CaMPARIを用いた ショウジョウバエ 幼虫の中枢神経系における個々のシナプス前後パートナーの機能的特徴付け

Summary

このプロトコルは、遺伝的にコードされたツールを用いて、ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫の中枢神経系における定義された神経パートナー間の生体内での機能的シナプス活動を評価します。CsChrimson媒介によるシナプス前感覚ニューロンcIVdaの光遺伝的刺激は、シナプス後盆地4中間ニューロンにおけるCaMPARIのカルシウム依存性光変換を誘導します。

Abstract

コネクトーム研究は、さまざまな種の神経系におけるシナプス結合の理解を大きく拡大しました。電子顕微鏡(EM)を用いたシナプスパートナーの特徴付けは詳細な解剖学的情報を提供しますが、神経ネットワークの機能的側面には補完的なアプローチが必要です。ショ ウジョウバエ に関する最近の研究では、幼虫の完全なコネクトームだけでなく、オス・メスの成虫の中枢神経系だけでなく、幼虫の侵害受容ネットワークなど特定の行動を調節する神経ネットワークの細胞構成要素も明らかになりました。第3齢幼虫期までに、クラスIV樹状化(cIVda)多樹状感覚ニューロン(侵害受容器)が盆地4中間ニューロンとのほとんどのシナプス接触を確立します。これらの解剖学的接続の機能的関連性を評価するため、遺伝的にコードされたカルシウム指示薬CaMPARI(カルシウム調節光活性化型比率積分器)が、未解離の3齢幼虫に用いられ、cIVdaニューロンとBasin-4中間ニューロン間のシナプス連結性を評価するために活動依存性の報告体として用いられました。CaMPARIは、細胞内カルシウムレベルの上昇に応じて放射スペクトルが変化する比率蛍光指標です。ベースライン条件下では、CaMPARIは緑色の蛍光を発します。高カルシウム濃度の場所や光変換光(~400 nm)に照射されると、不可逆的に赤色蛍光に切り替わります。シナプス後ニューロンへのカルシウム流入はシナプス活性化の特徴であるため、CaMPARI光変換は機能的シナプスシグナル伝達の読み取りを提供します。赤方偏移チャネルロドプシンCsChrimsonと同時進行のCaMPARI光変換を組み合わせて、3齢幼虫を顕微鏡スライド上で固定し、cIVda侵害受容器の光遺伝的活性化を図る段階的な方法が提示されています。盆地4ニューロンにおけるカルシウム依存性の光変換は、内部の動きや焦点面の変化にもかかわらず、これらの細胞間のシナプス結合性の機能的証拠を提供します。これは、未解体で未解離の ショウジョウバエ 幼虫におけるCaMPARIとシナプス前オプトジェネティック刺激の組み合わせの原理実証となります。

Introduction

中枢神経系(CNS)における正確なシナプスパートナーを特定することで、神経系の発達過程におけるシナプス接続の形成と精緻化を追跡できます。そのため、Caenorhabditis elegans ^1,2やDrosophila melanogaster ^3,4,5のような強力な遺伝モデル生物の完全なコネクトームだけでなく、マウスの一次視覚野^{6や人間の}側頭野7を含む複雑な哺乳類脳のミリメートルスケールEM体積の再構築に注力しています.これらの研究は、解剖学レベルでシナプス結合の組織原理に関する独自の洞察を提供します。しかし、シナプスパートナーの機能的特徴付けは神経細胞の結合性に関する補完的な洞察を提供し、解剖学的発見の検証に必要とされています。

ショウジョウバエは、幼虫^{3および雌4}、^雄5の成体の中枢神経系の完全なコネクトームが利用可能であることに加え、予測可能な行動を調節するよく特徴づけられた神経回路(^8,9,10)など、神経連結性の研究に多くの利点を提供します。幼生の侵害受容ネットワークは、精密なシナプス結合性を研究するのに適した回路の一つ^です。このネットワークのEM再構築により、侵害受容刺激を処理するために必要な詳細なシナプス連携が明らかになり、ノシフェンシブローリングとして知られる特徴的な逃避行動^12,13が示されています。

このネットワーク内で、クラスIV樹状樹状化(cIVda)ニューロン¹⁴は痛みの検出に関与する主要な感覚侵害受容体として機能します。11,12,13,15,16。細胞体と樹状突起は体壁の周辺に位置し、軸索は幼虫腹側神経索(VNC)に投射しています¹⁵。中枢神経系内では、cIVdaニューロンは軸索末端を典型的なパターンでアーボリ化し、盆4中間ニューロン^{11、12、13、17}とのシナプス接触の大部分を形成します。この定義されたシナプス関係により、cIVdaニューロンとBasin-4中間ニューロンが生体内でのシナプス結合性の機能的評価に理想的なペアであることが確立されます。個別に特定されたシナプスパートナー間の機能的つながりを解析する方法の開発は、特にステレオタイプ化された神経回路を持つ遺伝的に扱いやすいシステムにおけるシナプス発達と精緻化のメカニズムの調査を促進するでしょう。

CaMPARI(カルシウム変調光活性化型比率積分器)¹⁸は、細胞内カルシウムレベルの上昇に応じて発光スペクトルが変化する遺伝子的に符号化された比率蛍光指標です。ベースライン条件下では、CaMPARIは緑色の蛍光を発します。高カルシウム濃度の存在と光変換光(~400ナノメートル(nm))への曝露により、不可逆的に赤色蛍光に変換^{されます。}シナプス後ニューロンへのカルシウム流入はシナプス活性化の特徴であるため、CaMPARI光変換は機能的シナプスシグナル伝達の読み取り値を提供します^19,20。

CaMPARIに加え、遺伝子符号化カルシウム指示器(GECIs、GCaMPやRCAMP²¹など)や遺伝子符号化電圧指示器(GEVI)²² (アークライト²³、Ace2N-mNeon²⁴、VARNAM²⁵)などの可逆センサーを用いて神経活動を可視化できます。これらの高速で可逆的なセンサーは、一時的な活動をリアルタイムで監視するのに適していますが、 生体内 イメージング中に動きのアーティファクトに影響を受けやすいです。これに対し、CaMPARIの統合的かつ不可逆的な光変換特性により、定められた時間枠内で活動を捉えることができ、画像²⁰の撮影中に焦点面がずれても神経細胞の活性化を検出できます。さらに、CaMPARIフォトコンバージョンは紫光の強度を調整することで調整でき、シナプス強度の低下や閾値以下の入力を検出すること^{が可能です。}これらの特性により、マウス皮質²⁷、ゼブラフィッシュ脳²⁸、 C. elegans²⁹、成虫ショ ウジョウバエ²⁰の研究など、頭部固定や拘束なしに自由に動く動物の活動マッピングが可能になりました。

CaMPARI光変換と共焦点顕微鏡を用いたシナプス前光遺伝刺激を組み合わせて、未解離のショウジョウバエ幼虫を対象に機能的なシナプスパートナーを可視化するプロトコルが記述されています。このアプローチでは、CaMPARIを用いて、生きた第3齢幼虫のcIVdaニューロンの光遺伝的活性化後のベイスン4中間ニューロンにおけるシナプス後カルシウム流入を検出します。cIVdaニューロンは赤色光活性化のチャネルロドプシンCsChrimson^30,31を発現し、Basin-4インターニューロンはCaMPARIを発現します。赤色光への曝露は、時間的に制御された方法で侵害受容刺激を模倣し、侵害受容体を選択的に活性化します。^16,30。この戦略により、シナプス前活性化がシナプス後ニューロンにおけるカルシウム依存性CaMPARI光変換を誘導するかどうかを評価し、シナプス結合の機能的証拠を提供します。

CIVda–Basin-4の連結性解析において、CsChrimsonと組み合わせてCaMPARIを用いることを支持するいくつかの技術的利点があります。まず、cIVda樹状突起は幼虫の^体壁を完全かつ重なりのないタイル状に形成し、解剖による損傷による交絡作用なく、完全な感覚ニューロンの光遺伝的活性化を可能にします¹⁶。第二に、幼虫は顕微鏡スライド上で物理的に固定されていますが、内部の動きによって中枢神経の位置や焦点面が画像撮影時に頻繁に変化します。CaMPARIフォトコンバージョンはこのような運動アーティファクトに対する感度が低く、神経活動の安定した時間統合された読み取りを提供します。第三に、CaMPARIの統合的かつ調整可能な特性により、シナプスの強度や接触数が減少した初期発達段階などでさえシナプス活動を検出できるため、将来のシナプス形成と精緻化の研究を支持します。

Protocol

ショ ウジョウバエ を含むすべての実験的手技は、機関のガイドラインに従って実施されました。遺伝子型w;Basin4-LexA/CyO-TwGFP;ppk-GAL4/ppk-GAL4(RRID:^{BDSC_54899 12} およびRRID:^{BDSC_32079 16}の組換えから得られる)は、オプトジェネティックおよびCaMPARI発現の誘導に用いられました(w^-、UAS-IVS-CsChrimson.mVenus、LexAOp-CaMPARI2;Sp/Cyoは、それぞれシナプス前および後シナプスパートナーにおいてRRID:BDSC_81085と第2染色体マーカーの組換えによって得られました。このプロトコルで使用される研究ツールは 材料表に記載されています。

1. 幼虫の調製

1. 処女メスのUAS-CsChrimson、LexAop-CaMPARI間の遺伝交配を設置しました。BDSC_81085例えば、2つの二元系を含む2つの系統を持つフライ系統のオス(例えば、関心のあるシナプス前ニューロンがGAL4発現を駆動し、関心のシナプス後ニューロンがLexA^33,34を駆動する)からなるオス。
2. 標準的なコーンミール寒天培地35,36,37,38に0.5 mM全トランスレチナール(ATR)を補足したプラスチックバイアルに遺伝子交配をセットし、CsChrimson活性化^30,33。ATRなしの並列バイアルをATRなしの制御として準備してください。
   注: トウモロコシ粉の寒天培地を沸騰せずに溶かします。固まらずに冷ます。40 mM ATRストック溶液(メーカー指示に従って95%エタノールで希釈した粉末ATR)を準備し、培地中で0.5 mMに希釈して十分に混ぜます。
3. 光の照射を防ぐために、バイアル全体をアルミホイルで覆います。
   注:ATRは光に敏感な性質のため、常に暗闇の中で育てる環境を維持し、意図しない神経細胞の活性化を防ぐこと。CsChrimsonは赤色光(590〜680 nm)に最も感度が高いですが、他の可視光波長^31,39でも活性化されることがあります。
4. 25°Cで小瓶を培養し、幼虫を第3齢期まで育てます。

2. 幼虫の動けなくなる

1. 絵筆を使って第三齢幼虫を採取します。幼虫を0.1 M PBSを含む3ウェルのマイクロスポットプレートで洗浄し、栄養を除去します。
   注: 余分なPBSは除去しないでください。水分補給に役立ちます。
2. きれいなカバースリップ(18 × 18 mm)の各隅に少量のモデリングクレイを置きます。幼虫をカバースリップのPBSの一滴に浸し、腹側を下に向けさせます。
   注: 腹側神経索(VNC)の画像診断のために、幼虫を背側に取り付け、腹面がカバースリップに接触するようにします。この向きにより、VNC内のベイスン4インターニューロンがカバースリップを通じて対物レンズに向き合うことができます。
3. 幼虫が入ったカバースリップの上にきれいな顕微鏡スライドを置きます。
4. カバースリップは、角に追加のモデリングクレイを塗って固定します。幼虫の破裂やカバースリップを避けつつ、幼虫を動けなくする十分な圧力をかけてください。

3. 刺激、フォトコンバージョン、イメージングワークフロー

1. CaMPARIを発現するシナプス後ニューロンのベースラインzスタックを、緑色(488 nm、レーザー出力0.8%)と赤色(~561 nm、0.8%レーザー出力)チャネルを同時に使用して取得します。Zステップ1μm、解像度256×256ピクセル解像度、ライン平均2、双方向走査、40×/1.2対焦点顕微鏡でスキャン速度9を使用します。すべての撮影は暗い環境で行ってください。実験全体を通して同じZスタックパラメータを維持してください。
   注: 幼虫VNCでは定型的な位置に明るい緑色の細胞体があり、ベースラインでは赤色蛍光は検出されません。
2. 幼虫を30秒間連続刺激し、同時光変換光(405 nm、レーザー出力0.5%)と光発生刺激光(594 nm、レーザー出力0.8%)を用います。
3. 赤(~561 nm)および緑(488 nm)チャネルの両方で 、ステップ3.1 と同じパラメータを用いたポスト刺激Zスタックを取得します。VNC細胞体は基準値と似た位置にあると予想されます。ATR餌を与えられた幼虫の刺激時に活性化されたニューロンで赤色CaMPARI蛍光を検出し、非ATR対照群では光変換が最小限であること。
   注:ワークフローとパラメータは図1にまとめられています。

図1:刺激、光変換(PC)、およびイメージングのワークフロー。 3段階の連続画像診断フェーズを用いて、ベイスン4ニューロンのカルシウム活性を評価しました。ベースライン段階では、488nmおよび561nmレーザーを用いて、刺激前に緑色および赤色のCaMPARI蛍光を捕捉するためにzスタックを取得しました。刺激段階では、cIVdaニューロンがCsChrimson(594 nm)を通じて光遺伝学的に活性化され、同時に405 nmの光変換で活性化されたCaMPARIが緑色蛍光から赤色蛍光へと変換されました。この30年代の期間中は画像検査は行われませんでした。刺激後段階では、ベースライン時と同じレーザー設定でzスタックを再取得し、Basin-4細胞体内の光変換赤色信号を検出しました。すべてのzスタックは256×256ピクセルで取得され、Zステップ1μm、ライン平均2、暗闇条件下で40×/1.2 NA対焦点鏡を備えた共焦点顕微鏡で取得されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 画像解析

1. バイオフォーマットを有効にしてフィジー(RRID:SCR_002285)でzスタック画像を開きます。スタック表示をハイパースタックに設定し、カラーモードをコンポジットに設定し、オートスケールを有効にしてください。Z平面をスクロールして最適な焦点の良い平面を選びましょう。選択した平面を複製する(画像→複製;チャンネル数:1–2;選択したZ平面)を選んだ。
2. 赤と緑のチャンネルを分割(画像→カラー→分割チャンネル)。
   注: 画像→で明るさとコントラストを調整 → 明るさ/コントラスト→ 両チャンネルの自動調整。
3. 2チャンネルから背景を差し引く(プロセス→背景を差し引く)。50ピクセルのローリングボール半径を使って。
4. 測定値を(分析→セット測定)を設定し、面積、平均グレー値、積分密度(IntDen)、標準偏差、最小・最大グレー値を含めるようにしてください。
5. Freehandツールを使って、緑のチャンネル内の各セルの周囲に興味領域(ROI)を描画します。ROIマネージャーにROIを追加して測定してください。赤いチャンネルにも同じROIを適用して測定します。
6. 幼虫や細胞の識別子を含むすべての測定値をスプレッドシートに記録してください。
   注: 刺激前後の画像の両方で測定を行います。
7. 各細胞ごとに(R/G)_前後 の_赤 色蛍光比を積分密度値(Integrated Density)値を用いて計算します。幼虫ごとの平均細胞レベル。
   注: 統合密度(面積×平均)は、異なるサイズのセル間での比較を可能にします。
8. Δ(R/G)は幼虫平均値を用いて(R/G)_後 − (R/G)_前 として計算します。正のΔ(R/G)値を、光変換時のシナプス後カルシウム活性の増加と解釈します。
   注: 負のΔ(R/G)値はノイズや背景の非対称性から生じることがあります。負の値を0に設定してください。このデータセットでは、1隻の幼虫が負の値(−0.008)を示し、0に設定されていました。

Results

このプロトコルに従い、CaMPARIを用いて未解離の D. melanogaster 第3齢幼虫で、cIVdaニューロンとBasin-4中間ニューロン間の機能的結合性が評価されました(図2)。光変換(PC)光やオプトジェネティック活性化による刺激が行われる前、Basin-4の中間ニューロンは細胞質のCaMPARI発現により緑色蛍光を示していました(図2A)。基底条件下では赤色蛍光は検出されず(図2B)、刺激前の光変換の欠如が確認されました。

PC光と光遺伝学刺激を同時に照射すると、CaMPARIは緑色蛍光から赤色蛍光へと変換されました(図2C、D)。光変換がCsChrimson介在の神経細胞活動によって特異的に駆動されていることを検証するため、同じ遺伝的背景(同じ親交配)の幼生を全トランスレチナール(ATR)なしで育て上げてネガティブコントロールを実施しました。ATRはCsChrimson機能の重要な補因子であるため、その欠如により594 nm刺激光に曝露されてもオプシンは機能しなくなります。この対照は、405 nm PC^{光自体による}侵害受容体の活性化の可能性にも対処しており、ATRフリー幼生も同じ刺激プロトコル(PC^光曝露を含む)を受けました。

ATRフリーの対照幼虫では赤色CaMPARI蛍光の低レベルが観察され、PC光単独による部分光変換と一致しましたが、Δ(R/G)の定量化により実験動物では対照群に比べて有意に高い値が示されました(図2E)。この増加は、実験的な幼虫における光変換の強化がCsChrimson駆動のニューロン活動に依存していることを示しています。

画像解析はプロトコルに記載された通りフィジー(RRID:SCR_002285)で実施されました。実験群とATRフリー対照群間のΔ(R/G)値の統計比較は、正規分布とほぼ等しい標準偏差が確認された後、GraphPad(RRID:SCR_002798)で非ペアt検定を用いて実施されました。

図2。ベイスン4中間ニューロンにおけるCaMPARI光変換は、生体内でのcIVda感覚ニューロンの光遺伝刺激後の機能的シナプス活動を明らかにします。(A) 白い矢印は、幼虫腹側神経索(VNC)内のベイスン4インターニューロンの細胞体を示し、緑色のCaMPARI蛍光を発現することを示す。 (b) 光遺伝学刺激前および光変換光照射前の点線で区切られたベイスン4細胞における赤色CaMPARI蛍光の欠如。興味領域(ROI)は、フィジーのフリーハンド選択ツールを用いて緑色チャネルの緑色蛍光細胞体周辺に手動で定義し、赤色チャネルに適用しました。 (C) 同時光遺伝刺激と光変換光照射後のベイスン4中間ニューロンにおける赤色および(D)緑色のCaMPARI蛍光。 (E) 各データポイントは、1〜4個体あたり1〜4個の細胞から算出された幼虫あたりの平均Δ(R/G)(総サンプル数:対照群8個、うち23個、実験群9個の幼虫、うち19個)、統計解析により、光遺伝学的刺激および光変換後のΔ(R/G)が、ATRなし(対照)状態のベースラインと比較して有意に増加していることが示されています。スケールバー:10.2 μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧いただけます。

Discussion

ここで述べるプロトコルにより、未解の D. melanogaster 幼虫における定義されたシナプスパートナー間のシナプス結合性の質的および定量的評価が可能となります。このアプローチは、cIVda感覚ニューロンのオプトジェネティック刺激と、CaMPARIを用いた活性化されたシナプス後盆地4中間ニューロンの可視化を組み合わせて、未解離幼生の中枢神経系(CNS)におけるシナプス活動を監視します。これまでのD . melanogaster におけるCaMPARIの応用は主に成虫期²⁰ 、または物理的なシナプス前刺激(例:侵害受容体熱刺激)を必要としたものに焦点が当てられました¹⁷。本手法はCaMPARIの使用を早期発生段階まで拡張し、光遺伝学的シナプス前刺激とCaMPARIに基づくシナプス後検出を組み合わせることでシナプス活動の機能評価戦略を導入します。オプトジェネティック活性化はシナプス前入力の正確な時間的制御を行い、制御された刺激とその後のシナプス後CaMPARI応答のモニタリングを可能にします。

これらの利点にもかかわらず、このアプローチの実装には実験設計、適切な管理、技術的制約の慎重な検討が必要です。全トランスレチナール(ATR)を持たない幼虫(CsChrimson活性化^を妨げる)を欠いた幼虫や、CsChrimson発現を欠く幼虫を含む陰性対照群が、シナプス前光遺伝刺激なしにCaMPARI光変換が存在しないことを確認するために必要である。さらに、追加の要素も考慮する必要があります。自発的または内因性のシナプス後活動は、光変換(PC)光曝露と同時期に現れることがあり、シナプス前非依存のCaMPARIの緑から赤への変換をもたらします。CsChrimsonは赤色光(590–680 nm)による活性化に最適化されていますが、より短い波長に対する^感度は保持されており、刺激前に使用されたイメージングレーザーは意図しないシナプス前活性化を引き起こすことがあります。さらに、シナプス後ニューロンは複数の前シナプスパートナーからの入力を受けているため、非ターゲット入力からの活性化がPC光曝光と一致し、制御された光遺伝的刺激に依存しないCaMPARI光変換を引き起こす可能性があります。

例えば、盆4中間ニューロンはcIVdaニューロンだけでなく、クラスIII多樹状感覚ニューロン(cIIIda)や脊索神経(Ch)ニューロンからも、侵害受容回路11,12,13,17の一部としてシナプス入力を受けます。したがって、これらの中間ニューロンは、カバースリップからの圧力による機械感覚刺激を含む代替の興奮性入力によって活性化されることがあります。この要因はここで述べた実験構成に特有ですが、特にATRを欠く対照条件下で、間接的なネットワーク駆動または光遺伝学的誘導でないCaMPARI光変換を考慮する重要性を強調しています。

非特異的なカルシウム流入およびそれに伴う光変換をさらに制御するため、幼虫は2つのグループに分けられます。1つはPC光曝露のみのグループ、もう1つはPC光とオプトジェネティックを組み合わせて刺激し、各条件ごとに赤と緑のZスタックを取得してグループ間の直接比較を可能にします。PCのみ条件下で得られた蛍光強度は、複合刺激後に測定したものから差し引くことができます。対照条件下(ATRおよびPCのみ刺激なし)で観察された光変換レベルは、確率的な内因性活動およびネットワーク駆動の入力によるシナプス後活性化の推定値を提供します。

記載された実験条件下で、cIVdaニューロンの光遺伝的刺激とBasin-4中間ニューロンにおけるCaMPARI光変換の組み合わせは、正のΔ(R/G)を示し、これらシナプス前後のパートナー間のシナプス活動を示しました。このプロトコルは、 生体内 で機能的なシナプス関係を調査するための枠組みを提供し、 ショウジョウバエの他の神経回路にも適応可能です。シナプス後ニューロンにおける標的シナプス前活性化や活動依存性検出を可能にすることで、コネクトームデータセットで予測されるシナプス接続の検証を支援し、発生中の機能的結合性の研究を促進します。したがって、遺伝的に扱いやすい ショウジョウバエ の神経系における神経回路機能を解析するための多用途な手法を示しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ・オルドリッチ	P5368-10PAK	幼虫の水和と乗着に用いられる溶液中の化学物質
全トランスレチナール(ATR)	シグマ・オルドリッチ	R2500〜500mg	オプトジェネティックツールを活性化するために食品に添加された化学物質
共焦点顕微鏡	ZEISSとnbsp;	LSM900 コンフォーカル	共焦点顕微鏡、対物レンズ(40倍/1.2 NA)、光源/レーザー光源(405、488、561 nm)
カバースリップ(18x18mm)	VWR	48366-205	動物のイメージング用マウントに使われていました
エタノール(95%)	シグマ・オルドリッチ	E7023	粉末ATRの溶剤として使用
フィジー(ImageJ)	オープンソース	RRID:SCR_002285	画像解析に使用
プリズムバージョン 10.4.1	グラフパッド・ソフトウェア株式会社	リド:SCR_002798	統計解析に使用
顕微鏡スライド	VWR	48300-041	動物のイメージング用マウントに使われていました
モデリングクレイ	フリン・サイエンティフィック	FB0600	幼虫を挟んだ顕微鏡スライドのカバーガラスを挟むために使われます
ペイントブラシ	ジェネシー・サイエンティフィック	59-204	幼虫を場所間で移動させるために使われます
標準的なコーンミール寒天培地	ジェネシー・サイエンティフィック	66-123	また、似たような標準的なレシピや材料を使って調理することも可能です
標準的なショウジョウバエプラスチックバイアル(25mm x 95mmショウジョウバエ細量バイアル)	ジェネシー・サイエンティフィック	32-109	大きなバイアルやボトルも使用可能です
三井マイクロスポットプレート	電子顕微鏡科学	71561-01	個々の幼虫を分離・洗浄するためのプレート
ショウジョウバエ株(遺伝子型:w;Basin4-LexA/CyO-TwGFP;ppk-GAL4/ppk-GAL4)とnbsp;	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	RRID:BDSC_54899 &リッド:BDSC_32079	RRID:BDSC_54899とRRID:BDSC_32079の再結合によって得られたもの
ショウジョウバエ株(遺伝子型:w、UAS-IVS-CsChrimson.mVenus、LexAOp-CaMPARI2;Sp/CyO)	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	リッド:BDSC_81085	RRID:BDSC_81085と第二染色体マーカーの組換えによって得られた