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方法論記事

特発性肺線維症における糖シル化関連遺伝子の役割を探る統合的機械学習アプローチ

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DOI:

10.3791/71408

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2026年7月31日

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1Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Jinan University, 2Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University

この記事について

サマリー

本研究では統合トランスクリプトミクス解析、機械学習(LASSO、SVM-RFE、XGBoost)、免疫浸潤解析、分子ドッキング、RT-qPCR検証を用いて特発性肺線維症に関連する糖鎖化関連遺伝子を特定しました。10の診断遺伝子候補が同定され、肺組織データセットで高い性能を持つ診断モデルが開発・検証されました。

要約

特発性肺線維症(IPF)は進行性の慢性性肺疾患であり、病因は不明であり、糖鎖化関連遺伝子(GRG)の発症への寄与は依然として十分に解明されていません。本研究は、IPFにおけるGRGの潜在的なメカニズムの解明、主要なバイオマーカーの特定、バイオインフォマティクスと機械学習を用いた診断モデルの開発に焦点を当てています。GEOデータベースのトランスクリプトミックデータはGRGsと統合され、IPFにおける役割を調査しました。差異発現遺伝子(DEGs)を特定し、機能豊化およびタンパク質間相互作用(PPI)解析を行いました。LASSO回帰、サポートベクター機械再帰特徴消去(SVM-RFE)、XGBoostを組み合わせた機械学習ワークフローを用いて、GSE150910トレーニングデータセットを用いて主要な遺伝子を特定し、診断モデルを構築しました。その後、モデルの性能は4つの独立した検証データセットで評価されました。遺伝子セット濃縮解析(GSEA)、免疫浸潤解析、薬物-遺伝子相互作用解析、分子ドッキング、IPF患者および健康対照群の末梢血サンプルを用いたRT-qPCR検証などの追加解析が行われ、同定された遺伝子の生物学的関連性を調査しました。合計126の糖鎖化関連DEGが同定され、10の主要遺伝子が選定されました。診断モデルは肺組織データセットで曲線下面積(AUC)が0.963および0.814、血液データセットで0.681および0.706を記録しました。免疫浸透解析により患者サブグループ間のB細胞存在量の違いが明らかになり、RT-qPCR検証により臨床サンプルにおける選択遺伝子の差異発現が確認されました。これらの発見は、IPFにおけるGRGの関与の可能性を示す洞察を提供し、候補診断遺伝子としての関連性を支持しています。

概要

特発性肺線維症(IPF)は、遺伝的素因、環境的誘因、免疫機能障害を含む異質性の病因を特徴とする進行性の線維化間質性肺疾患です1,2。この疾患は、早期診断の困難さ、治療効果の限界、そして一般的に悪い予後により、重大な臨床的課題を抱えています。IPFの有病率は10万人あたり20人から80人の範囲で、治療なしの中央値生存期間は通常3〜5年3.4年です。急速な病変進行のリスクが高い患者を特定することは、効果的な治療戦略に不可欠であり、病況悪化を経験しやすい人々に対して標的治療を可能にします。

グリコシル化はタンパク質の共翻訳および翻訳後修飾であり、タンパク質活性および細胞生物学の調節において重要な役割を果たします 5,6。タンパク質糖鎖の調節不全がIPF進行に寄与している可能性が高い7,8。多くのリウマチ疾患では、タンパク質の糖基化変化が観察され、これは炎症過程や疾患進行と密接に関連しています9。例えば、LyuらはCRLF1とGLG1が変形性関節症10の病理学的過程において重要な役割を果たしていることを発見しました。さらに、グリコシル化は肺組織内の免疫細胞活性化に関与していることが示されており、肺疾患の病因とさらに関連していることが示唆されています11。このため、タンパク質糖鎖化の調節障害もIPFの進行に寄与する可能性があります。しかし、IPFにおけるグリコシル化関連遺伝子(GRG)の役割はまだ十分に解明されておらず、IPF診断の可能性はさらなる検討が必要です。

本研究では、機械学習手法とRNAシーケンシングデータを統合し、IPFに関連する主要なGRGを特定する研究を実施しました。これまでのIPF研究では、従来の差別発現解析や単一の機械学習アルゴリズムに依拠することが多かったため、候補バイオマーカーの堅牢性や一般化可能性が制限される可能性があります(12,13)。これらの制約に対処するため、LASSO、SVM-RFE、XGBoostなどの複数の機械学習アルゴリズムと差分式解析を組み合わせた多段階計算ワークフローを採用し、特徴選択の信頼性を向上させました。さらに、診断モデルは複数の独立したデータセットで評価され、主要な発見は臨床サンプルを用いてさらに検証されました。その後、診断モデルが開発・検証され、免疫浸潤特性が分析されました。さらに、同定された遺伝子に関連する免疫微小環境および分子相互作用の可能性も探求されました。本研究はIPFに焦点を当てましたが、ここで用いられた分析戦略は他の慢性肺疾患やトランスクリプトミックデータセットにも適用可能であり、主要な遺伝子の同定と検証のための再現性のある枠組みを提供します。具体的なプロセスについては図1を参照してください。

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プロトコル

本研究は蚌埠医科大学第一附属病院の機関審査委員会により承認されました(承認番号:2023YJS162)。サンプル採取前に全参加者から書面によるインフォームドコンセントを取得しました。

データ収集

本研究で使用されたトランスクリプトームデータは、Gene Expression Omnibus(GEO)データベース(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/;リッド:SCR_005012)。主要なトレーニングデータセットGSE150910はIllumina NovaSeq 6000プラットフォーム(GPL24676)を用いて生成され、103のIPFと103の正常肺組織サンプルで構成されました。結果の検証のために、独立したデータセットGSE24206、GSE110147、GSE93606、GSE38958が用いられました。各データセットの詳細情報は 表1に記載されています。さらに、これまでに発表された研究から合計636件のGRGが選ばれました。

糖シル化関連DEGの差異発現解析および機能的特性評価

GSE150910データセットのIPFと正常肺組織サンプルの差別発現解析は、RパッケージDESeq2(RRID: SCR_015687)を用いて実施されました。調整されたP値(padj)<0.05および|log2FoldChange|0.5>差異発現遺伝子(DEGs)とみなされました。糖シル化関連DEG(GR-DEGs)は、DEGとあらかじめ定義された636個のGRGセットを交差させることで同定されました。これらの遺伝子の生物学的役割をさらに調査するため、遺伝子オントロジー(GO)の濃縮解析および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路解析が行われ、その機能的役割と経路関与を明らかにしました。STRINGデータベース(RRID: SCR_005223)15 を用いて、相互作用信頼度スコア閾値を>0.7で構築し、IPFにおけるGR-DEGsの分子相互作用および潜在的な調節機構を明らかにしました。

主要遺伝子のスクリーニングと診断モデルの構築

GI-DEGからIPFの主要遺伝子をスクリーニングするために、複数の機械学習アルゴリズムを用いました。当初、LASSO回帰(RRID: SCR_003418)には二値ロジスティック回帰(ファミリー=「二項法」)が適用され、最適なペナルティパラメータλは10折のクロス検証(nfold=10)によって選択されました。最終的な選択結果は、λ_(min)(0.01700442)に対応する非ゼロ係数を持つ特徴でした。SVM-RFEでは、RパッケージキャレットのRFE関数が使用されました。再帰的特徴除去は10回のクロス検証(方法=「cv」、番号=10)によって行われ、特徴を1から126まで段階的にフィルタリングし、精度を用いて最適な特徴部分セットを特定しました。XGBoostでは、目的関数は二値ロジスティック回帰(目的関数=「二値:ロジスティック」)に設定され、評価メトリクスは対数損失(eval_metric = 「logloss」)、反復回数(nラウンド数)は100、学習率(eta)は0.1に設定されていました。上位20遺伝子は特徴重要度スコア(Gain)に基づいて選ばれました。これらの手法の結果を交差させることで、精製された主要な遺伝子セットが特定されました。この遺伝子セットに基づき、トレーニングデータセット(GSE150910)を用いてXGBoost診断モデルを構築し、その予測性能は外部検証データセット(GSE110147、GSE24206、GSE93606、GSE38958)に対する受信者動作特性(ROC)解析で評価されました。さらに、選択された各遺伝子が疾患確率に与える寄与を可視化するノモグラムが開発され、モデルの臨床的有用性はキャリブレーション曲線および意思決定曲線解析(DCA)を通じてさらに評価されました。

主要遺伝子の生物学的経路の探求

機械学習によって特定された主要な遺伝子の生物学的文脈を探ること。遺伝子セット豊か解析(GSEA)16 は、分子シグネチャーデータベース(MSigDB)(RRID: SCR_016863)17の遺伝子リストに基づいて実施され、経路はNES > 1のスクリーニングを行いました。上部の濃縮経路はenrichplot関数を用いて可視化しました。

主要な遺伝子スコアに基づくIPFサブタイプにおける生物学的機能と免疫地形の違いの探求

特定された主要遺伝子の発現プロファイルに基づき、単一サンプル遺伝子セットリッチメント分析(ssGSEA)スコアを計算し、中央値スコアに基づいてIPF患者を高得点群と低得点群に層分けしました。両群間で差異発現解析が行われ、その後GSEA(RRID: SCR_003199)18 でDEGに対するGO生物学的プロセス(GOBP)およびKEGG経路の濃縮解析が行われました。

免疫細胞浸透と主要遺伝子発現の違いの解析

ssGSEAスコアに基づくサブグループ層別化の後、高得点群と低得点群間の免疫浸潤差が評価されました。まず、CIBERSORTアルゴリズム(RRID: SCR_016955)19 とLM22特徴行列を組み合わせて、サンプル中の22種類の免疫細胞の相対的存在比を計算しました。具体的には、RパッケージのIOBRのdeconv_tme関数(パラメータ:method = "cibersort"、arrays = FALSE、perm = 200)が計算に用いられ、ggpubrパッケージ(RRID: SCR_021139)を使って高得点群と低得点群間の免疫細胞浸潤の違いを評価するボックスプロットが作成されました。さらに、RパッケージGSVAのGSVA関数(ssGSEA法を用いて)を用いて28種類の免疫細胞の濃縮スコアを算出しました。これらのスコアはMin-Maxスケーリングを用いて正規化され、[0, 1]区間にマッピングされ、細胞タイプ間の比較が容易になりました。最後に、ウィルコクソンランク総和検定を実施し、GSE150910およびGSE110147データセットにおける正常サンプルとIPF患者間の主要遺伝子発現を比較し、IPFサブグループ間の免疫細胞浸潤および遺伝子発現の違いを包括的に分析しました。

RT-qPCR解析を用いたIPF患者における主要遺伝子の検証

同定された遺伝子の診断的関連性を検証するため、XGBoostアルゴリズムで最も重要度の高い6つの遺伝子を選択し、逆転写定量PCR(RT-qPCR)を用いてIPF患者および健康対照群の発現レベル検証を行いました。蚌埠医科大学第一附属病院から合計20点の血液サンプルが採取され、うち9件はIPF患者から、11件が健康者から採取されました。血液サンプルから総RNAを抽出し、多機能マイクロプレートリーダーを用いてRNA濃度を測定しました。RNAの質は下流解析前に評価されました。逆転写時にゲノムDNAが除去され、RT-qPCRに使用されるプライマー配列は 表2に記載されています。プライマー特異性は融解曲線解析によって検証されました。GAPDHは内部参照遺伝子として用いられました。相対的な遺伝子発現レベルは2-ΔΔCt 法を用いて算出されました。この検証段階は、IPFにおける同定遺伝子の差異発現および診断的関連性の予備的な実験的支援を提供します。

統計解析

データはRで分析され、Wilcoxon検定を用いて両群間の差異を検出しました。GSEA、GO、KEGGの濃縮解析はRパッケージのclusterProfiler(RRID: SCR_016884)を用いて実施されました。p 値 <0.05は特に指定がない限り有意とみなされました。

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結果

GR-DEGの関数解析および相互作用ネットワーク解析

IPFにおける遺伝子関与を調査するために、GSE150910の差異発現解析を実施し、4,216個のDEGが特定されました(図2A)。これらのDEGを636個のGRGと交差させることで、126の疾患関連糖基化遺伝子が同定されました(図2B)。さらに、交差遺伝子の生物学的機能の可能性を評価するために、GOおよびKEGG濃縮解析を実施しました。図2Cに示すように、GO濃縮解析では112の有意な項が明らかになり、その中には53 BP(例:糖タンパク質代謝、タンパク質糖シル化)、26の細胞成分(例:ゴルジ腔、小胞体腔)、33の分子機能(例:グリコシルトランスフェラーゼ活性、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ活性)が含まれていま...

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ディスカッション

IPFは原因不明の慢性進行性疾患であり、患者の生活の質を著しく低下させ、早期死亡につながります4。治療戦略の進歩にもかかわらず、診断後の中央値生存期間は依然として低く、IPFの病因は依然として完全には解明されていません。したがって、IPFの分子メカニズムを解明することは緊急かつ極めて重要です。過去の研究では、脱糖糖と肺疾患との関連が確立されています。しかし、IPFの病因における糖鎖化の潜在的役割は、依然としてほとんど解明されていません。したがって、本研究はIPF診断のためにグリコシル化関連の遺伝子シグネチャーを機械学習手法と統合した初の研究です。この革新的なアプローチは、主要な遺伝子の特定に新たな視点をもたらし、IPFの病態生理学の理解を深める助けとなる可能性があります。

最近の研究では、統合トランスクリプトミクスおよび機械学習手法を用いてIPFにおける小胞体ストレス関連遺伝子が同定されています(23,24,25)。

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

研究過程を通じて支援と支援を提供してくださったすべての同僚に感謝申し上げます。彼らの協力と励ましは、私たちの仕事にとって非常に貴重なものでした。この研究は外部からの資金援助を受けていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CaretR Foundation for Statistical Computingバージョン 6.0.94SVM-RFE
ClusterProfilerR Foundation for Statistical Computingバージョン 4.12.6GSEA、GO、KEGG エンリッチメント分析
DESeq2R Foundation for Statistical Computingバージョン 1.44.0差次発現分析
Fast First-Strand cDNA Synthesis MixGoonie Biotech Co., Ltd.500-101RT-qPCR 用 cDNA 合成
FastTaq qPCR SYBR Green Master MixGooniebio500-102定量 PCR 増幅
Fluorescent Quantitative PCR SystemBio-Rad Laboratories, Inc.CFX96定量 PCR 増幅
GEO DatabaseNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/トランスクリプトームデータソース
ggpubr R Foundation for Statistical Computingバージョン 0.6.0ボックスプロット生成
GSVAR Foundation for Statistical Computingバージョン 1.52.3ssGSEA
MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/GSEA 分析
PCR SystemBio-Rad Laboratories, Inc.PTC TempoRT-qPCR 用 cDNA 合成
PrimersTsingke Biotechnology Co., Ltd.N/AqPCR プライマーのカスタム合成
R softwareR Foundation for Statistical Computingバージョン 4.4.1統計分析と可視化
RNA Isolater Total RNA Extraction ReagentVazyme Biotech Co., Ltd.R401-01全血からの総 RNA 抽出
STRING DatabaseSTRING Consortiumhttps://string-db.org/PPI ネットワーク構築
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek Instruments, Inc.Synergy HTXRNA 濃度測定

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