ネットワーク薬理学およびラット尾椎間板穿刺の検証:一奇火雪丸の腰椎椎間板変性治療

サマリー

本研究ではネットワーク薬理学、分子ドッキング、ラット尾椎間板穿刺モデルを用いて、Yi Qi Huo Xue滴薬が腰椎椎間板変性に与える前臨床的効果を調査し、AKT1、BCL2、STAT3などの候補標的およびPI3K-AKTシグナル伝達などの経路に焦点を当てました。

要約

本研究では、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション、実験的検証を用いて、腰椎間板変性(LDD)における易気火雪煮(YQHXD)の薬理学的基盤と潜在的な分子メカニズムを調査しました。YQHXDの有効成分関連標的は合計678点、LDD関連の治療標的は296件が特定されました。タンパク質間相互作用ネットワーク解析およびトポロジカル解析により、AKT1、IL6、TNF、BCL2、STAT3などの候補標的が特定されました。Gene Ontologyおよび京都遺伝子・ゲノム百科事典を用いた濃縮解析では、候補標的がタンパク質結合やATP結合などの機能と関連しており、経路の濃縮にはPI3K-AKTシグナル伝達が含まれていました。分子ドッキングにより、ケルセチン、テトラニューリンA、イソルハムネチンなどの選択された有効化合物とコアターゲット間の相互作用が予測されました。分子動力学シミュレーションは、最も低エネルギーの錯体が安定していることを示唆しました。70頭のオスのスプラグ・ドーリーラットが、対照群、偽手術群、モデル群、陽性対照群、低用量、中用量、高用量のYQHXD群に無作為に割り当てられました。モデル群、陽性対照群、YQHXD群で尾椎椎間板穿刺モデルが確立された後、ラットには経口ガベージによるYQHXDまたはセレコキシブを8週間投与し、対照群および偽手術群は生理食塩水を投与しました。組織病理学的評価では、YQHXD治療がこのモデルにおいて椎間板変性の減少と関連していることが示されました。酵素結合免疫吸着アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、ウェスタンブロット解析では、AKT1、BCL2、STAT3を含む選択標的のmRNAおよびタンパク質発現レベルに変化が見られました。これらの発見は、YQHXDが炎症およびアポトーシスに関連する多成分・多標的調節を通じて、LDDにおいて前臨床的保護効果を発揮する可能性を示唆しています。本研究は、YQHXDのLDDに対するさらなる研究を支持する予備的な前臨床的証拠を提供します。

概要

腰椎椎間板変性症(LDD)は、発症が遅く、治療の困難さ、高い再発率、障害を特徴とする一般的な加齢関連整形外科疾患です。LDDは、椎間板(IVD)における細胞外マトリックス(ECM)の異化代謝と同化代謝のバランスの不均衡に関連する変性病理学的変化を伴い、腰痛(LBP^)と密接に関連しています1。疫学的研究によれば、LBPは臨床実践における障害の主な原因の一つであることが示されています^。

1990年から2017年の間に、世界の感染者数は4,250万件から6,490^万件に増加し、日常生活に影響を及ぼし、社会的・経済的な負担も大きくなっています。したがって、LDDの効果的な治療は臨床的に依然として重要です。臨床現場では、LDDは保存的または外科的症状治療で管理されることが多く、症状の緩和は可能ですが、一般的に椎間板変性(IVDD)を逆転させることはできません。保存的治療に一般的に用いられる経口非ステロイド抗炎症薬は、腎臓、消化器、心血管の副作用と関連している場合もあります。

伝統中国医学(TCM)は長い間、^{病気の管理}に用いられてきました。ハーブ化合物や個々の成分は、IVDDの進行を遅らせ、組織再生を促進することが報告されています⁵。臨床現場では、TCMの処方は変性性の骨疾患や関節疾患に対する保存的管理戦略の一部としても用いられています。蘇州地域の呉家医学院では、一気火雪煎(YQHXD)を腰椎IVD障害の中核処方として使用しています。しかし、LDDにおけるその潜在的な役割を明らかにするにはさらなる機構的証拠が必要です。

これまでの研究では、YQHXDが細胞のオートファジーを促進し抗^{老化効果を}発揮することでIVDDを遅らせる可能性があると示唆されています^6,7。しかし、YQHXDがLDDに影響を与える薬理学的メカニズムは依然として不明であり、その作用機序の体系的な分析もまだ不足しています。本研究では、ネットワーク薬理学を用いてYQHXDの多成分および多標的特性をLDDに関連して解析しました。分子ドッキングは化合物と標的タンパク質間の相互作用評価に用いられ、その後分子動力学シミュレーションが行われました。これらの予測は、LDD⁸におけるYQHXDの潜在的なメカニズムを調査するために、ラット尾椎間板穿刺モデルを用いて評価されました。図1に示されているように、本研究はYQHXDがAKT1、BCL2、STAT3などの遺伝子やタンパク質を調節し、PI3K-Aktシグナル伝達やその他の疾患関連経路カテゴリーを含む経路の濃縮を通じてLDD関連プロセスに影響を与える前臨床的証拠を提供しています。

プロトコル

すべての実験は南京中医薬大学の倫理審査委員会(プロトコルコード:202501A018)により承認され、国立衛生研究所(NIH)の実験動物ケア・利用ガイドラインに従って実施されました。すべての実験手順はARRIVEガイドラインに準拠しました。

実験薬
YQHXDのサンプル溶液には、 アストラガルス・メンブラナセウス 根20g、アン ジェリカ・シネンシス 根20g、 リグスティクム・チュアンシオン 根茎15g、 ステファニア・テトランドラ 根6g、 チャエノメレス・スペシオサ 果実15g、 シナピス・アルバ 成熟種子10gが含まれており、総量の粗薬重量は処方1回あたり86gでした。すべての漢方成分は、広西中医学大学付属瑞康病院薬学部によって、2020年版の中国薬典に基づき認証されました。YQHXDのサンプル溶液は水煮込み法で調製されました。総原油量の8倍の滅菌蒸留水を加え、ハーブは30分間浸して完全に浸しました。混合物は沸騰させ、弱火で30分間分離してからろ過します。残渣は同じ手順で同じ量の無菌蒸留水で再度抽出されました。2回の抽出液を結合し、低圧で回転蒸発を用いて55.5mLまで濃縮してYQHXDのストック溶液を得ました。総原油重量に基づくと、最終的な原油濃度は1.55 g/mLで、抽出率は約64.5%でした。実験用ラットに投与された用量は、臨床用成人用量から体表面積正規化法を用いて換算されました。人間とラットの換算係数は約6.3でした。したがって、ラット用量(mg/kg)はヒト用量(mg/kg)×6.3と計算されました。高用量群は15.48 g/kg/日、中用量群と低用量群はそれぞれ7.74 g/kg/日と3.87 g/kg/日を受け取りました。ガベージ容量10 mL/kgの場合、対応する作動濃度は高用量群、中用量群でそれぞれ1.548、0.774、0.387 g/mLでした。ストック溶液は投与前に各実験群の目標用量を達成するために希釈されました。調製後、デコップは冷却され、無菌条件下で分割され、−40°Cで保存されて使用されました。

ネットワーク薬理学解析

有効成分標的タンパク質の予測
2025年11月24日、TCMSPデータベースから「黄気、アンジェリカ、川雄、ステファニア、ムグア、ジェズィ」という検索語で有効化合物が取得されました。化合物は経口バイオアラバリー(OB ≥ 30%)および薬剤類似性(DL ≥ 0.18^{)に基づいて}スクリーニングされました。これらの閾値の根拠は以下の通りです。TCMSPデータベースはPubChem、ChEMBL、ChemSpiderなどの権威ある情報源からの化合物データを統合し、経口バイオアベイラビリティを含むADME関連パラメータを提供します。経口バイオアラビリティとは、経口投与量のうち全身循環に到達する割合が変わらずに済む割合であり、高いOBはバイオアクティブ分子の特定に不可欠です。薬物類似性は、化合物の薬剤性を評価し、その溶解度や安定性を予測するために用いられる指標です。本研究では、より厳格なOB閾値(≥30%)を適用し、データベース推奨値(≥20%)を上回り、良好な経口吸収および薬物動態プロファイルを持つ候補化合物を特定しました。一方、DLは化合物の薬剤様ポテンシャルの推定に用いられ、伝統中国医学化合物で観察された平均DL値に基づくDL≥0.18のカットオフが採用されました。選ばれた有効化合物はPubChemデータベースからSMILES形式で取得され、種をホモ・サピエンスに設定してSwissTargetPredictionデータベースにインポートしました。標的タンパク質は公式の遺伝子記号で標準化され、予測信頼性を高めるために確率値が0より大きい標的のみが保持されました。予測対象を持たない化合物は、その後のネットワーク解析から除外されました。すべてのターゲットを統合した後、スプレッドシートソフトウェアで重複エントリーを削除し、最終データセットで各ターゲットが1回のみ表示されるようにしました。

主要ターゲットの収集
疾患関連遺伝子は、GeneCards¹⁰、OMIM¹¹、TTD¹² のデータベースから「腰椎椎間板変性」というキーワードで取得されました。収集された遺伝子標的を統合し、重複したエントリーを除去して最終的な疾患関連標的セットを得ました。

LDD治療におけるYQHXDの潜在的な標的
Venny 2.1.0プラットフォームはLDDにおけるYQHXDの潜在的なターゲットを特定するために使用されました。その後、活性成分と予測ターゲット間の関連を示すネットワークが生成されました。コアのアクティブコンポーネントはネットワーク内の次数値に基づいて選ばれました。

薬物成分および疾患交差標的のネットワーク構築
TCMの処方YQHXDの有効成分、標的タンパク質、LDD関連遺伝子がCytoscapeソフトウェア¹³ に取り込まれ、薬剤-成分-標的-疾患ネットワーク図を構築しました。

PPIネットワークの構築と主要コアターゲットの特定
交差する標的はSTRINGプラットフォーム¹⁴ に提出され、生物はホモ・サピエンスに設定されました。タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを構築するために、相互作用スコアの閾値は>0.4に設定され、切断されたノードは非表示にし、その他の設定はデフォルトとして残しました。得られたデータはソフトウェアに取り込まれ、NetworkAnalyzerツールを使ってトポロジカルな特性を評価しノード次数を計算しました。度数順位で上位5ノードが主要なハブターゲットとして特定されました。

コアターゲットの濃縮解析
交差標的はDAVIDデータベース¹⁵ にアップロードされ、遺伝子オントロジー(GO)機能注釈および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路富濃縮解析が行われました。生物の背景はホモ・サピエンスに設定され、濃縮カットオフはデフォルトのDAVIDパラメータに基づいて定義され、EASE閾値<0.1、カウント閾値≥2を含みます。遺伝子の宇宙はDAVIDが提供するデフォルトの全ゲノム背景に基づいていました。ベンジャミニ・ホッホバーグ法を用いて誤検出率(FDR)を制御する複数回の検証を修正し、DAVID結果はこれを基に調整されました。リッチ経路はカウント値の降順で順序付けられました。GOおよびKEGGの濃縮バープロットは、オンラインバイオインフォマティクスプラットフォームを用いて作成されました。

分子ドッキング
YQHXDの主要な能動成分とLDDのコアターゲット間の相互作用を予測するため、本研究では分子ドッキング解析が行われました。ネットワークの位相次数値とターゲット関連性に基づいてランク付けされた上位5つの主要な有効化合物がリガンドとして選ばれ、対応するコアターゲットタンパク質が受容体として使用されました。リガンドSDFファイルはPubChemから取得され、ターゲットタンパク質の三次元構造はProtein Data Bank(PDB)からダウンロードされました。ドッキング解析はCB-Dock2プラットフォーム上で完全自動化のブラインドドッキングプロトコルを用いて実施されました。タンパク質構造をアップロードした後、プラットフォームは自動的に小分子、イオン、水分子などのヘテロ原子を除去し、欠損した原子や水素原子を修復しました。オートブラインドドッキングモードが使用されました。このモードでは、CB-Dock2は曲率ベースの空洞検出アルゴリズムで潜在的なタンパク質-表面結合ポケットを特定し、統合されたAutoDock Vinaエンジン¹⁶を用いてドッキング計算を行います。ドッキング過程では、タンパク質は剛体構造として扱われ、リガンドは柔軟とみなされ、すべてのドッキングパラメータはプラットフォームのデフォルト値に設定されました。ドッキング結果はCB-Dock2¹⁷の組み込みツールを用いた三次元可視化および相互作用解析を行い、結合エネルギーを計算して活性化合物と標的タンパク質間の予測結合親和性を推定しました。

分子動力学シミュレーション
ターゲットタンパク質-リガンド複合体についてはGROMACS 2022.2を用いて分子動力学シミュレーションを実施しました。タンパク質はAmber14SB力場でモデル化され、溶媒系はTIP3P水モデルで表現されました。リガンドの原子電荷はAntechamberで実装されたAM1-BCC法で計算され、その後GAFF2原子型を割り当てました。得られたトポロジーファイルはACPYPEを使ってGROMICS互換フォーマットに変換されました。TIP3P水モデルと整合するイオンパラメータは、Joung-Cheathamパラメータセットに基づいて割り当てられました。開始複合体は、タンパク質表面とボックスの縁の間に少なくとも1.2 nmの隙間を持つ切断された十二面体シミュレーションボックスに配置されました。TIP3P水分子が系を溶かし、Na⁺ およびCl⁻ イオンを導入して系電荷を中和し、イオン強度を0.15 Mに設定しました。最大力が1,000 kJ·mol⁻¹·nm⁻¹を下回るまで、最も急な降下アルゴリズムでエネルギー最小化が行われました。その後、システムはNVTアンサンブルで298 Kと1バールで100 psの平衡状態にされました。平衡後、NPTアンサンブルの下で2 fsの時間ステップで100 nsの生産シミュレーションが実行されました。非結合相互作用はVerletカットオフスキームで処理されました。静電相互作用は粒子メッシュEwald(PME)法を用いて計算され、ファンデルワール相互作用とクーロン相互作用の両方に対して1.2 nmのカットオフが用いられました。水素含有結合はLINCSアルゴリズムで制約されました。温度はノセ・フーバーサーモスタットで、圧力はパリネッロ・ラーマン・バロスタットで制御され、システムは298 K・1バールで維持されました。軌道は10psごとに保存されました。構造動力学および分子間相互作用は、内蔵のGROMACSツール、VMD、PyMOLを用いて解析されました。結合自由エネルギーはgmx_MMPBSAで推定されました。

動物実験

家畜の飼育
3〜8週齢の70頭のオスSprague-Dawley(SD)ラットが、コンピュータ生成の乱数を用いて7つの実験群(n=10)に無作為に割り当てられ、グループ間のベースライン体重に統計的に有意な差がないことを確認しました。すべての動物は、管理された環境(22 ± 1°C、相対湿度55± 10%、12時間の明暗サイクル)で飼育され、自由に食料と水が提供されました。ケージの位置は、環境バイアスを最小限に抑えるためにケージ交換のたびにランダム化されました。順応後1週間の後、モデル群のラットは変性を誘発するために尾側IVD穿刺を受けました。術前にはブピバカインを用いた局所浸潤麻酔を施し、痛みを軽減しました。動物は手術中および術後の回復期間中も綿密にモニタリングされました。術後の観察には回復期間、自発活動の回復、食事と水分の摂取、体重の変化が含まれていました。モデル確立から1週間後、各群から2匹のラットを無作為に選抜し、術後のデジタルX線撮影(DR)画像およびヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色を行いました。X線検査では尾椎IVDの高さが減少し、HE染色では髄質核(NP)脊索細胞の著しい減少と線維環層状構造^の乱れが確認され、モデル確立に成功したことが確認されました。手術から8週間後、ラットはイソフルランの過剰摂取を吸入して安楽死させ、尾部組織と血液サンプルを採取しました。予備検証後、各グループにあらかじめ定められた品質基準を満たす3つの独立したサンプルが最終組織学、ELISA、PCR、ウェスタンブロット解析に用いられました。組織学的切片は単一盲検条件下で評価され、スライドには動物識別番号のみが記載されていました。ELISA、PCR、ウェスタンブロットアッセイでは、サンプルのアリクォートおよび標識付け時にブラインドコーディングが適用され、実験前にすべてのサンプルの検査順序がランダム化されました。吸収度値、_Ct 値、バンド強度などの生データは、実験的なグルーピングやサンプル処理に関与しない統計学者によってグループ識別に解読され、その後統計担当者によって解析されました。すべての統計解析は、実験的グループ分けやサンプル処理に関与していない統計学者によって実施されました。創傷感染、裂傷、出血、重度の倦怠などの有害事象は直ちに記録・評価されました。軽度の症状は強化された支援ケアとともに厳重に監視されました。ラットがベースラインの20%を超える体重減少、鎮痛剤で緩和されない激しい痛み、可動性の喪失、食物や水へのアクセス困難、感染、壊死、その他の重度の術後合併症、呼吸困難、または生命を脅かす状態を示した場合、ヒュームネーム評価を適用しました。そのような場合、動物はイソフルランの過剰摂取を吸い込んで安楽死させられました。

実験的モデリング
ラットは吸入したイソフルランで麻酔され、伏せに置かれました。Co6/7、Co7/8、Co8/9の尾部IVDはX線蛍光誘導下で位置特定されました。21Gの針はIVDの反対側まで垂直に差し込み、その後針先を尾の中央に引き抜きました。もう一本の針が位置の基準として使われました。持続的なIVD変性を誘導するために、針を360度回転させ、30秒間そのままにしてから取り除きました。シャム群では、皮膚と筋肉を貫通した穿刺深さは約2mmで、IVDを損傷することはありませんでした。他のグループでは、針をIVDの中心部に5mm挿入し、血管を避けました。挿入後、針は360°回転させられ、30秒間そのままにされました。刺し傷の部位は消毒され、マーキングされ、滅菌ガーゼで保護されました。モデリングから1週間後、尾椎のX線画像でIVDの高さが減少していることが確認されました。HE染色によりNP脊索細胞の有意な減少と環状ラメラ構造の乱れが示され、モデル確立に成功したことが確認されました。モデル化が成功した後、TCM治療を受けたグループと陽性対照群(PC)群に、ヒトとラットの体表面積比を基に適切な投与量が投与されました。

グループ化と介入
この実験には、生後3〜8週の70頭の雄のSDラットが使用され、7つのグループに分けられました。
(1) 対照群(Ctrl):このグループのラットは実験群と同じ時間かつ同じ条件下でランダムに割り当てられました。彼らはSPFレベルの動物施設の個別ケージに収容され、標準的な食事と飲料水を自由に利用できていました。
(2) シャムグループ:ラットはイソフルランの吸入で麻酔されました。麻酔が確立された後、尾の皮膚はポビドンヨウ素で消毒され、ラットはうつ伏せに置かれました。Co6/7およびCo7/8のIVDはX線蛍光誘導下で位置特定されました。針は皮膚と筋肉を約2mm通り通り、IVDを傷つけることなく進めました。蒸留水(10 mL/kg)は8週間にわたり1日1回ガベージで投与されました。

(3) モデル群:ラットは吸入したイソフルランで麻酔されました。麻酔が確立された後、尾の皮膚はポビドンヨウ素で消毒され、ラットはうつ伏せに置かれました。X線透視誘導のもと、Co6/7、Co7/8、Co8/9のIVDが特定されました。21Gの針を垂直にIVDに差し込み、皮膚の反対側に達し、その後針先を尾の中央に引き抜きました。

2本目の針が位置基準として使われました。針は360°回転させられ、IVDの継続的な変性を誘導するために30秒間保持され、その後取り除かれました。蒸留水(10 mL/kg)を8週間にわたり毎日ガベージで投与し、手術後の回復状況を綿密に監視しました。
(4) PC群:陽性対照群はモデル群と同じモデル化手順を受け、その後、0.5%カルボキシメチルセルロース(CMC-Na)で懸浮液として製製されたセレコキシブ(20 mg/kg/日)の経口ガベージを8週間連続で投与し、体重10 mL/kgのガベージ容積を投与しました。
(5) YQHXD 低用量群 [YQHXD(L)]:モデル群と同様にモデリングが実施されました。ラットは8週間にわたり3.87 g/kg/日のYQHXDをガベージで投与し、ガベージ体積は10 mL/kg、作業濃度は0.387 g/mLでした。
(6) YQHXD 中用量群 [YQHXD(M)]:モデル群と同様にモデリングが実施されました。ラットは8週間にわたりガベージでYQHXDを7.74 g/kg/日投与し、ガベージ体積は10 mL/kg、作動濃度は0.774 g/mLでした。
(7) YQHXD高用量群[YQHXD(H)]:モデル群と同様にモデリングが実施されました。ラットは8週間にわたり15.48 g/kg/日のYQHXDをガベージで投与し、ガベージ容量は10 mL/kg、作動濃度は1.548 g/mLでした。

病理学的変化
ラット尾部IVD組織を外科的に分離し、IVDおよび周囲の筋肉組織に変化が観察されました。収集された組織は病理学的切片に処理され、標本は形態観察のために縦断片で準備されました。尾椎IVDはホルムアルデヒドに96時間固定され、脱石化溶液で急速に脱鈣され、段階アルコールの系列で脱水され、キシレンで浄化されました。パラフィンに埋め込まれた後、5μmのパラフィン断片を準備しました。キシレンによる脱硫化と一連のアルコール勾配による脱水後、切片はヘマトキシリンとエオシンで染色されました。その後、脱水処理を行い、クリアし、装着しました。これらのサンプルは光学顕微鏡で観察され、グループ間の尾椎IVD構造の形態学的変化を調べました。その後、マッソンのトリクロム染色が行われました。切片は、それぞれ3分間、ジクロム酸カリウム溶液とヘマトキシリンで順次染色され、その後酸性エタノールで分化し、最後に10分間ピクロシリウスレッドで染色されました。リン酸で10分間処理した後、切片をトルイジンブルーで5分間染色しました。脱水後、切片はキシレンで洗浄され、マウントされ、顕微鏡で観察して尾椎間盤の変化を調べました。

血清標的タンパク質のELISA検出
手術から8週間後、ラットに吸入したイソフルラン麻酔を投与し、腹部大動脈血を採取しました。末梢血液サンプルは室温で1時間保管し、1,400 × g で10分間遠心分離しました。血清は分離され、使用まで−80°Cで保存されました。血清AKT1、STAT3、Bcl-2のレベルは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で定量化されました。アッセイは製造元のプロトコルに従って実施されました。吸光度は450nmで読み取り、濃度は標準曲線から算出されました。AKT1、STAT3、BCL-2の検出範囲はそれぞれ0.625–40 ng/mL、31.25–1000 pg/mL、0.16–10 ng/mLで、感度は0.1 ng/mL、10 pg/mL、0.1 ng/mLでした。すべての血清サンプルは希釈せずに分析され、すべての結果は対応する標準曲線の範囲内に収まりました。すべてのサンプルと標準物質を重複して分析し、血清体積が等しい状態に基づいて正規化が行われました。

遺伝子発現レベルのPCR検出
ラットの尾椎から椎間板組織を剥離し、各サンプルから約20mgを採取しました。組織は液体窒素で粉砕され、500μLの非酵素溶解バッファーに15分間溶解されました。その後、総RNAを抽出し、その濃度と純度を分光光度計で測定しました。A₂₆₀/A₂₈₀ 値が1.8–2.0のサンプルを解析に受け入れ、RNA濃度を500 ng/μLに調整しました。逆転写は製造元のプロトコルに従って行われました。定量PCR(qPCR)はリアルタイムPCRシステム上で実施され、 Akt1、 Bcl-2、 Stat3 のmRNA発現を測定しました。プライマー配列は 表1に示されています。PCRプログラムは、95°Cで30秒間変性し、その後95°Cで5秒、60°Cで30秒の40サイクルで構成されていました。増幅後に溶融曲線解析を行い、生成物特異性を検証しました。 Gapdh を基準遺伝子として使用し、すべてのサンプルを三重に分析しました。プライマー増幅効率は90%〜110%でした。相対的な遺伝子発現は2^−ΔΔCt 法を用いて計算されました。

ウエスタンブロットによるタンパク質発現レベルの測定
各グループのラット尾椎間板組織から総タンパク質を単離しました。組織はプロテアーゼ阻害剤を補足したRIPAバッファーで溶解されました。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定し、2μg/μLに調整しました。均等量のタンパク質(サンプルあたり15μg)を10%SDS-PAGで分離し、湿式トランスファーシステムを用いて300 mAの定流でポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜に90分間移送しました。その後、膜は室温で5%無脂肪ミルクで1時間ブロックされ、4°CでAKT1(1:5,000)、STAT3(1:6,000)、Bcl-2(1:1,500)、βアクチン(1:4,000)に対する一次抗体とともに一晩インキュベートしました。TBST洗浄後、膜はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合した二次抗体と1:5,000の希釈で室温下で1時間培養されました。タンパク質バンドは増強化学発光試薬(ECL)を用いて検出され、同一露光条件下でゲルイメージングシステムで画像を取得しました。バンド強度はImageJを用いて測定し、相対的なタンパク質発現を決定するためにβアクチンに正規化しました。各実験は独立して3回ずつ行われ、各サンプルは異なる動物から採取されました。

統計
結果は平均±標準偏差(SD)で表されます。グループ間の差異は一方移動分散解析(ANOVA)で評価され、その後、最も有意な差(LSD)を事後検定で評価しました。統計的有意性はP < 0.05と定義されました。

結果

研究から導き出された結論
本研究では、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、分子動態シミュレーション、 生体内 実験を統合し、YQHXDがLDDに対して持つ潜在的な保護効果を調査しました。結果は、YQHXDが少なくとも部分的にAKT1/STAT3/BCL-2シグナル伝達軸の調節を通じて作用し、STAT3の発現が減少し、AKT1およびBcl-2の発現が増加することが特徴であることを示唆しています。組織学的および分子解析により、YQHXD治療はラット尾椎間板穿刺モデルにおける髄核の完全性、線維環構造、細胞外マトリックスの組織の改善と関連していることが示されました。分子動力学シミュレーションは、TNFとテトラニューリンA間の安定した予測相互作用を支持し、潜在的な能動化合物-標的相互作用の構造的証拠を提供しました。これらの発見は、YQHXDが多成分・多標的の調節機構を通じてLDDの進行を遅らせる可能性があることを示唆しています。

ネットワーク薬理学と分...

ディスカッション

伝統的な漢方薬は、抗炎症作用、鎮痛作用、血行促進などの薬理学的効果を発揮することが報告されています¹⁹。過去の研究では、YQHXDの前駆体処方である小水華河煎じが、髄核(NP)吸収とIVD吸収に影響を与えることで、大規模なIVDヘルニアの吸収を促進する^{可能性があると示}唆されています。しかし、その分子メカニズムは依然として明確ではありません。本研究では、ネットワーク薬理学を用いて、LDDにおけるYQHXDの効果に関与する複数の化合物、標的、シグナル伝達経路間の潜在的な相互作用を調査しました^21,22。解析の結果、ケルセチン、テトラニューリンA、(3R)-3-(2-ヒドロキシ-3,4-ジメトキシフェニル)クロマン-7-オール、イソルハムネチン、ジャラノールがYQHXDの優先候補有効成分として特定されました。これまでの研究では、これらの化合物や関連するフラボノイドが...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5% カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)	詳細は不明です		セレコキシブサスペンションのガベージ準備に使われた車両。
21G針	詳細は不明です		尾椎間板穿刺に使用されます。
2×ユニバーサルブルーSYBRグリーンqPCRマスターミックス	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢	G3326	qPCR増幅試薬。
30%アクリルアミド/ビスアクリルアミドゲル溶液(29:1)	ソラビオ株式会社		SDS-PAGE用のゲル調製液;元の材料表には30%/29:1のゲル溶液として記載されています。
3D冷凍研削機	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢		組織均質化や研磨に使用されます。
4×SDS-PAGE濃縮ゲルバッファー(pH 6.8)	ソラビオ株式会社		ウェスタンブロットゲル調製試薬。
酸性エタノール	詳細は不明です		組織学的染色の鑑別に使用されます。
アピープ	ACPYPEプロジェクト		リガンドトポロジーファイルをGROMACS互換フォーマットに変換するために使用されました。
AKT1 ELISAキット	杭州宇平生物科技有限公司	SYP-R1928	血清のAKT1レベル測定に使用;検出範囲 0.625–40 ng/mL。
AM1-BCC電荷法	前室/AMBERツール		配位子の原子電荷計算に使用されます。
アンバー14SBフォースフィールド	琥珀の力場		分子動力学シミュレーションで使用されるタンパク質フォースフィールド。
アンジェリカ・シネンシスの根	建寿薬局、南寧、広西、中国	バッチ番号20250503	YQHXDの植物学的要素;1枚あたり20gです。
無水エタノール	天津奥普盛化工有限公司		組織処理や脱水に使われます。
前室	AMBERツールズ		リガンド電荷計算や原子型付けに使用されます。
抗AKT1抗体	武漢三英有限公司		ウエスタンブロッティングのための一次抗体;希釈1:5,000。
抗Bcl-2抗体	武漢三英有限公司		ウエスタンブロッティングのための一次抗体;希釈1:1,500。
抗STAT3抗体	武漢三英有限公司	10253-2-AP	ウエスタンブロッティングのための一次抗体;希釈1:6,000。
APS試薬	Beyotime/Biyuntian Co.		ウェスタンブロットゲル重合試薬。
アストラガルス・メンブラナセウスの根	建寿薬局、南寧、広西、中国	バッチ番号20250405	YQHXDの植物学的要素;1枚あたり20gです。
オートクレーブ	三洋、日本		滅菌装置。
オートドック・ヴィナエンジン	AutoDock/Vinaプロジェクト		CB-Dock2で使用されているドッキングエンジン。
BCAタンパク質アッセイキット	ソラビオ株式会社		ウェスタンブロッティングの前にタンパク質濃度を測定するために使用されます。
Bcl-2 ELISAキット	武漢ファインバイオテック有限公司	PMK1545	血清Bcl-2の測定に使用;検出範囲 0.16–10 ng/mL。
ブピバカイン	詳細は不明です		局所浸潤麻酔は術前に使用。
CB-Dock2	CB-Dock2ウェブサーバー		自動盲分子ドッキングプラットフォーム。
セレコキシブ	四川新石製薬有限公司	H20233911	ポジティブコントロール薬;ガベージで20 mg/kg/日を投与しました。
チャエノメレス・スペシオサの果実	建寿薬局、南寧、広西、中国	バッチ番号231001	YQHXDの植物学的要素;15gずつです。
サイトスケープ	サイトスケープ・コンソーシアム	バージョン 3.9.0	ネットワーク図の作成と解析に使用されます。
DABクロモジェニック試薬キット(20回)	北京中山金橋バイオテクノロジー有限公司		既存資料表に記載されています。
デイビッド	国立がん研究所	バージョン6.8	注釈、可視化、統合発見のためのデータベース;GOおよびKEGG濃縮解析に使用されます。
脱炭素解	北京中山金橋バイオテクノロジー有限公司		尾椎IVD組織の脱石灰化に使用されます。
脱色シェーカー	劉毅バイオテクノロジー有限公司、北京		実験室のシェイカーだ。
DEPC水	武漢三英有限公司		RNA作業/試薬調製。
デジタルX線画像システム	詳細は不明です		術後のX線モデル検証に使用されます。
蒸留水	詳細は不明です		ビークル/コントロールガヴェージとYQHXD煎熬の準備。
ECL化学発光基板	バイオシャープ社		ウェスタンブロット信号検出試薬。
EDTA抗原回収溶液(pH 8.0)	北京中山金橋バイオテクノロジー有限公司		既存資料表に記載されています。
電気泳動装置	詳細は不明です		SDS-PAG電気泳動に使用されます。
電気泳動バッファー	サービスバイオ社		ウェスタンブロット電気泳動溶液。
FM40製氷機	長流科学機器有限公司、北京		製氷機。
ホルムアルデヒド	詳細は不明です		尾椎IVD組織に使用される固定液。
GAFF2原子の種類	AMBERツールズ		分子動力学シミュレーションに用いられるリガンド原子の種類。
ゲルイメージングシステム	天能科学、上海		ウェスタンブロット画像の撮影に使用されました。
GeneCards(遺伝子カード)	ワイツマン科学研究所	バージョン5.26	疾患関連標的を取得するために使われるヒト遺伝子データベース。
gmx_MMPBSA	gmx_MMPBSAプロジェクト		MM-PBSA結合自由エネルギー推定に該当する場合に使用されます。
GraphPad プリズム	GraphPadソフトウェア	バージョン8.0	著者の以前の原稿版に記載されている統計/グラフソフトウェア。
研磨ビーズ	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢		組織のすすり替えや均質化に使われます。
グロマックス	GROMACS開発チーム	バージョン 2022.2	分子動力学シミュレーションに使用されます。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色試薬	詳細は不明です		尾椎IVD切片のHE染色に使用されます。
高速遠心分離機	エッペンドルフ、ドイツ		実験室用遠心分離機。
高速低温組織グラインダー	Servicebio、中国		低温組織研削に使用されます。
水平シェーカー	チリンベル社		実験室のシェイカーだ。
HRP標識ヤギ抗ウサギ抗体	サービスバイオ社		ウェスタンブロッティングのための二次抗体;希釈1:5,000。
HyperScript III qPCR用RTスーパーミックス(gDNA除去剤付き)	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢		逆転写試薬は既存材料表に記載されています。
製氷機	シマグ、中国		製氷機。
イメージJ	国立衛生研究所		ウェスタンブロットバンド強度の定量化に使用されます。
逆形生物顕微鏡	オリンパス、日本		染色切片の顕微鏡に使用されます。
イソフルラン	詳細は不明です		吸入麻酔薬/安楽死剤。
イソプロパノール試薬	中国国家製薬集団化学試薬有限公司		RNA抽出試薬。
Joung-Cheathamイオンパラメータ	該当しません		分子動力学シミュレーションに使用されるイオンパラメータセット。
リグスティクム・チュアンション根茎	建寿薬局、南寧、広西、中国	バッチ番号20250301	YQHXDの植物学的要素;15gずつです。
液体窒素	詳細は不明です		RNA抽出前の組織研磨に使用されます。
低速遠心分離機	エッペンドルフ、ドイツ		血清分離やその他の低速遠心分離工程に使用されます。
マッソンのトリクロム染色液	詳細は不明です		尾椎間盤切片のマッソン染色に使用されます。
マイクロプレートリーダー(TECAN)	テカン、スイス		450 nmの吸収測定に使用され、既存材料表に記載されています。
マイクロプレートリーダー(サーモフィッシャーサイエンティフィック)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ		多機能マイクロプレートリーダーは既存の材料表に記載されています。
Microsoft Excel/スプレッドシートソフトウェア	マイクロソフト		重複したターゲットエントリの削除や表形式データの管理に使用されました。
NanoDrop 2000分光光度計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ		RNA濃度と純度を測定するために使用されました。
非酵素性溶解バッファー	詳細は不明です		RNA抽出前の組織溶解に使われます。
オミム	ジョンズ・ホプキンス大学医学部		オンラインメンデル遺伝における人間の遺伝;病気に関連する標的を回収するために用いられます。
オンラインバイオインフォマティクスプロットプラットフォーム	詳細は不明です		GOやKEGGバープロットを生成するために使われました。
PAGEゲル重合剤	ソラビオ株式会社		ウェスタンブロットゲル調製試薬。
パラフィン	詳細は不明です		組織学的切片のための埋め込み培地。
Akt1、Bcl-2、Stat3、GapdhのPCRプライマー	武漢サービスバイオテクノロジー株式会社		プライマー配列は表1に記載されています。
PDB	RCSB PDB		プロテインデータバンク;標的タンパク質の3次元構造を得るために用いられます。
リン酸化/プロテアーゼ阻害剤	サービスバイオ社		タンパク質抽出のためにRIPA溶解バッファーに加えます。
リントングスチ酸	詳細は不明です		マッソン染色に使われます。
ピクロシリウス・レッド	詳細は不明です		マッソン染色に使われます。
ポリビニリデンジフッ化物膜(0.45 & mu;m)	サービスバイオ社		ウェスタンブロット移送に使用されたPVDF膜。
ポジティブコントロール薬物載体	詳細は不明です		セレコキシブには0.5%のCMC-Naサスペンション車両。
ポビドンヨード	詳細は不明です		外科的部位の消毒に使用されます。
タンパク質マーカー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ		ウェスタンブロッティングの分子量マーカー。
タンパク質輸送装置	バイオ・ラッド、アメリカ		ウェスタンブロッティング用のウェットトランスファー装置。
タンパク質トランスファーモジュール(ウェットトランスファー)	バイオ・ラッド、アメリカ		ウェスタンブロットウェット転送モジュール。
パブケム	国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)		複合構造のSMILES/SDFファイルを取得するために使用されます。
純水調製システム	上海の楽風バイオテクノロジー有限公司		純水の調合に使われます。
PyMOL	シュルドゥムル;ディンガー合同会社		分子動力学やドッキング出力の可視化および解析に使用されます。
qPCRリアルタイムPCRシステム	応用バイオシステムズQuantStudio、アメリカ		定量的PCR増幅に使用されます。
RIPA組織/細胞溶解バッファー	ソラビオ株式会社		完全なタンパク質抽出に使われます。
RNA溶解溶液	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢		RNA処理試薬。
ロータリーエバポレーター	詳細は不明です		低圧下で結合されたYQHXDろ過液を濃縮するために使用されます。
シナピス・アルバの成熟種子	建寿薬局、南寧、広西、中国	バッチ番号20240801	YQHXDの植物学的要素;1度10gです。
スプラグ・ドーリーネズミ	上海スラック実験動物有限公司	SCXK(上海)2022-0004	3歳のオスラットが70匹、8週間、尾椎間板穿刺モデルに使用。
SPSS	IBM、アメリカ	バージョン21.0	著者の以前の原稿版に記載された統計ソフトウェア。
STAT3 ELISAキット	杭州宇平生物科技有限公司	SYP-R1555	血清STAT3レベルの測定に使用;検出範囲31.25とNDASH;1000 pg/mL。
ステファニア・テトランドラの根	建寿薬局、南寧、広西、中国	バッチ番号230301	YQHXDの植物学的要素;1錠あたり6gです。
滅菌ガーゼ	詳細は不明です		モデリング後に刺し穴を保護するために使われました。
ストリング	STRINGコンソーシアム	バージョン12.0	タンパク質間相互作用ネットワークプラットフォーム。
qPCR用SweScriptオールインワンRTスーパーミックス	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢	G3337	逆転写試薬は既存材料表に記載されています。
スイスターゲット予測	SIBスイスバイオインフォマティクス研究所		化合物の潜在的な標的を予測するために用いられます。
TBSTバッファ	詳細は不明です		ウェスタンブロッティング時の膜洗浄に使用されます。
TCMSP	ノースウエストA&生命科学部バイオインフォマティクスセンターF大学	バージョン2.3	伝統中医学システム薬理学データベース;中国漢方化合物の有効成分を得るために使われます。
TIP3P水モデル	該当しません		分子動力学シミュレーションで使用される水モデル。
トルイジンブルー	詳細は不明です		マッソン染色に使われます。
転送バッファ	サービスバイオ社		ウェスタンブロット転移バッファー。
TriQuick試薬	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢		RNA抽出試薬。
トリゾル試薬	詳細は不明です		論文に記載されている総RNA抽出試薬。
TTD	香港中文大学(IDRBLab)		治療用ターゲットデータベース;病気に関連する標的を回収するために用いられます。
ヴェニー	バイオインフォGP、CNB-CSIC	バージョン 2.1.0	YQHXDとLDDの重複するターゲットを特定するために使用されました。
ヴェルレットカットオフスキーム	グロマックス		分子動力学シミュレーションで使用される非結合相互作用スキーム。
垂直電気泳動装置	バイオ・ラッド、アメリカ		SDS-PAGEに使用されます。
VMD	イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校		分子動力学出力の可視化および解析に使用されます。
ウェットトランスファーシステム	バイオ・ラッド、アメリカ		ウェスタンブロッティングにおけるタンパク質移動に使用されます。
X線透視システム	詳細は不明です		穿刺モデリング中の尾椎間盤滴(IVD)レベルを特定するために使用されました。
キシレン	詳細は不明です		組織学での脱脂・除去に使用されます。
&β;アクチン一次抗体	武漢三英有限公司		西洋ブロッティングのためのローディングコントロール一次抗体;希釈1:4,000。