中空繊維灌流バイオリアクターにおける高密度3D細胞培養からの細胞外小胞の大規模生産

サマリー

MSCやその他の細胞タイプから細胞外小胞を産生するための3D灌流中空ファイバーバイオリアクターの設置と使用方法の説明が提供されています。このプロトコルは、中空繊維バイオリアクター内で細胞密度を制御しながら、高濃度で連続的に細胞外小胞を生成する方法を説明しています。

要約

エクソソーム研究の進展は、従来の2次元細胞培養における細胞数の少なさと分泌されるエクソソームの生産性の低さによって妨げられています。中空繊維バイオリアクター(HFBR)での高密度細胞培養は、多数の細胞から高濃度で3D培養中に分泌された生体分子および細胞外小胞(EV)を長期間にわたり連続的に生産することを可能にします。このプロトコルは、最適な細胞量を維持しつつ、高密度細胞増殖を市販のHFBRで数週間から数か月にわたって持続的に生産する3D灌流培養条件を用いながら、濃縮分泌エクソソームの収集を記述します。システムはコンパクトで密閉型、使い捨て、cGMP準拠、使い方が簡単、標準的な^CO2インキュベーターにも収まります。間葉幹細胞(MSC)やヒト羊水幹細胞(HAFSC)など、これらの条件下で増殖が減少し、時間をかけて分化や表現型に影響を与える可能性があります。代表的な結果は、数週間以上連続生産しても典型的なEVの収量と細胞の生存率を示しています。この方法は、研究および臨床応用の両方に適した再現性が高く高品質なEV収穫を提供します。

概要

細胞外小胞は、細胞間コミュニケーションや治療的応用、特に再生医療においての役割がますます認識されています。従来の2次元細胞培養法は労働集約的で収量も限られており、実験や^{動物実験のために}十分なEVを得るために数百個の培養フラスコを必要とすることもあります^1,2。 臨床翻訳のスケールアップは一般的に、マイクロキャリアやその他の支持体を用いた従来の攪拌バイオリアクターを利用します。これらのシステムは本質的に生理学的ではなく、非効率的で、結果もばらつきがあります。中空繊維バイオリアクターは、高密度細胞培養をコンパクトなフットプリント内で支える三次元的な灌流ベースの環境を提供します。^臨床応用に適した規模で^3,4。

HFBRはコンパクトで高密度の細胞培養システムを提供し、従来の2次^元培養5に比べて労働・時間・スペースを削減し、集中したEVの連続生産を可能にします。 これらはコンパクトな空間での高密度細胞培養を可能にし、あらゆる実験室での大規模なEV生産をサポートします。HFBRは、標準的な_CO2インキュベーターで、1X10⁹から1×10¹⁰の細胞を少量(20–60 mL)で大量に培養し、専用機器を必要としません。これらのシステムは、数週間から数か月にわたる連続的かつ濃縮したEV収穫を可能にしつつ、還元血清や化学的に定義された培地の使用を容易にします。HFBRでは、細胞は分子量カットオフ(MWCO)の半透性中空繊維膜によって再循環培地から分離された余毛細血管空間(ECS)の小さな体積に保持されます(図1)。グルコースや乳酸などの小分子は繊維を容易に通過でき、抗体や細胞外小胞のような大きな元素はECSに保持・濃縮され、そこで採取されます。

中空繊維細胞培養を他の方法と区別する基本的な特徴は3つあります。1) 高い表面積対体積比(200 cm²/mL)により、生体内で1〜2個×、10個⁸細胞/mLの密度が可能となります。2) 細胞は非多孔質のプラスチック皿ではなく、多孔質の支持体に結合されています。細胞分割は必須ではありません^。3.繊維の分子量カットオフ(MWCO)は制御可能です。分泌生成物はカートリッジのECS内で2次元フラスコ培養に比べて10〜100倍保持・濃縮されます。また、フィブロネクチンやコラーゲンなどの特定のタンパク質マトリックスを繊維表面に容易に塗布し、繊維間のフラックスに影響を与えません。

HFBRは2次^元培養6よりもin vivoに近い3Dパーフュージョンベースの培養環境を提供し、細胞の血清支持依存を独自に減らし、培地の必要性を簡素化します。この高密度培養環境は、2次元培養と比較したタンパク質処理の違いを支持している可能性があり、報告されたEVバイオアクティブ^7,8,9の強化も報告されています。 中空ファイバーバイオリアクターは「ヒストセントリック」です。彼らはin vivo細胞生理学¹⁰の組織様特性を模倣しようと試みています。組織中心型バイオリアクターの2つの重要な特徴は、1) 細胞密度が高く、細胞が独自の微小環境を生成できること、2) 細胞の分裂や通過が不要で、細胞間の相互作用や球状体のような3次元構造が有機的に発達できる点です。この方法は、従来の2次元培養システムでは達成が困難な細胞密度を実現し、簡略化され、タンパク質を含まない化学的に定義された培地の使用を可能にします。

フラスコで培養可能な細胞種は、中空繊維バイオリアクターで培養可能です。形質転換された細胞株は増殖します¹¹。監視すべき重要なパラメータはグルコースの取り込み率です。血糖モニタリングは代謝活動を直接測定し、収穫タイミングの最適化や細胞密度の制御^{を可能にします。}カートリッジ内のセル質量を制御し、グルコースの取り込み速度が酸素供給と^CO2除去能力を超えないようにすることが重要です。これは収穫時に細胞の塊を単純に除去することで行われます。MSCおよびHAFSCは中空ファイバーバイオリアクター内で増殖せず、静止状態を保ちます。これらの細胞はバイオリアクターでシードされる前に膨張が必要です。しかし、培養が確立されると、EVは数週間から数ヶ月にわたって連続的に収穫が可能です。MSCの表現型は培養後30日間で変化しませんが、CD105の発現はこの期間で減少するかもしれません。その後、バイオリアクターからのMSCを血清含有培地とともにフラスコにプレートすると、CD105の発現は初期レベル¹³に戻りました。 CD105の発現は2次元vs. 3D培養のマーカーとして機能する可能性があります。また、過渡的トランスフェクション技術は準安定トランスフェクタント¹⁴の作製にも用いられます。

より生体内での細胞培養条件と3次元中空繊維細胞培養の利点の例としては、時間経過による完全かつ均一な翻訳後修飾^15,16、胃上皮による絨毛形成(クリプトスポリジウム培養¹⁷)、3D肝¹⁸、3D血液脳関門モデル¹⁹、胞子体形成²⁰、骨髄と幹細胞の共培養²¹が含まれます。

HFBRでは、EVは非常に濃縮されており、細胞溶解が制限されているため、細胞内タンパク質や膜断片からの汚染が少なくなります。中空ファイバーバイオリアクターは、繊維間を交差しない高分子量成分がなければ、どんな媒体にも適合します。必要に応じて、これらの大きな分子を直接バイオリアクターのECSに加えることも可能です。DMEMなどの高グルコース培地が好まれます。より単純なタンパク質を含まない細胞培養培地は、タンパク質負荷を減らし、精製を簡素化できます。間葉幹細胞およびヒト羊水幹細胞は、標準的な基礎培地およびFBS培地、さらに市販のMSC培地製剤で培養されています。HFBRは市販のカートリッジを使ってグラム単位のエクソソームを生産できます。中空ファイバーバイオリアクターは、潜在的なcGMP条件下でエクソソームを大規模生産するための有用な手法であり、エクソソーム研究と臨床翻訳の両面でパラダイムシフトを示しています。

中空ファイバーバイオリアクターによる細胞外小胞生成の成功例は非常にプロトコル特異的です。バイオリアクターの操作、細胞シーディング密度、収穫頻度、使用される培地などが、成功したバイオリアクター稼働に寄与します。このプロトコルは、高密度細胞培養から細胞外小胞を生産・収集するために中空ファイバーバイオリアクターを使用する標準化された方法を説明しています。目標は、システム設定、細胞接種、培養維持、収穫手順に関するガイダンスを含む、EV収穫の再現可能なアプローチを提供することです。この手法は、研究用途のための一貫したEV産生を支援し、異なる細胞タイプや実験目的に適応可能な枠組みを提供することを目的としています。

プロトコル

すべての手技は標準的な良好な検査室規範(GLP)および良好な細胞・組織培養実践ガイドラインに準拠しています。

注意:カートリッジはあらかじめ組み立てられ、ガンマ滅菌されています。二重袋で、各接続部にルーアキャップが付いているため完全に密閉されており、袋の外でも無菌状態を保ちます。カートリッジポートの識別については図2を参照してください。すべての工程は室温の層流フード内で行われました。

1. リザーバーキャップの準備および滅菌。

1. 二重袋のカートリッジから2本の短いチューブを外します。
2. チューブをリザーバーキャップのステンレス製チューブのホースバーブに取り付けます。
3. オートクレーブ後も無菌性を保つために、短いチューブと露出したステンレス製チューブの端をアルミホイルで包みます。組み立てた部品をオートクレーブバッグに入れます。
4. 121°Cの乾燥サイクルで15〜30分間オートクレーブ処理。使用前にキャップを室温まで冷ましてください。

2. 中空ファイバーカートリッジをリザーバーボトルに取り付ける

1. 後で使用するために、1Lのボトルから50mLのPBSを50mLの円錐形チューブに移します。
2. オートクレーブバッグからリザーバーキャップを取り除き、長い鋼管の保護箔を外します。
3. PBSボトルのキャップを外し、リザーバーキャップをその位置にねじ込みます。内側の滅菌袋からカートリッジを取り出してください。
4. リザーバーキャップの上部にあるチューブの一部からアルミホイルを外してください。
5. 長いカートリッジチューブの一つからルーアーキャップを取り外し、リザーバーキャップのリザーバーチューブに取り付けます。少しバックスピンを使ってキンキングを防ぎましょう。
6. 2つ目のチューブ接続でも同じことを繰り返します。
7. 茶色いポンプのチューブを優しく絞ってPBSをシステム内に流し、すべての気泡が除去されるまで続けます。

3. 余分な毛細血管空間(ECS)の充填

1. 長さ少なくとも1.5インチの太い針を使って滅菌注射器に20 mLのPBSを抽出します。安全のため、鈍い針が好まれます。
2. 両側のルアー継手をアルコールで消毒し、乾燥させます。
3. PBS入りの注射器は片側のポートに、空の滅菌シリンジを反対側のポートに取り付けます。両端のポートを閉じて、両側のポートを開けてください。
4. 気泡を最小限に抑えるために、カートリッジをわずかな角度で持ちながら、ゆっくりとPBSをECSに注入してください。反対側のポートにある空の注射器は空気で満たされます。
5. ECS内に空気がある場合は、右端のポートを開けて液体を空の注射器に引き込み、ECSが液体で満たされるまで続けます(これによりPBSはリザーバーボトルから繊維を通ってECSに引き込まれます)。
6. 両側のサイドポートスライドクランプを閉じ、両端のポートスライドクランプを開け、指でポンプチューブを優しく圧迫して流量を確認してください。
7. 空の注射器は側面のポートに取り付けたままキャップとして使います。ラミナーフローフードから出るたびに注射器を新しいものに交換してください。

4. 繊維のコーティングと細胞接種

注:繊維に特定のマトリックスタンパク質をコーティングする手順と細胞接種の手順は本質的に同じです。余剰液体は繊維を通ってリザーバーに流れ込み、セルやコーティング材料はECS内で繊維の外側に残ります。種まきには1×10〜⁸ セルが推奨されます。4,000 cm² HFBRには、20 mLのPBS中に100〜500 μgのマトリックスタンパク質を推奨します。繊維表面に結合したマトリックスタンパク質はMWCOに影響を与えません

1. 無菌の50 mL円錐形チューブ内にコーティング液または細胞懸濁液を準備します。フラスコ拡張から100〜500μgのマトリックスタンパク質をPBSで調理培地に1×108細胞。容量20mL。
2. 20mLの細胞またはコーティング液を、大型の針を使って滅菌注射器に抽出します。
3. 溶液入りの注射器を片側のポートに、空の滅菌用注射器をもう片方のポートに取り付けます。
4. 両端のポートを閉じて、両側のポートを開けてください。
5. 液体を2つの注射器間で移して優しく混ざり合います。各注射器に溶液の半分を残します。両側のポートを閉鎖しろ。
6. 右端のポートを開けて、リザーバーキャップを1/4回転緩めてください。
7. 1本の注射器からECSに溶液を注入します。接続されたサイドポートを閉じてください。
8. もう一方の注射器から溶液を注入してください。接続されたサイドポートを閉じてください。両端のポートを開けてください。
9. 細胞に接種する場合は、カートリッジを室温で30分間水平に置き、その後長軸に沿って180°回転させてさらに30分間放置します。
   1. 繊維にマトリックスタンパク質をコーティングする場合は、室温で一晩放置してください。
10. カートリッジをデュエットポンプシステムに入れ、25度から流量を開始します。

5. 収穫準備 ( 図2参照)

1. 空の滅菌シリンジを右側のポートに3ウェイストップコックと滅菌フィルターを取り付けます。
2. 3ウェイストップコックを設定して、滅菌フィルターを通して排気できるようにしてください。左側ポートに空の滅菌注射器をもう一つ取り付けます。

6. 調整培地の収集(収穫)

1. 右側のポートを開けて、フィルターを通して無菌の排気を維持してください。
2. カートリッジの右端を上に傾け、調整された培地(製品)を左の注射器に引き抜きます。ECSの内容物を完全に左の注射器に排出します。
3. 右側ポートを閉めろ。左側のポートを閉じ、注射器を外して、収穫したものを50mLの円錐形チューブに集めます。
4. 左側のポートの注射器を交換してください。左側のポートを開けろ。右端のポートを開けてください。
   リザーバーキャップを1/4回転ほど外します。
5. カートリッジの左端を上に傾け、左側ポートに接続された注射器でECSを抜き取ります。液体半月板が側面ポートのチューブの中央に入るまでECSを完全に満たします。
6. 右端のポートを閉じて。右側のポートを開けて、3ウェイストップコックをフィルターを通して排気するように設定してください。
7. 左側のポートを開けろ。カートリッジを右に傾け、ECSを完全に左の注射器に排出します。
8. 左側のポートを閉めろ。注射器を外し、採取したECSを50mLの円錐形チューブに集めます。
9. 注射器を左側のポートに差し替えます。右側ポートを閉めろ。右端のポートを開けろ
10. カートリッジの左側を上に傾け、左の注射器で引き抜いてECSを満たします。液体半月板が側面ポートのチューブの中央に入るまでECSを完全に満たします。
11. 左側のポートを閉めろ。左端のポートを開けてください。リザーバーキャップを締めてください。
12. カートリッジをデュエットポンプに戻す前に、手動でポンプのチューブを圧縮してシステムの流れを確認してください。

7. バイオリアクターをポンプシステムに挿入します。

1. コントロールボックスでポンプ流量を25に設定してください。ポンプが稼働している間にカートリッジの取り付けが簡単です。
2. フローパススタンドの右端をつかみます。ポンプのチューブをポンプのチューブに滑り込ませてください。
3. 流れ経路の底をポンプベースのスロットに滑り込ませます。長方形レジスターがフローパススタンドの切り欠きにぴったり合うようにしてください。
4. ポンプベースの側面のくぼみにリザーバーボトルを置きます。
5. 電源用の細いコードはインキュベーターのガスケットの間に収まります。コントロールボックスにはインキュベーターの側面に取り付けるための磁石が付いています。

8. 血糖値のモニタリング

1. 1 mLのピペットを使い、リザーバーボトルから1 mLの培地サンプルを採取します。
2. 対応するグルコースメーターを使って、サンプルした培地を少量の液滴をメーターのテストストリップに置いてグルコース濃度を測定します。

9. グルコース取り込み率の計算

注:グルコース取り込み率は、初期血糖値から24時間後の血糖値を差し引いて計算されます。速度は貯留層の容量に依存するため、グルコース濃度の低下にリットル単位の貯留槽容量を掛け合わせます。例えば、リザーバーボトルに250 mLがある場合、0.25(25%)を掛けます。(グルコース1-グルコース2)X(リザーバーボトルのリットル単位)。250 mLは0.25 Lです。1日以上経過した場合は、これを日数で割ります。例えば:開始血糖値4.5 g/L;24時間後に血糖値を測定:2.7 g/L;貯蔵タンク:250 mL。4.5-2.7=1.8 g。1.8X.25(リザーバーボトルは0.25 L)、0.45 gのグルコース摂取。グルコースの取り込み率は1日あたり450mgです。

10. 実現可能性チェック

1. 収穫プロトコルを使って少量の細胞サンプルを採取してください。
2. 細胞をT 25培養フラスコに新鮮な10%血清含有培地をプレートします。視覚的にアタッチメントと生存可能性を評価してください。

11. カートリッジの日々のメンテナンスと培養の最初の週。

注:培養の最初の1週間で、増殖細胞は目標の1〜2グラムのグルコース摂取量まで拡大します。

1. 0日目:細胞に接種し、培地製剤からグルコースの開始濃度を決定します。開始貯留槽容量:125 mL。
2. 1〜2日目:毎日血糖値を測定します。開始グルコースが50%減少したら、125 mLのリザーバーを250 mLの新鮮培地に置き換え、血清を7.5%に減らします。
3. 3〜4日目:血糖値を測定します。開始グルコースが50%減少したら、250 mLのリザーバーを500 mLの新鮮培地に置き換え、血清を5%に減らします。
4. 4〜5日目:血糖値を測定します。開始血糖値が50%減少したら、500mLを1Lの新鮮培地に置き換えます。血清を2.5%に減らし、必要に応じて化学的に定義された培地に切り替えてください。
5. 6日目+:血糖値を測定し、ECSを採取。細胞密度をコントロールするために、1日あたり1〜2グラムのグルコース取り込みを抑えます。
6. 増殖性のない細胞の場合は、まずリザーバーボトルに125mLを使い、培地を3日ごとに交換してください。
7. もしグルコース摂取量が多い場合は、リザーバーを250 mLに増やしてください。3〜4日目にECSから血清を除去し、基礎培地に置き換えます。

結果

このプロトコルに従い、増殖する細胞株をシードした4,000 cm² カートリッジは通常、1日あたり1〜2gのグルコースを消費します。これは、DMEMのような高グルコース培地を使用する場合、2〜3日に1リットルのミディウムを摂取することになります。細胞は種子授莢後1週間以内に最大密度に達します。収穫は5〜7日後、またはグルコース取り込み率が1日1gに達した時点で開始し、可能であれば毎日行うべきです。培養の最初の1週間の間に、ECS内の血清含有培地を血清を含まない基礎培地に置き換え、必要に応じて血清を循環培地に保持することも可能です。グルコースの取り込み率が1日あたり1gに達したら、軽薄血清培地や他の化学的に定義された培地に簡単に切り替えることができます。MSCやHAFSCは、CHO、293、ハイブリドーマなどの形質転換細胞株よりもはるかに低い速度でグルコースを消費します。球状体の形成はMSCおよびHAFSCおよび他の細胞タイプに典型的です(図3)。日々の血糖モニタリングは、培養の健康状態と代謝活動を信頼できる指標として提供します。MSCおよびHAFSCでは、標準的で市販されているゼノフリーメディアが成功裏に使用されています。収穫量は約20 mLです。収穫間隔は最適であり、EV濃度は24時間後に最大に達するためです(図4)。収穫された培地中の典型的なエクソソーム濃度は、細胞タイプ、シード数、その他の要因によって1〜5×^{10 12} particle/mLの範囲であり、遠心分離後に目に見えるペレットが現れることもあります(図5)。大量の細胞をシードすることができ、培養面積ではなく細胞数に基づいて行うべきです(図6)。

結果は、EVの生産がグルコース消費で測定される代謝活動と相関していることを示し、培養性能の監視と最適化のための実用的なパラメータを提供します。24時間間隔で毎日収穫することで、エステート集中度を最大化しつつ培養の安定性を保つことができます。これらの発見は、中空繊維バイオリアクターにおける再現可能なEV生産の重要なパラメータとして、グルコースモニタリングと収穫頻度の制御を支持しています。

図1: 中空ファイバーバイオリアクターの断面図。培地は繊維の内部を流れ、細胞は繊維の外側に付着します。グルコースや乳酸などの小分子量成分は繊維間を簡単に通過できます。分泌物、例えばEVは線維を通過できず、線維の外側にあるECS(毛細血管外空間)に高濃度になります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2: ポートとクランプが特定されたカートリッジの写真。流れ経路上の一方通行逆止弁は、媒体の再循環流を生み出します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3: 間葉幹細胞、ヒト羊水幹細胞、心臓前駆細胞、その他いくつかの細胞タイプは、十分な数でカートリッジにシードされると球状体を形成します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4: 異なる時間間隔の収穫後のEV濃度の測定。24時間後、EV濃度は最大濃度に達します。最適な収穫は24時間後です。(データはロサンゼルス小児病院EVコア、パオロ・ネヴィアーニ提供) この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5: C2011中空ファイバーバイオリアクターで培養されたDIFI細胞から1週間分のEV収穫。EVは差分遠心分離によって分離されます。(データ提供:ジェフ・フランクリン、ヴァンダービルト大学)^18、19。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6: 中空ファイバーバイオリアクターに驚くほど多くの細胞をシードできます。MSCは2次元文化において多くの領域を占めています。3D培養で球状体として育てると、占有するスペースが小さくなります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

中空繊維バイオリアクターは、真の商業的な量でタンパク質や抗体を製造することが合理的ではありません。しかし、比較的多数の細胞を高密度で培養し、臨床的に重要なスケールで濃縮EV産物を分泌するという独自の能力を持っています。組織中心型バイオリアクターの真の利点が認識されたのは、ここ数年になってからです。高密度の灌流培養条件により、cGMP準拠培地を用いた濃縮EVが研究や臨床応用に適した量が得られます。4,000 cm^²からの単回収穫は、10〜20 mLの体積に5 ×^{10 12} 〜 1 × 10¹⁴ EVを含むことがあります。これらの収量はEV投与評価の研究で報告された範囲内^です。

グルコース取り込み率の日々のモニタリングは培養性能を評価する重要なパラメータであり、細胞代謝、細胞数、健康状態の直接的な指標です。一般的には、DMEMのような初期グルコース濃度4.5 g/Lの高グルコース培地が好まれます。グルコースが50%消費されたら、培地はフレッシュ培地に交換してください。MSCのような特定の細胞は、3 g/L以上のグルコース濃度でグルコースを消費し乳酸を産生し、その後3 g/L以下の濃度でグルタミンを摂取しアンモニアを生成するように見えます。3D培養におけるMSCの完全な代謝プロファイリングはまだ行われていません。

成功するバイオリアクター培養において最も重要なパラメータは細胞接種数です。4,000 cm 2011年バイオリアクターの最小接種セル数は1×10⁸細胞です。MSCやHAFSCのような非増殖細胞では、1×^10.9個の細胞が望ましいです。リザーバー容量はカートリッジ内のセル数に比例するべきです。1×10個の⁸セルは125ml以下のリザーバーを使用しなければなりません。1×10個^の9セルは1リットル以下のリザーバーを持つべきです。リザーバーが大きすぎると細胞がラグフェーズに入ってしまうことがあります。これは、トリパンブルー染色で生存可能と判定されているにもかかわらず、細胞がグルコースを消費しないことが特徴です。この場合、リザーバーの容量を減らすか、より多くの細胞をシードします。効果的なバイオリアクター培養に必要な細胞数を得るために、複数回の細胞接種が必要になる場合があります。カートリッジ内の既存のセルの上にさらにシードを付けるだけです。バイオリアクターの性能を評価する際には、細胞接種量に注目してください。細胞シーディングを10倍に増やすことで、EV生産量は10倍増加します。

プロトコルの変更には、細胞の種類や望む収量に応じて、培地の配合、表面コーティング、セル数、収穫量、収穫頻度、注射器のサイズの変更が含まれることがあります。継続培養により、培養中に変化を加え、結果をリアルタイムで得られるため、容易かつリアルタイムの条件最適化^{が可能です。}トラブルシューティングは無菌の維持と代謝活動のモニタリングに焦点を当てるべきです。特にスライドクランプ周辺のチューブに詰まりや曲がりがないか確認してください。細菌による汚染は、急速なグルコース摂取と貯蔵タンク内の濁りを引き起こします。菌類汚染は、カートリッジの左側キャップにふわふわした白い蓄積物ができ、流れを遮ることで示されます。中空ファイバーバイオリアクターシステムの使用には、熟練した取り扱いと厳格なプロトコルの遵守が必要です。重要なステップには、適切な細胞数のシード、収穫時の不稔維持、過剰増殖や栄養素の枯渇を防ぐためのグルコース摂取の注意深いモニタリングが含まれます。ほとんどの細胞は繊維に付着し、フィブロネクチン被覆されたタンパク質マトリックスに依存しているため、迅速な細胞結合が可能となります。MSCs、HAFSC、心臓前駆細胞など一部の細胞は線維に付着し、3D球状体を形成します。

HFBRシステムは、ほとんどの細胞タイプの高密度、化学的に定義された、ゼロゼロの培養をサポートし、大規模なEV^{生産を促進し}ます。日々の血糖モニタリングはバイオリアクターの性能を信頼できる指標として提供します。密閉型の灌流方式システムはcGMP規格に対応しており、より大きなカートリッジや複数のカートリッジを組み合わせてスケールアップが可能です。最適化された条件下でグラム規模のEV生産が可能かもしれません。中空ファイバーバイオリアクターは、制御された条件下で持続的なEV生産と回収のための再現可能なプラットフォームを提供します。ここで述べたプロトコルは、システムの設定、無菌取り扱い、代謝モニタリングなど、実用的な考慮点を強調し、一貫した運用と信頼性の高い結果をサポートします。異なる培養条件下でのEV特性や機能特性の評価、代替生産システムとの性能比較のためにさらなる研究が必要になるかもしれません。

この方法は、再生医療や治療応用を含む研究や臨床EV生産に広く応用可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16ゲージ1.5インチ針	Stellar Scientific	SOLM-111615
3方向ストップコック、滅菌済み	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mLルアーロックシリンジ	Becton Dickenson	302830
25mL血清学的ピペット、滅菌済み	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mmシリンジフィルター、滅菌済み	Thomas Scientific	1162B74
38mmリザーバーキャップ	FiberCell Systems	A1006
50mLコニカル遠心チューブ	Stellar Scientific	T50-101-PK
500mLデュルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS滅菌アルコールプレップパッド、480個入り	CVS Pharmacy	商品番号376560
中空ファイバーバイオリアクター	FiberCell Systems	C2011
ヒトフィブロネクチン、1mg	Corning	354008