで、分析プロセス全体を標準化できる点が主な方法論的利点です。これにより、血液サンプルを提供できれば、サンプル処理能力のないセンターでも多施設研究に参加できます。本稿のワークフローは、^{生理的条件下}で検出可能な表面関連TFを示す血小板の割合はごく一部であることを考慮し、最も関連性の高い中心間変動の実用的な要因に対処^{しています。}これらの情報源には、局所的なサンプル取り扱いの違い、フローサイトメトリー施設へのアクセス、機器構成、オペレーター依存のデータ解析が含まれます。

これらの問題を克服するために、全血を採取直後に固定し、 生体内 血小板の表現型を安定させ、即時の標識付けやサンプル採取の必要を回避します。代表的な結果は、この固定サンプル方式により、検証された固定後区間内で集中処理を遅延させることが可能であることを示しています。これにより、現地にフローサイトメトリー施設がないセンターへの研究参加の可能性が拡大しつつ、一貫した事前分析ワークフローを維持します。プロトコルの第二の利点は、単純な2色パネルを用いた簡易化された直接染色戦略を採用し、手順の複雑さを軽減することです。

パネルでは、TFの触媒部位を認識し、因子VII結合と競合する、よく特徴づけられた抗TFモノクローナル抗体クローンHTF1を使用し、これにより血小板^14、16、17でもTF検出において最も信頼性の高い試薬の一つとなっています。抗体はFITCに似ているが信号安定性が向上した明るい光安定性フルオクロムであるStar Fluor 488と共役しました。重要なのは、488 nmの励起により、ほぼすべての従来型フローサイトメーター(エントリーレベルの機器を含む)で利用可能なブルーレーザー構成によるサンプル検出が可能であることです。このエピトープ特異性と単純な蛍光色素検出の組み合わせにより、複数の部位にわたる分析感度とスケーラビリティが向上します。このアッセイでは、低周波集団における閾値配置において、染色されていないFMO対照群を用いて陽性閾値を定義し、アイソタイプ対照よりも優れた選択肢として定義しました¹⁸。

異なるフローサイトメトリーの使用は、多中心フローサイトメトリー研究における変動の原因となる可能性があります19,20,21。以前は事前分析取り扱い、染色セットアップ、局所機器最適化¹⁷に関するアドバイスを提供しました。しかし、これらの対策は異なるプラットフォーム間で一貫した蛍光信号を保証するものではありません。現在のワークフローは、中央集権分析と将来の取得調和を組み合わせることでこの問題に対応しています。同一のサイトメーターがある場合には共有取得テンプレートを使用でき、異なるプラットフォームを含める必要がある場合はビーズベースのアラインメントを適用できます。この二重戦略は、異質な局所取得後に中央集権的解析のみに依存するマルチセンター解析モデルに比べて、データ解析のばらつきを最初から減らし、サイト間でのより再現性の高いゲート適用を支援することで実用的な利点を提供します。

ワークフローの汎用性は過大評価されるべきではありません。プロトコルは、指定された全血固定条件、抗TF-Star Fluor 488およびanti-CD41 PerCP-Cy5.5試薬の組み合わせ、調和手法、限られたフローサイトメーター構成を用いて検証されました。他のアンチTFクローン、フルオロクロムの組み合わせ、固定タイミング、固定濃度、または光学系が大きく異なるフローサイトメーターを使用する場合は、ワークフローの解析性能を確認すべきです。全体として、プロトコルの障害は推奨されるあらかじめ定義された逸脱ルールで管理されるべきです。偏差の重症度に応じて、データは研究ごとの偏差計画に従ってフラグ付け、重複、または除外されることがあります。これらの枠組みの中で、本プロトコルはTF^ポジストレート分析の多施設実装のための運用的枠組みとして検討されるべきです。国際血栓止血学会による国際標準化研究において、より広範な実験室間性能評価、出荷検証、アッセイの再現性を含む正式な分析検証が現在取り組んでいます。正確なTF^ポジスト血小板定量の臨床的関連性は、冠動脈疾患における予後価値を示す証拠によって強調されており、TF^ポスプラットのレベルが4%を超えると5年追跡時の長期心血管死亡率を独立して予測する¹⁶。したがって、信頼性の高い多施設測定は、TF^ポジプラカードをバイオマーカーとして検証し、その応用を将来の臨床試験や実際のレジストリーに拡大するために不可欠です。将来的には自動正規化アルゴリズムやオートゲーティング戦略の導入により、オペレーターバイアスをさらに減らし、分散解析を支援しつつ、サイト間の比較可能性を維持する可能性があります^22,23。

結論として、この調和されたワークフローは、多中心施設の環境で全血フローサイトメトリーによるTF^ポスプラテレットの定量化において、実用的かつ再現性の高いアプローチを提供します。標準化された前分析手順、簡略化されたサンプル処理、機器調和戦略を組み合わせることで、このプロトコルはTF^ポジス血小板測定の信頼性の高いクロスサイト比較を可能にします。ここで述べた原則は、血栓リスクのバイオマーカーとしてのTF^ポスプレートの評価を支持するだけでなく、翻訳的および臨床研究の応用における血小板フローサイトメトリーの標準化に向けた広範な取り組みにも寄与する可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1X PBS w/o カルシウムおよびマグネシウム	Gibco	10010-015	抗体およびサンプル希釈用
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (クローン HIP8)	BD	333148	ヒトCD41aモノクローナル抗体で、血小板集団マーカーとして使用されます。コア実験室から提供されるべきです
Anti-TF Star Fluor 488  (クローン HTF1)	Cyanagen	CR304	ヒト組織因子（CD142）モノクローナル抗体。コア実験室から提供されるべきです
BD FACSLyric フローサイトメーター	BD	非カタログアイテム	本文では、フローサイトメーターB
BD FACSuite ソフトウェア v1.6	BD	非カタログアイテム	本文では、ソフトウェアB
バタフライ針 G19	PIKDARE	02044019030010	採血用
CytExpert ソフトウェア	Beckman Coulter	非カタログアイテム	本文では、ソフトウェアA
CytoFLEX S フローサイトメーター	Beckman Coulter	非カタログアイテム	本文では、フローサイトメーターA
MACSQuant フローサイトメーター	Miltenyi Biotec	非カタログアイテム	本文では、フローサイトメーターC
MACSQuantify ソフトウェア v3.1	Miltenyi Biotec	非カタログアイテム	本文では、ソフトウェアC
Eppendorf チューブ 2 mL	Eppendorf	120094	全血固定用
パラホルムアルデヒド	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	サンプル固定用
ピペットチップ 10 µL	Gilson	F161630	血液サンプル移動用
ピペットチップ 1000 µL	Gilson	F161670	血液サンプル移動用
ピペットチップ 200 µL	Gilson	F161930	血液サンプル移動用
ポリスチレン丸底チューブ 5 mL	Corning	352052	フローサイトメーター取得用
Rainbow キャリブレーションビーズ（6ピーク）	Spherotech (BD)	556286	フローサイトメーターの調和用
Vacutainer EDTA	BD	368857	最初の3mlの血液を収集するため
Vacutainer 複数サンプルルアーアダプター	BD	367300	採血用
Vacutainer 一回用ホルダー	BD	364815	採血用
Vacutainer with 0,129 M クエン酸ナトリウム	BD	363079	血液収集用