ショ ウジョウバエ 脳における拡張支援ハイブリダイゼーション連鎖反応-smFISHと免疫組織化学

サマリー

本プロトコルは、ショ ウジョウバエ の脳におけるRNAおよびタンパク質発現の細胞型特異的定量解析のための拡張支援HCR-smFISHおよび免疫組織化学ワークフローを記述しており、ライトシート顕微鏡や共焦点顕微鏡による画像診断、核および細胞質転写産物の自動定量を含む。

要約

遺伝子発現の定量的かつ空間的に解析することは、細胞型特異的な分子プロファイルを評価する上で不可欠です。 ショウジョウバエ の視覚系では、広範な遺伝学的手法が、定義された神経集団におけるRNAおよびタンパク質レベルを直接評価する枠組みを開きます。ここでは、拡張支援型HCR-smFISH(ハイブリダイゼーション連鎖反応単一分子蛍光イン シチュ ハイブリダイゼーション)と免疫組織化学を組み合わせ、遺伝的に定義された視覚系神経細胞型における細胞型特異的分子プロファイル 定量解析を可能にするステップバイステッププロトコルを紹介します。このワークフローは、核局在または膜結合マーカーで標識された細胞に最適化されており、同じニューロン内で転写本とタンパク質レベルの測定が可能です。組織展開後、サンプルはライトシート顕微鏡を用いて迅速な体積取得を行い、標準的な逆さレーザー走査および回転円盤共焦点顕微鏡では代替のマウントおよびイメージングワークフローが実証されています。さらに、核および細胞質転写産物を区別する自動分割アルゴリズムを提供し、転写状態および細胞内RNA局在の解析を可能にします。実験パラメータや信号品質、組織の完全性、定量的性能に影響を与える一般的な落とし穴についての実践的な指針が提供されます。代表的な応用例としては、RNAやタンパク質レベルの変化を定量化することで細胞型特異的RNA干渉の検証が挙げられます。細胞型特異性を伴う統合的なRNAおよびタンパク質レベルの測定を可能にすることで、このアプローチは仮説駆動型の分子解析におけるスケーラブルな戦略を提供し、標的的文脈では単一細胞トランスクリプトミックアッセイの実用的な代替手段となります。このプロトコルは、完全な ショウジョウバエ の脳の解剖学的文脈を保持しつつ、細胞型特異的な分子摂動を検証する実用的なアプローチを提供します。

概要

ショウジョウバエのメラノガスター視覚システムは、神経分化^1,2、細胞型仕様^3,4、脳配線の分子論理^5,6,7など、発達神経科学の幅広い問いに取り組む強力なモデルとして機能しています.この進展は、細胞型特異的な遺伝子駆動系^8,9,10の大規模なコレクション、最近の包括的なコネクトミクス再構築10,11,12、そしてますます詳細な単一細胞トランスクリプトトム^13,14および多組ム¹⁵を含む、非常に豊富な実験ツールキットによって推進されていますデータセット。これらのリソースは、多様態的に神経細胞タイプを定義し、正確な遺伝子操作を可能にします。その結果、この分野は特定の遺伝子がニューロンの同一性、結合性、機能をどのように調節するかについて、ますます予測性の高い仮説を生み出せるようになりました。¹⁶..単細胞RNAシーケンシングは転写状態に関する強力な洞察を提供しますが、RNAの存在比が必ずしもタンパク質発現を予測するわけではありません。^多くの摂動実験は最終的に同じニューロン内でRNAとタンパク質の両方を直接的かつ定量的に測定する必要があります。

単一分子蛍光現場ハイブリダイゼーション(smFISH)^18,19は、解剖学的文脈を保持しつつ、細胞および細胞内分解能で転写本の存在比を定量的に測定することを可能にします。smFISHと拡張顕微鏡20,21,22の組み合わせにより、膨張可能なハイドロゲル内で組織を物理的に拡大することで、分子の混雑を減らし、光学アクセスを改善し、効果的な空間分解能を向上させることで、完全な脳への応用がさらに拡大されました。ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)に基づくシグナル増幅²³と組み合わせることで、拡張支援型smFISHは厚い神経組織全体にわたる離散的な転写産物の堅牢な検出を可能にし、ライトシート顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いた全脳イメージングを支援します。

ショウジョウバエの脳には、さまざまな実験的優先順位を反映したインシチュRNAイメージング手法が適用されています。拡張支援反復HCR-FISHにより、全脳空間分解RNA^検出が可能になりました。並行して、遺伝子標識ニューロンのRNA測定には非拡張の全マウントFISH手法が用いられており、初期遺伝子を中心としたHCRベースの活性マッピング^戦略や、膜結合遺伝子符号マーカーを用いた断片ベースの転写本計数ワークフロー26が含まれる。RNAscopeのような市販のプローブベースの手法は、免疫組織化学と組み合わせて標的細胞集団を特定するために、全脳での多重RNA検出をさらに可能にしました²⁷。これらの手法を合わせると、ハエの脳内で空間的に分解されたRNA解析が技術的に可能であることが示されています。しかし、仮説駆動型摂動実験は、既存の単一のワークフローでは完全には満たされない、より具体的な要件を課します。多くの方法は、多重性発見型転写体マッピング、活性状態プロファイリング、またはRNA単独の定量を優先し、免疫染色は通常、攪乱タンパク質のマッチング読み取りではなく細胞識別者として機能するか、遺伝細胞型割り当て²⁸がない場合に適用されます。さらに、日常的なアプリケーションは複数のイメージングプラットフォームとの互換性や自動化されたスケーラブルな分析パイプラインから恩恵を受けることができます。

ここでは、拡張補助HCR-smFISHと拡張前に実施された免疫組織化学を組み合わせたショ ウジョウバエ 視覚系の統合的ステップバイステップワークフローを紹介し、同じニューロン内で同じニューロン内のRNAとタンパク質レベルのペア測定を可能にします。以前開発したFlySegフレームワーク²⁹ を基に、核および細胞質の点を区別する核断片および転写本カウントのための自動定量パイプラインを提供し、全発現測定と転写状態感度解析の両方をサポートします。このプロトコルは、ライトシート顕微鏡と2つの共焦点システムの両方で実証され、代替のマウントおよびイメージングワークフローが用意されています。最後に、統合RNA–タンパク質の読み取り結果の有用性を代表的な摂動検証実験(すなわちRNAi媒介による定義ターゲットのノックダウン)で示し、信号品質、組織の完全性、定量的性能に影響を与えるパラメータや落とし穴に関する実践的な指針を提供します。

このプロトコルは一般的に、ショウジョウバエにおける全脳RNA検出のために先に記載された²⁴ EASI-FISHフレームワークを基盤とし、RNAアンカー、ハイドロゲル展開、HCRベースのシグナル増幅という核心原理を維持しています。本プロトコルは、拡張前に免疫組織化学を統合して同じニューロン内でRNAとタンパク質のマッチング測定を可能にし、ワークフロー全体で複数の処理・取り扱いステップを修正して堅牢性と再現性を向上させ、ライトシート顕微鏡および従来の逆焦点顕微鏡の両方で実用的なマウントおよびイメージング戦略を提供し、自動ソーマセグメンテーションと転写体定量を組み込むことで、この手法を拡張・洗練しています核および細胞質RNAプールの明確な分離が特徴です。

このワークフローは、遺伝的に特定されたニューロンの定義されたRNAおよびタンパク質の読み取り値を定量しつつ、解剖学的文脈を保持することを目的とした標的実験に最適です。特に、定義された遺伝子や少数の候補遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを測定したり、遺伝子型や発生段階を超えた発現を比較したり、核と細胞質の転写産物の局在化による転写状態の評価を目的とする場合、分子の摂動の検証に有用です。単細胞シーケンシング、空間トランスクリプトミクス、反復多重FISHアプローチの方が適している場合、偏りのない転写本発見や高プレックス全脳発現マッピングにはあまり適していません。

プロトコル

倫理声明

このプロトコルは ショウジョウバエ・メラノガスターを使用しています。脊椎動物や人間の被験者は使用されませんでした。したがって、施設動物ケア・利用委員会の承認は必要ありませんでした。

注意:RNaseクリーン技術を全て使用してください。手袋を着用し、表面や道具をRNase除染液で拭き、すべての溶液をRNaseフリーの水で準備してください。

図1。サンプル調製プロトコルのステップバイステップ ワークフロー(A) プロトコルの概略的なタイムライン(おおよその日ごとの進行と夜間のインキュベーションステップを示しています)。(B–J)脳の解離と固定から免疫組織化学、RNA/タンパク質架橋、ハイドロゲル埋め込み、消化、プローブハイブリダイゼーション、HCRシグナル増幅に至るまでの主要なサンプル準備ステップの概説。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. 脳解離、固定、免疫組織化学(1日目〜3日目)

注意:特に記載がない限り、すべての工程は寺崎スタイルのマルチウェルプレートで行ってください。インキュベーションや洗浄には1井戸あたり10μLを使用します。湿度を保ち、プレートの一角に湿らせた実験用ワイプを置きます。

注意:パラホルマルデヒドおよびグリオキサール固定剤は有毒または刺激性があります。換気フードで取り扱い、適切なPPEを着用してください。

1. 氷のように冷たいS2昆虫培地で脳を解剖します。脳を井戸に移し、1井戸あたり最大10頭の脳を移動させます(図1B–C)。
   注:ここに示した代表的な実験では、72個の生後蛹の脳が使用されました。
2. S2培地を1井戸あたり10μL固定液に置き換え、1回交換します。
3. Addax酸性フリーグリオキサールに5%(w/v)ショ糖を4°Cで一晩固定します(図1C)。
4. 脳×を室温で10 μL PBST(0.5% Triton X-100 in PBS)に10分間それぞれ10分間洗い流します。
   注意:Triton X-100は厄介者です。肌や目を合わせるのは避けましょう。
5. 脳を10μLの一次抗体溶液(PBST、 材料表に記載された希釈度で)で4°Cで24時間培養します(図1D)。
6. ×脳を4°Cの10μL PBSTで10分間洗い流します。 洗うたびに、インキュベーションの途中で溶液を一度交換してください(洗うと2回交換)。
7. 脳を10μLの二次抗体溶液(PBST、希釈濃度で材料 表に記載)で4°Cで24時間インキュベークします(図1D)。
   注意:サンプルを光から守ってください。
8. ×脳を4°Cの10μL PBSTで10分間洗い流します。 洗うたびに、インキュベーションの途中で溶液を一度交換してください(洗うと2回交換)。
   注意:一次抗体および二次抗体濃度は標準的な全量免疫組織化学濃度の2〜3倍に値します
   一時停止:脳を10μL 1×PBSで4°Cで最大96時間保存する。

2. RNAとタンパク質の共有結合固定(4日目)(図1E)

注意:RNA定着アルキル化剤およびAcXは有害(有毒・刺激性、一部は発がん性の疑いがあります)危険です。適切なPPEを着用して化学換気フードで溶液を準備・取り扱いしましょう。すべての廃棄物を有害化学廃棄物として回収してください。

1. 脳を20 mMのMOPSバッファー(pH 7.7)10 μLで37°Cで20分間インキュベークします。
2. アンカリング溶液は、49.5%(v/v)20 mM MOPS、49.5%(v/v)メルファランストック(2.5 mg·^mL-1 in DMSO)、1%(v/v)AcX ストック(10 mg·^mL-1 in DMSO)を混合して準備します。これにより、最終濃度は1.24 mg·^mL-1 メルファランおよび0.10 mg·^mL-1 AcXとなります。
3. MOPSを1井戸あたり7〜8μLのアンカリング溶液に置き換え、溶液を一度交換して、暗闇の中で37°Cで一晩インキュベーションします。
   注意:7〜8μLを使用して、オーバーフローやクロスウェル混合を最小限に抑えつつ、サンプル全体をカバーしてください。

3. ゲル化(脳をハイドロゲルに埋め込む)およびプロテイナーゼKの消化(5日目)

注意:アクリルモノマー、APS、TEMEDは刺激物/有毒です。PPE付きのハンドル;揮発性・発熱性成分をフュームフードに準備してください。

1. 0.5mm厚の接着剤シリコーンガスケットを、充填されていないガラス顕微鏡スライド(図1F、 左下)に取り付け、しっかりと押して完全に接触し密閉します。
2. チャンバーにポリLリシン溶液200μLを加え、表面を均等に塗り広げてコーティングし、室温で5分間培養し、ピペットで溶液を除去します。
3. ポリLリジンを完全に蒸発させ、表面が目に見える乾燥状態になるまで待ちます。
   注意:ポリLリジン蒸発は遅いです。信頼できる結果を得るために、チャンバーは事前に準備し、ホコリのない環境で一晩乾燥させます。または、使用当日に37°Cのインキュベーターで1時間≥乾燥させる方法もあります。
4. 脳2×を室温で10μL1×PBSでそれぞれ10分間洗浄します。
5. ゲルモノマー溶液を準備し、使用直前にモノマー溶液を4HT、TEMED、APS(メイクフレッシュ)と47:1:1:1の比率で混ぜて重合試薬を加えます。最終的なゲル化溶液には、1Mナトリウムアクリレート、14%アクリルアミド、0.1%ビスアクリルアミド、1×PBS、0.01%4HT、0.2%TEMED、0.2%APSが含まれています。
6. 一時的にボルテックスし、最終的なゲル化溶液を氷の上に保管してください。すぐに溶液を使いましょう。
7. 脳を10μLの冷ゲル化液に15分間氷で培養します。
8. 前平衡時に新しいカミソリの刃を使い、シリコーンガスケットの両側に狭いチャネルを1つずつ切り、充填時に空気が逃げられるようにしました(図1F、左上)
9. ピペットの先端を使って脳を準備済みのゲル化チャンバーに移し、常に各脳がゲル化溶液に浸かるようにします。
   注意:固定と平衡の後、脳は非常に粘着性が高くなり、プラスチック表面にすぐにくっつきやすいです。サンプルの損失を防ぐために、ワイドボアのピペットチップを使用するか、標準的なチップの端をトリミングして開口部を広げてください。
10. 表面のシリコンガスケット接着剤から保護ライナーを外し、空気の泡が閉じ込められないように清潔な1.5Hのガラスカバーをチャンバーに優しく貼ります。
11. 新たに作ったゲル化液200 μLをサイドチャネルの一つからゆっくりピペットでチャンバーに注入し、チャンバーが完全に満たされるまで続けます。
12. 密閉された容器を暗い容器に入れ、37°Cで2時間培養します。
    注意:水で湿らせた実験用ワイプを容器に入れてください。スライドが液体の水に直接触れないように注意してください。
13. RNaseフリー水に50 mMトリスHCl(pH 8.0)、500 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5%(v/v)トリトンX-100からなる消化バッファーを準備します。
14. 使用直前に、20 mg·^mL-1 のストックから1:100のプロテナーゼKを最終濃度0.2 mg·^mL-1に加えます。
    注意:プロテイナーゼKは刺激物であり、手袋を着用して取り扱うべきです。吸入や皮膚接触は避けてください。
15. カバースリップを外す前に、スライドを室温で5分間冷ます。ジェルをメスで直線的なカットで長方形に切ります。各脳を取り巻く過剰なゲルの体積を最小限に抑えてください(図1F、右上)。
16. トリミングした各ゲルを、1000μLの消化液を含む24ウェルプレートの個別ウェルに入れます。ゲルは完全に浸かるようにしてください。
17. プレートをパラフィルムで密封し、室温の軌道シェーカーで0.11 g で一晩培養します(図1G)。

4. DNase分解およびHCR-smFISHプローブハイブリダイゼーション(6日目)

1. 消化液は、ゲルに接触したり変形したりしないように、ウェルの端に設置したピペットで慎重に吸引してください。
2. 3×ゲルを500μL 1×PBSで15分間、室温で軌道シェーカーの0.11gで洗浄します。
   一時停止点:ゲルを500μL 1×PBSに4°Cで最大7日間浸して保存してから進行します。
3. QIAGENのRNaseフリーDNaseセット1:10をRDDバッファーに希釈し、1ゲルあたり500μLのDNase作動液を製製します。最終的な作業溶液には約0.27クニッツ単位・^μL-1が含まれています。
4. 500μLのDNase作動液に500μLのDNase作動液で2時間、穏やかなロッキングでインキュベートします(図1H)。
5. 4×ゲルを500μLのRNaseフリー1×PBSと室温で15分間洗浄します。
6. 500μLの予温プローブハイブリダイゼーションバッファーで、37°Cで30分間の平衡ゲル
7. 希釈したHCR smFISHプローブストック(1 μM;分子機器)1:300をプローブハイブリダイゼーションバッファーで、最終濃度~3.3 nMに変換します。渦巻きによる混合
8. 平衡バッファーを1ゲルあたり500μLのプローブミックスに置き換え、軌道シェーカーで0.11gの37°Cで一晩インキュベークします(図I)。
   注意:プローブのハイブリダイゼーションバッファーには有毒なホルマミドが含まれています。手袋を着用し、吸入を避けてください。

5. ハイブリダイゼーション連鎖反応(7日目)(図1J)

1. ウォッシュゲル3を500μLの予温プローブウォッシュバッファーとともに×37°Cで30分間、軌道シェーカーで0.11gで処理します。
   注意:プローブウォッシュバッファーには有毒なホルマミドが含まれています。手袋を着用し、吸入を避けてください。
2. 3×を500μL 1×PBSで30分間、室温の軌道シェーカーで0.11gで洗浄します。
3. ゲルを1 mL 1×PBSの中、室温の軌道シェーカーで0.11 gの液体で一晩置いてください。
   注:延長された一晩の洗浄は、オフターゲットプローブの結合や背景の点を減らし、信号対雑音比を改善します。同日処理の場合は、直接HCR増幅に進みます。
   一時停止点:ハイブリダイゼーション後の洗浄後、ゲルを1 mL 1× PBSの室温または4°Cで最大96時間保存してからHCR増幅を行います。
4. PBSを1井戸あたり500μL増幅バッファー(以前は室温に平衡)に置き換え、0.11gのオービタルシェーカーで室温で30分間キュベートします 。
5. 各プローブセットに対して、ヘアピンのh1とh2(3μMストック)を希釈します。分子機器)を用いて、1:100の増幅バッファー(最終濃度30 nM)で使用しています。1井あたり350μLの希釈ヘアピンミックスを準備します。
6. 熱希釈したヘアピン溶液をPCRチューブ内で95°Cで90秒間、サーマルサイクラーまたはヒートブロックで保存します。均一な加熱と温度平衡を確保するために、1本あたり100μLの総体積を使用しましょう。
   注意:HCRガイドラインでは、ヘアピンH1とH2を別々にスナップ加熱し、冷却後にのみ組み合わせることが一般的に推奨されています。または、取り扱いを簡素化する必要がある場合は、H1とH2をスナップヒーティング前に混合することを推奨しています。
7. ヘアピンを暗闇で10分間室温まで冷まし、動かさずに置いてください。
8. 増幅バッファーを取り除き、1ウェルあたり350μLのヘアピンミックスを加えます。
9. ゲルは室温、暗い軌道シェーカーの0.11gで2時間培養します。
10. ゲル3×を500μLで5×SSCTを室温で10分間、軌道シェーカー(0.11g)で洗浄します。
11. 増幅後にヘアピン溶液を回収し、光から守り、再利用のために-20°Cで保存してください。
12. ゲルを500μL 1×PBSに移し、室温で3×分洗浄します。
13. ゲルは500μL 1×PBSで4°Cで光から保護して保存します。
    一時停止点:増幅ゲルは画像検査の最大2週間まで最小限の信号損失で保存可能です。

6. 拡張サンプルの準備、マウント、イメージング(8日目)(図2)

1. DAPIを含む1×PBSに1:1000ゲルを、軌道シェーカーで0.11 gの4°Cで一晩インキュベートします。
2. 短い紫外線照射を使って、ジェル内の脳を視覚化します。サンプルの向きを調整し、余分なゲルを必要に応じてトリミングします。
   注意:サンプルの位置取りやマウント時にUV照明が使用されます。適切な目の保護具を着用してください。
3. 選択したイメージングプラットフォームに適した構成を用いて、1×PBSにDAPI(1:1000)を補足してサンプルをマウントします( 表1参照)。
4. 採取前に少なくとも1時間はサンプルを平衡させてください。
5. 拡張されたゲルを透視できる十分な作業距離のある水浸け物レンズを使いましょう。
6. ライトシート顕微鏡、レーザー走査共焦点顕微鏡、または回転円盤共焦点顕微鏡を用いた画像サンプル。本研究で用いられた代表的なプラットフォーム特有の搭載および取得パラメータは 表1にまとめられています。
   注:以下の画像検査により、プローブやHCRヘアピンは上記の通りDNase消化で除去可能です。その後、ゲルはプローブハイブリダイゼーションおよびHCR増幅の追加ラウンドを施すことができます。

プラットフォーム	サンプルの可視化、取り付け、位置特定	対物レンズ/検出器	代表的な取得設定
ツァイス・ライトシート7	短時間の紫外線照射を使って、ゲル内で脳の位置を視覚化してください。余分なゲルをトリミングし、各脳を検出目標に向けて配置します。1 × 1 cmのポリL-リジンコーティングされたカバースリップに5〜6個のゲルを置き、ゲルは外側を向きます(図2A)。カバースリップをLS7サンプルホルダーにUV硬化接着剤の少量滴で取り付けます。接着剤を塗る前にUVランプを消してください。LS7チャンバーにマウントし、ZEN Blackのライブビューで脳領域を特定します。	20×/1.0 NA 水没検知目標;2.5×光学ズーム(総倍率50×)。	Zステップ、2.5 ズーム×2×展開時に0.4 μm。ピボットスキャンが有効です。露出は全チャンネルで50msです。レーザー:5%で405 nm、2%で488 nm、8%で561 nm。放射:420–470 nm、505–545 nm、570–620 nm。
			(図2C、 左)
ニコン Ti2-E AXR NSPARC レーザー走査コンフォーカ	短い紫外線照射を使って、ジェル内の脳を視覚化します。脳が逆さまの対物に向くように、単一のゲルを向きます。1×PBS + DAPIを充填したガラス底イメージングディッシュに移します(図2B)。4×の目標で脳を特定し、20×の目標でROIを特定し、NISエレメントにX-Y位置を登録します。没入感を加え、登録されたROIを見直し、焦点を絞り込む。	40×長距離水浸物レンズ(ニコンCFI APO LWD 40×WI、1.15 NA Lambda S、0.61 mm);NSPARC検出器を超分解能モードで使用。	ガルバノメータースキャン、2048ピクセル×2048ピクセル、1.6 μs/ピクセル、8.0×ズーム。レーザー:2%で488nm、20%で640nm。放出波長:502–546 nmおよび666–732 nm。
			(図2C、 中央)
エビデント・サイエンティフィック IXplore IX85 / 横川 CSU-W1 回転円盤共焦点	逆焦点共焦点イメージングと同様に、脳が対物レンズを向くようにゲルを向き、1× PBS + DAPIを入れたガラス底のイメージング皿に入れます(図2B)。cellSensソフトウェアを用いてレーザー走査共焦点顕微鏡で記述された関心領域を特定します。	60×長距離水没物(オリンパスLUMFLN60XW LWD、1.10 NA、1.5 mmの作業距離);浜松ORCA-Fusion BT GenIIIカメラ(2304ピクセル×2304ピクセル;6.5 × 6.5 μmピクセルサイズ)。	75%出力で488 nm励起、露光200 ms;100%出力で640nm励起、露光800ms。放出:500–550 nmおよび665–705 nm。
			(右図2C)

表1:顕微鏡プラットフォームにおける代表的なマウント、サンプルの位置づけ、イメージングパラメータ。 試料のマウント戦略、局在手法、対物レンズ、取得パラメータのまとめ:ライトシートおよび共焦点顕微鏡プラットフォーム全体で使用されるもの。

7. RNAおよびタンパク質発現の定量解析

注意:分析ワークフローは実験目標に基づいて選択してください。これらのアプローチの比較は補足表1に示されています。

1. FlySegを用いた集団スケールの転写物質定量化。
   注:解析は^{FlySeg 29}パイプラインの更新版に基づいています。解析ワークフローの概観は図3A–Bに示されています
   1. PythonベースのパッケージであるFlySegをインストールし、以下を使ってConda環境を作成します。
      Conda Env Create -f environment.yml
   2. 分析前に環境を活性化する方法:
      コンダアクティベートFLYSEG
   3. 分析を始めるには:
      Python main.py --file >
      CZIやNPYファイルを含むサポート入力フォーマットを使用してください。
   4. 必要に応じて、オプションの引数を使って解析をカスタマイズできます。
      チャンネル数(--チャンネル数)
      核チャネル(--nuclei_chまたは--nuclei_wavelength)
      細胞質チャネル(--cytoplasm_chまたは--cytoplasm_wavelength)
      核検出パラメータ(--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      核膨張係数(--nuclei_dilation)
      FISH検出閾値(--fish_threshold_range)
      出力ディレクトリ(--output_dir)
      Napariによるビジュアライゼーション(--visualize)
   5. 以下を使って利用可能なすべてのオプションを表示します:
      Python main.py –ヘルプ
   6. 画像メタデータを以下でチェックする:
      パイソン main.py――metadata_only。
      ボクセルサイズ、チャンネル数、チャンネル識別を確認してください。
   7. データセットに適切に調整したパラメータを使って解析を行います。通常、チャネル数、核チャネル数、細胞質チャネル(利用可能な場合)、および核拡張係数を指定します。
      注意:望ましい核/細胞質境界に適した--nuclei_dilation値を設定してください。例として 図3C–D を参照してください。
   8. 処理ログを監視してください。 すべての出力は入力ファイルの名前が付けられたフォルダに保存されます。
   9. 下流解析のための主要な出力を特定します。以下を含みます:
      1. <ファイル>-Nuclei-df.csv
         これは各FISHチャネルの核ごとの特徴測定値と関連する点数を含み、統計解析のための定量的データを提供します。
      2. <ファイル>-Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         これは、核の大きさや強度に基づいてセグメンテーションの外れ値を特定するための散布図です。外れ値としてフラグが立てられた核はさらなる解析から除外します。
   10. 必要に応じて、高度な後処理のために追加の中間出力(例:セグメントマスク、句点検出表、統合されたFISHサマリーファイル)を使用してください。
2. Imarisを用いた個別に同定可能な細胞における転写カウント
   1. Surfacesツールを用いて、細胞質または膜マーカーチャネルに基づいて関心のあるニューロンをセグメント化します。
   2. 表面平滑化と強度閾値パラメータを調整し、生成された表面がソーマを正確に包み込みつつ隣接する構造を除外するようにします。
   3. スポット検出ツールを用いて、FISHチャネル内のトランスクリプトの句点を特定します。点の大きさと信号強度(例:組織拡張の2倍の場合0.25μM)に基づいて推定スポット直径と強度閾値を設定します。
   4. スポット検出を事前に生成した表面に限定し、ニューロン内の点点のみをカウントするようにします。
   5. 統計パネルを使ってニューロン表面内の検出されたスポットの総数を抽出します。
   6. 輸出スポットカウントおよび関連する測定値による下流分析。
3. FIJI/ImageJを用いたROIベースの蛍光定量化
   1. FIJIで画像スタックを開き、 Zプロジェクト>>最大強度投影> 画像スタック最大強度投影を生成できます。実験内のすべてのサンプルに対して同じ投影設定を用いてください。
   2. 解剖学的マーカーチャネル(例:膜または細胞質GFP)を用いて、関心のある神経構造を特定します。FreehandまたはPolygon Selectツールを使って、構造(例:巨大繊維樹状突起)に対応するROIを手動で輪郭付けします。
   3. タンパク質チャネルに切り替え、定義されたROI内で蛍光強度を Analyze > Measureで測定してください。 以下のパラメータを記録します:平均蛍光強度;統合密度;ROIの領域です。
   4. 特異的信号を持たず、標識されたニューロン構造の外にある近隣の背景ROIで蛍光強度を測定します。実験内のすべてのサンプルに対して同じ背景ROI戦略を使い、ROI測定値から背景値を差し引いてください。
   5. 遺伝子型や実験条件を比較するために、背景補正済みの統合密度または平均強度値を用いましょう。比較対象となるすべてのサンプルで同一のイメージング設定を使用していることを確認してください。

結果

生物学的に関連した環境で拡張補助HCR-smFISHおよび免疫組織化学のワークフローを検証するために、ショウジョウバエの視覚系の迫り来る脱出回路に焦点を当てました。この回路は、迫り来る刺激を検出する遺伝的に定義されたLC4視覚投影ニューロン^30,31と、迅速な離陸を駆動するよく特徴づけられた巨大繊維(GF)下降ニューロン^32,33で構成されており、完全な脳における細胞型特異的分子測定のための解剖学的にステレオタイプ化されたシステムを提供します。

ショウジョウバエのギャップジャンクションタンパク質Shaking-B(ShakB)³⁴は、GF回路の複数の構成要素、すなわち軸索出力シナプス³⁵や聴覚入力³⁵における電気的伝達に関与していることが示唆されています。接近検出時のGF樹状突起での電気結合の直接的な証拠は限られていますが、最近の研究ではLC4ニューロンが高いレベルのShakB³⁶が発現していることが示されています。これらの観察結果を受けて、ShakBノックダウンおよびタグ付け戦略を用いて、遺伝的に定義された神経細胞タイプにおけるRNAおよびタンパク質レベルで標的分子摂動を定量的に評価できるかどうかを評価する試験ケースとして用いられるようになりました。

まず、GFおよびLC4における ShakB ノックダウンの効率をHCR-smFISHとShakB抗体染色を組み合わせて評価しました。GFは半脳あたり単一のニューロンで、膜マーカーで標識されました(図4A)。LC4は半脳あたり約60個のニューロンで構成されており、集団レベルの定量化を可能にするために核マーカーがラベル付けされました(図4B)。対照脳では、 shakB 転写産物がGFニューロンとLC4ニューロンの両方で明確に検出されました。 ShakB RNAiの発現により、両細胞型の標的ニューロンにおける ShakB mRNAの発生点が有意に減少しました(図4C–D)。RNA干渉の細胞質部位と一致し、転写本の枯渇は細胞質区画で最も顕著でした。FlySegを用いた核および細胞質の点点の分離により、LC4集団全体で細胞質 のShakB 転写物が選択的に減少し、核点は有意に影響が少ないことが示されました(図4D、 それぞれ69%対22%の減少)。

ShakB抗体染色は、GF樹状突起が巨大交絡間ニューロン(GCI)軸索と重なる領域に局在していることを発見しました。GCIは2つの巨大線維を結び、対側の視覚応答を可能にします³⁷ (図4E)。これらの観察は、GFとGCI間のShakB依存的な電気的結合を示す先行研究³⁵ と一致しています。また、LC4軸索がGF樹状突起に接触する領域でもShakB抗体染色が観察されましたが、この領域の局在はあまり明確ではありませんでした。細胞内正確な局在にかかわらず、GF樹状領域に関連するShakB抗体シグナルはRNAi発現後に著しく減少しました(図4F)。

しかし、抗体ベースの検出では、接触部位においてShakBタンパク質をシナプス前LC4末端とシナプス後GF樹状突起の明確な割り当てを可能にしません。さらに、視覚^系全体でShakBが広く発現していることにより、抗ShakB免疫染色を用いたLC4ニューロンにおける細胞型特異的定量^{が制限されています}。これらの制限を克服し、細胞型特異的なShakB局在を直接評価するために、以前に生成した内因性タグ付きのShakB対立遺伝子^36,38を用いました。これにより、LC4ニューロン内で特にShakBタンパク質を選択的に可視化することが可能となりました。SmGdP-10×V5タグ付きShakBは、上流の視覚ニューロンからの入力領域に対応する樹状突起とGF樹状突起に接触する軸索末端の両方に濃縮されていました(図4G)。shakB RNAiの発現により、樹状および軸索区画の両方でV5シグナルがほぼ完全に消失しました(図4H)。これらの結果は、プロトコルが神経細胞型特異的かつ細胞内側に限界を持つ神経系内の内因性タンパク質の局在解決を可能にすることを示しています。

追加の質的対照として、未拡大FISHと免疫組織化学を組み合わせて、特定された神経集団で検査しました(補足図1)。GRD からのFISH信号はLC22体性と重なり、視葉scRNA-seqデータからの予測発現と一致しました(補足図1A–C)¹³。tdTomatoを発現するTm3ニューロンでは、 tdTomato のmRNAがtdトマトタンパク質と重なり合いましたが、 VGlut1 のmRNAはTm3体性と重なりませんでした。これはTm3ニューロンのコリン作動性同一性と一致しています(補足図1)¹³。これらの例は、拡張されていないFISH + IHCだけで定性的な有無評価に十分であり、信頼性の高い単一の点の定量化には拡張が必要であることを示しています。

このプロトコルの成功した実装は、細胞型特異的な明確な標識、背景の低い離散的なsmFISH点、個々の核や手動で定義された細胞体積の信頼性の高い断片、そして撹乱後の標的RNAまたはタンパク質信号の一貫した減少によって示されます。陰性または低シグナルの結果も解釈可能であるべきです。例えば 、shakB RNAiは ShakB mRNAおよびShakBタンパク質シグナルを減少させ、非拡張FISHはtdTomato mRNA検出が明確なにもかかわらずTm3体マタでVGlut1シグナルが欠如しました。最適でない結果には、弱い抗体やsmFISHシグナル、高い背景プンクタ、不完全なセグメンテーション、プンクタの誤割り当て、画像診断中のサンプルドリフトなどがあり、これらは下流の定量に影響を与える可能性があります。

図2。光シートおよび共焦点顕微鏡プラットフォームを用いた拡大試料のマウントとイメージングを行いました。(A) 拡張ハイドロゲル(1–2)の可視化およびトリミング(すべてのイメージングプラットフォームに共通)、その後ライトシート顕微鏡(3–4)のためのマウント;ツァイス・ライトシート7)。 (B) 逆さレーザー走査共焦点顕微鏡(Nikon Ti2-E AXR)に搭載された拡大サンプルの写真。 (C) 拡張された ショウジョウバエ の視覚系サンプル(蛍光核マーカーで標識されたLC4ニューロン)の代表的な単一光学断片(単一Z面)を、3つのイメージングプラットフォームで取得した ShakB mRNAの探査( 図4参照)。スケールバー、10μm(拡張後組織)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。FlySegを用いたsmFISH点の定量解析。(A) FlySegの解析ワークフローの概説的概要:特定セル内の自動セグメンテーションおよび句点定量化。(B) FlySegのコアセグメンテーション論理を示す三次元Voronoiテッセレーション。イメージングボリュームは空間ドメインに分割されており(それぞれ異なる色で表示されます)、各パーティションは最大1つの核を収容するに制限されており、単一セルの割り当てを保証します。各ヴォロノイドメイン内では、核および周囲の細胞質強度値の両方に基づいて最適な核表面を決定する機能最適化手順を用いて核を分割します。(C) 核および細胞質転写を区別するためのnuclei_dilationオプションの実証 GFP標識核がsmFISH点に囲まれ、DNase処理後の細胞質区画を拡散DAPIシグナルで輪郭付ける単一の光学断片。線はそれぞれ核体積と細胞質体積に対応する0および0.5の拡張因子を示しています。 (D) (C) の最大強度射影。これは、プンクタが核および細胞質の区画の両方を局在させることを示しています。スケールバー、10μm(拡張後組織)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4。RNAi媒介分子摂動(A)を用いて、膜マーカーで標識し、制御(上)および下(下)条件下でShakB mRNAを検出した巨大繊維(GF)ソーマの10μm厚のライトシート射影(細胞全体を覆わない)を用いた定量ワークフローの検証。緑色の点線枠はソーマの境界を示し、細胞質の枯渇を強調しますが、核mRNAプールの枯渇は示しません。n、脳(動物ごとに片側)です。(B)核マーカーで標識されたLC4ニューロンの場合と同様に(A)。(C) 制御下およびShakB RNAi条件下でGFニューロン(核および細胞質プールの複合プール)におけるshakB FISH点の定量化。点は個々のニューロンを表します(脳ごとに1つのニューロン、動物ごとに1つの側)。(D) LC4ニューロンの場合、(C)と同じです。点は個々の脳を表します(動物ごとに片面、細胞ごとの点数を脳ごとの平均値で)。(E) GF樹状突起の共焦点投影で膜マーカーで標識され、制御(上)およびShakB RNAi(下)条件下でShakB染色。(F) GF樹状突起中のShakBタンパク質レベルを、コントロール下の平均蛍光強度およびGF>shakB RNAi条件として定量化すること。n、脳(動物ごとに片側)です。(G) LC4ニューロンの膜マーカーで標識され、smGdP-10xV5タグ付きShakBを発現した共焦点投影(上)およびShakB RNAi状態(下)。緑色の破線枠は、ShakB-V5密度が評価されたLC4樹状突起および軸索末端の領域を示しています(H) LC4樹状突起および軸索末端におけるShakB-smGdP-V5タンパク質レベルの定量は、制御下の平均蛍光強度として測定され、LC4はShakB RNAi>状態として測定されました。n、脳(動物ごとに片側)です。誤差バーはSEMの平均±を示します。すべての統計比較は両側ウェルチ検定を用いて実施されました。スケールバーは全画像で10μm(拡張後組織)で使用。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

このプロトコルは、拡張補助HCR-smFISH、前拡張免疫組織化学、分割に基づく転写産物定量を組み合わせ、同じ遺伝的に定義されたニューロン内でRNAとタンパク質のマッチング測定を可能にします。これらの構成要素を一つのワークフローに統合することで、完全なショ ウジョウバエ の脳における定量的かつ細胞型特異的な分子解析を促進するはずです。

ここで紹介するいくつかの実用的な修正は、 ショウジョウバエ の脳における免疫組織化学と拡張補助HCR-smFISHを組み合わせるための重要なステップ^{を示しています。}まず、組織増殖とsmFISHの前に免疫組織化学検査を行うべきです。プロトコルにはプロテナーゼKの消化ステップが含まれているため、増殖後に免疫組織化学を行うとエピトープの完全性が低下する可能性があります。重要なのは、前増殖抗体培養(24時間の一次+24時間の二次培養)は、RNaseクリーン技術と共有結合RNAアンカリングを用いる場合、RNAシグナル強度を目立たなく低下させないことです。次に、一次抗体および二次抗体の濃度を標準的な全マウントIHCと比較して通常2〜3×増加させ、プロテ�ナーゼKの消化および組織拡張に伴うシグナル損失を補うべきです。第三に、固定条件はタンパク質とRNAシグナルの両方を保存するために重要です。酸を使わないグリオキサル固定は、点状シナプスタンパク質の局在性の保存を促進し、神経細胞突起の構造的完全性を維持し、mRNA点の定量的検出を妨げません。また、RNAとタンパク質の同時アンカーは、下流のHCR-smFISHおよび免疫蛍光検出の両方と両立していることも観察しました。これらの調整は、免疫組織化学と増殖補助転写本検出の適合性を向上させます。

拡張は一晩だけのステップを加え、技術的には複雑ではありませんが、その使用方法は実験目的によって異なります。 補足図1に示されているように、拡張されていないFISHと免疫組織化学を組み合わせれば、特定の細胞型で遺伝子が発現しているかどうかを判断するのに十分であり、拡張は個々のsmFISHの点を確実に解消し、個々の体マタに割り当て、定量解析する必要があるため、効果的な空間分解能が大幅に向上します。同様に、寺崎型マルチウェルプレートは必須ではありませんが、試薬の使用量を減らし、複数の条件を並行処理可能にし、小ロット間でのサンプル同一性を維持するのに役立ちます。試薬の容積が制限が少ない場合には標準的なマイクロ遠心分離機管も使用可能です。ライトシート顕微鏡は拡大組織の迅速な体積イメージングを可能にしますが、標準的な逆レーザー走査および回転ディスク共焦点システムだけで、拡大した ショウジョウバエ 脳内の選択された神経集団の完全な画像化に十分であることを示しました。共焦点顕微鏡の一般的な制約は作業距離の短さです。しかし、ハエの脳は小さく、サンプルはPBSで約2×拡大されるため、長距離作業用の水中浸水用対物レンズが十分な浸透深度を提供します。定量的比較では、取得設定はサンプル間で同一に保ち、彩度の高いピクセルを避け、ボクセルサイズが個々のsmFISHの点点を分解するのに十分なものであるべきです。これにより、専用のライトシート機器を使わない実験室でもプロトコルのアクセスが拡大されます。

更新されたFlySegの実装は、以前に公開されたFlySegフレームワークを基盤とし、このプロトコルに2つの主要な追加要素を導入しています。まず、設定可能な核拡張パラメータにより、smFISH点を分割核との空間的関係に基づいて核核または細胞質に分類できます。DNase処理後の細胞質DAPI染色はこのステップで重要であり、細胞体を輪郭を示す拡散信号を提供し、信頼性の高い核断片を支え、核および細胞質の転写産プールの分離を支えます。第二に、自動外れ値検出により、分割が不十分な核を特定でき、これらは下流の定量から除外できます。細胞型特異的遺伝子ノックダウンの分子効果を評価することに加え、転写本の局在が進行中の転写活性を反映している場合、核および細胞質の転写産物を分離することは有益な情報となります。哺乳類の脳では、活動誘発的な即時初期遺伝子転写産物はまず核内に現れ、その後mRNAが処理・輸出される過程で細胞質に蓄積されます。³⁹は、catFISH⁴⁰ のニューロン活性化時間解析で用いられる原理です。ショ ウジョウバエ の脳でも同様の転写動態が起こるかどうかは現時点で不明ですが、原理的には現在のワークフローで探ることができます。他のパルスチェイス実験では、核と細胞質の点を区別することで、転写本の総数を超えた時間的情報が得られるかもしれません。同時に、ワークフローは核断片に限定されず、全細胞(すなわち膜で定義された)細胞断片にも適応可能です。現在の定量的ワークフローは神経体性に最適化されています。ニューロピル領域は画像化可能ですが、mRNAの支点を個々の軸索や樹状突起に定量的に割り当てるには、追加の区画特異的分断戦略が必要です。FlySegは、集団レベルの統計が求められる高密度なニューロン集団における自動化された高スループット定量化に最も有用です。個別に識別可能なニューロンや手動で定義された区画には、ImarisやFIJI/ImageJなどの他のツールの方が適している場合があります。これらの定量化戦略の概要、主な応用、利点、制限は 補足表1に示されています。

よくあるトラブルシューティングポイントには、弱い抗体信号、高いsmFISHバックグラウンド、ゲル損傷やサンプル損失、画像診断中のサンプルドリフト、そして不十分なセグメンテーションが含まれます。弱い抗体シグナルは、抗体濃度をさらに上げたり、一次抗体および/または二次抗体の培養期間を24時間から48時間に延長することで改善されることが多いです。高いsmFISH背景は、ハイブリダイゼーション後のウォッシュを延長し、飽和取得設定を避けることで軽減できることが多いです。ゲルの損傷やサンプル損失は、広口径のチップを使用し、直線カットでゲルをトリミングし、チャンバー充填中の気泡を防ぐためのベントチャネルを切断することで最小限に抑えられます。画像撮影中のサンプルドリフトは、取得前に少なくとも1時間の平衡化ゲルによって低減されます。ドリフトが続く場合は、平衡時間を2時間以上延長できます。分割不良は弱い細胞質DAPI染色やサンプル平衡の不完全さによって生じることがあり、これらは細胞境界信号の低下や取得時のX-Y-Zシフトを引き起こすことがあります。これらはFlySegパラメータを調整する前に必ず確認してください。このプロトコルでは、ゲルを1×PBSで維持し、約2×等方性膨張をもたらします。より高い空間分解能が必要な場合は、希釈されたPBSや脱イオン水でより大きな膨張を得ることができます。逆に、特定の細胞型における発現の有無を評価する目的のみの場合、拡張されていないFISHと免疫組織化学の組み合わせで十分である場合があり、 補足図1に示されています。このプロトコルは反復的なFISHワークフローと互換性があります。プローブやHCRヘアピンはDNase処理で除去でき、同じ標本内で追加のハイブリダイゼーションと増幅を可能にします。将来の技術的拡張には、より高プレックスの反復的なHCR-smFISH、画像診断ラウンドをまたぐ自動登録、細胞全体または神経突起のセグメンテーションの改善、実験間でのRNAおよびタンパク質シグナル比較のためのより標準化された解析パイプラインの提供などが考えられます。区画特異的分断戦略のさらなる発展により、神経体質の定量解析を超えて軸索や樹状突起にまで拡張できる可能性があります。RNA–タンパク質の読み出し、区画分解転写本定量、標準イメージングプラットフォームとの互換性を組み合わせることで、このワークフローは完全な ショウジョウバエ 脳の遺伝的に定義されたニューロンにおける標的分子検証実験に適しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10N水酸化ナトリウム溶液	フィッシャー・サイエンティフィック	カテゴリー# SS255-1
1N水酸化ナトリウム溶液	フィッシャー・サイエンティフィック	Cat# SS266-1
20×生理食塩-ナトリウムクエン酸塩緩衝剤	インビトロジェン	Cat# AM9763
4-ヒドロキシ-テンポ	シグマ・オルドリッチ	キャット# 176141
5M塩化ナトリウム溶液	シグマ・オルドリッチ	カタログ# S5150
アクリルアミド	シグマ・オルドリッチ	猫番号# A9099
アクリル酸	シグマ・オルドリッチ	カタログ#147230
アクリロイル-X、SE	インビトロジェン	猫#A20770
Adobe Illustrator	Adobe	該当なし
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken(1:200)	ジャクソン免疫研究所	Cat#103-545-155、RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 ヤギ抗ネズミ IgG1(1:200)	インビトロジェン	Cat# A-21124、RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 ヤギアンチラビット IgG1(1:200)	インビトロジェン	Cat# A-11011、RRID:AB_143157
過硫酸アンモニウム	シグマ・オルドリッチ	カタログ# A3678
無水、DMSO	シグマ・オルドリッチ	Cat# 900645-4X2ML
ボンディックUV硬化接着剤	ボンディック	ボンディックスターターキット
cellSens イメージングソフトウェア v4.4.1	エヴィデント・サイエンティフィック	該当なし
チキンポリクローナル抗GFP(1:400)	アブカム	Cat# ab13970、RRID:AB_300798
Conda(環境管理者)	アナコンダ社	該当なし
コーニング&トレード;フロスト顕微鏡スライド	コーニング	カタログ#2948-75X25
カスタム設計のLS7サンプルホルダー	ジャネリア・テック	ID 2021-021
ダピ	シグマ・オルドリッチ	カタログ# D9542
使い捨てステンレス滅菌メス	メッドプライド	MPR-47101
エチレンジアミネテトラ酢酸およびnbsp;	シグマ・オルドリッチ	Cat# EDS-100G
フィジー(ImageJ)画像解析ソフトウェア v2.14.0	ImageJコンソーシアム	該当なし
FlySeg(カスタムパイプライン)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	該当なし
GAF固定液	アダックス・バイオサイエンス	カテゴリー# VI25
GenClone®24枚のウェル培養プレート、未処理	ジェネシー・サイエンティフィック	カタログ#25-102
GMR-86D05-Gal4(LC4)	ブルーミントン・ストックセンター	#41315
ヤギ血清ドナーの群れとnbsp;	シグマ・オルドリッチ	猫 # G6767
HCR™RNA-FISH(v3.0)アンプバッファ	分子機器	該当なし
HCR™RNA-FISH(v3.0)アンプ:AF546、JF669	分子機器	該当なし
HCR™RNA-FISH(v3.0)プローブハイブリダイゼーションバッファー	分子機器	該当なし
HCR™RNA-FISH(v3.0)プローブウォッシュバッファ	分子機器	該当なし
HCR™RNA-FISH(v3.0) ShakBプローブ	分子機器	該当なし
イマリス 10.1	オックスフォード・インストゥルメンツ	該当なし
IXPlore IX85 SpinSR 回転円盤共焦点顕微鏡	エヴィデント・サイエンティフィック	該当なし
LS7ライトシート顕微鏡	カール・ツァイス	該当なし
メルファラン	ケイマン・ケミカル	カタログ#16665
MOPS バッファ	フィッシャー・サイエンティフィック	Cat# BP308-100
マウスモノクローナルアンチV5(SV5-PK1)(1:100)	アブカム	Cat# ab27671、RRID:AB_471093
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン 	シグマ・オルドリッチ	カタログ# T7024
N,N'-メチレンビサクリルアミド	シグマ・オルドリッチ	猫#M7279
ナパリ	オープンソースコミュニティ	該当なし
NIS-Elements 先進研究イメージングソフトウェア	ニコン株式会社	該当なし
ヌクレアーゼフリー水	キアゲン	猫#129114
ナンク&トレード;Nunclon&tradeのミニトレイ;デルタ面	インビトロジェン	キャット# 163118
PBS(10X)、pH 7.4およびnbsp;	ギブコ	キャット# 70011044
フォトフロー洗剤	電子顕微鏡科学	カタログ#74257
ポリ-L-リジン溶液	テッド・ペラ	カタログ#18026
精密カバーグラス、#1.5H 厚さ	ソーラブ	キャット# CG15CH2
プレス・トゥ・シール&トレード;接着剤付きシリコンアイソレーター、1つの井戸、直径20mm、深さ0.5mmです	インビトロジェン	猫#P24740
プロテイナーゼK	ニューイングランド バイオラボ	Cat# P8107S
ラビット・アンチ・シャクB(1:400)	ジョード・アマーからの贈り物	該当なし
RNase AWAY™表面除染剤	インビトロジェン	カタログ#7002
RNaseフリーDNaseセット	Qiagen	カタログ#79256
シュナイダーsのショウジョウバエ中等種と注意;	ギブコ	キャット# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighettoら、2025年	PMID:41278920
アジ化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	猫#S8032
ステミ508立体顕微鏡	カール・ツァイス	該当なし
SYTO™41 青色蛍光核酸染色	インビトロジェン	猫#S11352
Ti2E AXR NSPARC レーザー走査共焦点顕微鏡	ニコン株式会社	該当なし
トリス・ベース	フィッシャー・サイエンティフィック	Cat# BP152-500
Triton™X-100	シグマ・オルドリッチ	猫#T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo ほか 2024年	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski ら、2025年	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	ブルーミントン・ストックセンター	#35785
UAS-myr::GFP;	ブルーミントン・ストックセンター	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer ら、2022年	PMID: 35385694
ウルトラピュア&トレード;1M Tris-HCI、pH 8.0	インビトロジェン	猫#15568025
VT042336-Gal4(巨大ファイバー)	Dombrovski ら、2025年	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	カール・ツァイス	該当なし